姜廣宇,董　航,顧志成,李洪濱,張世華,史　濤

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

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自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血大鼠腦水腫與水通道蛋白-9的表達(dá)①

姜廣宇,董航,顧志成,李洪濱,張世華,史濤

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

摘要:目的：旨在探討自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血大鼠模型中，神經(jīng)組織內(nèi)水通道蛋白9(AQP9)表達(dá)變化，了解自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血這一病理生理過程中AQP9與腦水腫的變化，并試圖揭示出其相關(guān)性。方法：健康成年雄性大鼠60只,隨機(jī)分為假手術(shù)組、SAH組,建立大鼠自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血模型。分別建模后24h、48h及72h斷頭、取腦，測腦含水量，并利用RT-PCR技術(shù)檢測大鼠腦組織在自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血后AQP9的表達(dá)。結(jié)果：大鼠自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血后，腦含水量增高，AQP9呈現(xiàn)高表達(dá)，且于72h內(nèi)逐漸遞增，明顯高于對照組(P<0.05)。結(jié)論：自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血后AQP9高表達(dá)和腦水腫呈現(xiàn)正相關(guān)，二者可能存在相關(guān)性，前者或?yàn)楹笳叩脑蛑?，對自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血后腦水腫而言意義重大。

關(guān)鍵詞:水通道蛋白9；腦水腫；腦含水量；自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血

自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血是腦血管意外之一，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率每年6～20/10萬人。自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血后，腦組織受到血紅蛋白等物質(zhì)的毒性作用，產(chǎn)生一系列病理生理變化，腦水腫則是其中最為重要的變化之一。在腦水腫中,水通道蛋白9起著十分重要的作用[1]，本實(shí)驗(yàn)建立自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血大鼠模型，檢測APQ9的表達(dá)，并測量大鼠腦含水量，試圖加深自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血后相關(guān)因素對腦水腫發(fā)生的作用的理解。

1材料與方法

1.1材料

健康成年Wistar雄性大鼠80只,假手術(shù)組20只，SAH組60只。建模大鼠取自佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。依據(jù)術(shù)后時(shí)間段，將60只大鼠再次分為三個(gè)亞組：12h組、24h組、48h組，每組20只。

1.2動物模型制備1.2.1SAH大鼠模型的制備

枕大池二次注血法建立模型[2],麻醉方法：100g/L水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射，固定后,枕外隆突下顯露枕大孔，枕大池內(nèi)注人0.3mL自體血，注射速度為0.lmL/min。1d后再次注血0.2mL，方法同前。術(shù)畢仰臥位,頭低30°仰臥30min。

1.2.2假手術(shù)組模型制備

手術(shù)方式及步驟同SAH組,僅將自體血更換為生理鹽水。

1.3腦組織水含量測定

大鼠斷頭，取腦，一側(cè)大腦半球用于檢測AQP9，另一側(cè)半球以濾紙吸盡血漬,置于干燥的錫紙上稱重,置于恒溫干燥箱內(nèi)48h，溫度為110℃。對比前后濕質(zhì)量及干質(zhì)量,代入公式:腦含水量(%)=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)÷濕質(zhì)量×100%，計(jì)算腦含水率。

1.4RT-PCR檢測AQP9的表達(dá)

取各組大鼠腦組織，行RT-PCR檢測分析，在提取總RNA后，RNA含量使用紫外分光光度儀測定，1%瓊脂糖凝膠電泳法，檢測總RNA純度，分裝后-80℃?zhèn)溆谩⒔M織總RNA中的mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，取反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進(jìn)行40個(gè)循環(huán)PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用用2-ΔΔCT法法進(jìn)行比較和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1腦含水量測定

SAH后12h腦組織含水量即增加，并在48h內(nèi)呈遞增，見表1。SAH后12h、24d、48d組與對照組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2腦含水量與AQP49mRNA表達(dá)的相關(guān)性

由表1可以看出,腦含水量與對應(yīng)組AQP9表達(dá)的變化規(guī)律一致,相關(guān)分析得(r=0.768,P<0.01),表明二者具有正相關(guān)性。

表1　SAH后大鼠腦含水量和AQP9mRNA表達(dá)

注:*與SAH組和假手術(shù)組比較，有顯著性差異(P<0.05)。

3討論

自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血是一種常見的腦卒中類型，中國人群發(fā)病率約為每年6～20/10萬人，顱內(nèi)動脈瘤為其主要病因，致死及致殘率較高，對社會危害大。在自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血的病理生理過程中，腦水腫是神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的主要因素之一，這一病理生理過程中，往往是細(xì)胞性腦水腫和血管性腦水腫均參與其中。自體血二次注入枕大池法，是比較成熟的自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血大鼠建模方式，該模型可較為完善的模擬出自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血的病理生理過程，是神經(jīng)外科常用的動物模型之一。哺乳動物體內(nèi)，已知 13種水通道蛋白亞型，AQP9是其一。在神經(jīng)系統(tǒng)中，AQP9和其他水通道蛋白成分一起，發(fā)揮著水鹽代謝，各種物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。本實(shí)驗(yàn)中，在自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血發(fā)生后，AQP9呈現(xiàn)高表達(dá)，并隨著時(shí)間的延長呈增加趨勢；同時(shí)，大鼠腦含水量也呈現(xiàn)出增多現(xiàn)象，提示AQP9與腦水腫呈現(xiàn)正相關(guān)性。這一現(xiàn)象表明在自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血后，AQP9表達(dá)上調(diào)與腦水腫的相關(guān)性。

已有研究發(fā)現(xiàn)，AQP9可出現(xiàn)在腦內(nèi)各個(gè)位置，如：神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等不同部位，這提示在神經(jīng)系統(tǒng)的水鹽代謝中，AQP9在不同的部位發(fā)揮不同的作用。在腦缺血、缺血再灌注損傷，以及腦出血后腦水腫中，AQP9都發(fā)揮著重要的作用[3～5]。本實(shí)驗(yàn)中，自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血可延腦脊液循環(huán)到神經(jīng)系統(tǒng)各處，筆者認(rèn)為這也是AQP9表達(dá)上移與建模時(shí)間呈相關(guān)性的原因之一。

廉嘵宇等[6]建立自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血的大鼠模型，從中發(fā)現(xiàn)AQP4表達(dá)上調(diào)，可在3d內(nèi)達(dá)峰，并與腦水腫呈時(shí)間正相關(guān)，這一結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相類似，同時(shí)也提示，水通道蛋白各個(gè)亞型，在調(diào)節(jié)水代謝過程中，可有協(xié)同作用。王復(fù)新等[7]的研究表明水通道蛋白與基質(zhì)蛋白表達(dá)的相關(guān)性，提示水代謝可能與血腦屏障的開放存在相關(guān)因素，表明水通道蛋白或與血腦屏障的開放有關(guān)。

參考文獻(xiàn):

[1]劉永剛，姜鳳，姜堯佳.高血壓性腦出血周圍腦組織超微結(jié)構(gòu)及腦水腫發(fā)生機(jī)制研究[J]．黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2009，32(6)：142-143

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[6]廉嘵宇,張秀峰,宣兆博,等.水通道蛋白4mRNA在大鼠自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血后腦水腫中的表達(dá)及尼莫地平對其表達(dá)的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，209，32(6)：7-8

[7]王復(fù)新，張潔，王辰，等．尼莫地平對早期腦出血大鼠AQP4mRNA、MMP-9mRNA表達(dá)的影響[J]．黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2012，35(4)：1-2

基金項(xiàng)目：①黑龍江省衛(wèi)計(jì)委科研課題，編號：2013259。

作者簡介：姜廣宇(1981～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫(yī)師。 通訊作者：董航(1979～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫(yī)師。E-mail:donghang1006@sina.com。

中圖分類號:R642

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號：1008-0104(2016)04-0075-02

(收稿日期：2016-04-05)