杜從林，羅振國，桂士良，遲寶進(jìn)，郝　鵬

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江 佳木斯 154003)

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Hhcy大鼠血漿Hcy與陰莖海綿體H2S的相關(guān)性①

杜從林，羅振國，桂士良，遲寶進(jìn)，郝鵬

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要:目的：研究高同型半胱氨酸血癥(Hhcy)大鼠血漿同型半胱氨酸(Hcy)濃度和陰莖海綿體組織硫化氫(H2S)含量之間的關(guān)系。 方法：將24只健康雄性Wistar大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為8只正常組(C組)和16只模型組，給予C組(生理鹽水3mL/次)和模型組(生理鹽水3mL/次+蛋氨酸1g·kg-1·d-1)早晚各1次灌胃，持續(xù)6周。6周后采血測模型組血漿Hcy濃度均大于16.0μmol/L，提示造模成功，隨機(jī)將模型組分為Hhcy組(H組)和葉酸、vitB12組(V組)各8只，給予H組(生理鹽水3mL/次+蛋氨酸1g·kg-1·d-1)和V組(生理鹽水 3mL/次+蛋氨酸1g·kg-1·d-1+葉酸0.5mg·kg-1·d-1+vitB1250μg·kg-1·d-1)繼續(xù)灌胃6周后測血漿Hcy和H2S濃度，0、5V下陰莖海綿體內(nèi)壓/平均頸動(dòng)脈壓(ICPmax/MAP)檢測后取陰莖組織測H2S含量。 結(jié)果：隨著C組、V組、H組之間血漿Hcy濃度依次增高，而大鼠ICPmax/MAP(0、5V)值逐漸降低，陰莖組織H2S含量依次均顯著性降低(P<0.05)，且血漿Hcy濃度與陰莖組織H2S含量之間為負(fù)性相關(guān)。 結(jié)論：隨著血漿Hcy濃度增高，致使陰莖海綿體內(nèi)源性H2S含量降低，這可能是Hhcy致勃起功能下降的原因之一，且葉酸和維生素B12能夠有效的降低血漿Hcy濃度，改善勃起功能。

關(guān)鍵詞:硫化氫；同型半胱氨酸；勃起功能障礙；陰莖海綿體

近年來勃起功能障礙(ED)發(fā)病率持續(xù)升高，其病因復(fù)雜多樣，如：Hhcy、心血管病、糖尿病等。Hhcy指血漿Hcy水平升高超過16.0 μmol/L者[1]。桂士良等研究發(fā)現(xiàn)，Hhcy性ED機(jī)制可能是血漿Hcy升高致陰莖海綿體內(nèi)NO與CO含量下降[2]。郝鵬等人證實(shí)，Hhcy大鼠的血漿Hcy與其勃起功能之間有負(fù)相關(guān)性，且葉酸和vitB12能夠有效降低血漿Hcy濃度并改善其勃起功能[3]。H2S是近些年發(fā)現(xiàn)的具有舒血管效應(yīng)和促進(jìn)陰莖勃起的新型氣體分子遞質(zhì)。我們前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)陰莖組織內(nèi)源性H2S含量降低是老年性ED的發(fā)病原因之一，且陰莖組織H2S含量與勃起功能之間具有正相關(guān)性[4，5]。但Hhcy性ED中血漿Hcy水平與H2S含量的關(guān)系尚不明確。此次實(shí)驗(yàn)旨在研究Hhcy大鼠血漿Hcy濃度和陰莖海綿體H2S含量之間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型建立：健康雄性2月齡Wistar大鼠(購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)24只，適應(yīng)喂養(yǎng)1周后稱重，體重相差均在30g以內(nèi)，且均有正常性功能，隨機(jī)分為兩組(8只正常組，記為C組；16只為模型組)，分別給予C組(生理鹽水3mL/次)和模型組(生理鹽水 3mL/次+蛋氨酸1g·kg-1·d-1)早晚各1次灌胃，C組持續(xù)12周，而模型組持續(xù)6周后眶后靜脈采血示模型組血漿Hcy均大于16.0μmol/L，將模型組隨機(jī)分為Hhcy組(H組)和葉酸、vitB12組(V組)各8只，分別給予H組(生理鹽水 3mL/次+蛋氨酸1g·kg-1·d-1)和V組(生理鹽水 3mL次+蛋氨酸1g·kg-1·d-1+葉酸0.5mg·kg-1·d-1+vitB1250μg·kg-1·d-1)繼續(xù)灌胃6周后采血測血漿Hcy濃度。

1.1.2主要試劑材料：葉酸(江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司)，vitB12片(山西云鵬制藥有限公司)，RM6240型多導(dǎo)生理信號采集處理系統(tǒng)和酶標(biāo)儀由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1測定血漿Hcy：于灌胃12周后每只大鼠采血2mL，以4000 r/min速率離心10min，取上清送至佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院生化室測定血漿Hcy值。

1.2.2ICP/MAP檢測：用1%戊巴比妥鈉50mg/kg對C組及造模成功的H組大鼠行腹腔注射，麻醉滿意后于頸部正中取一縱行切口，依次切開皮膚和頸部肌肉顯露氣管，緊貼氣管左側(cè)暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，行頸總動(dòng)脈插管來監(jiān)測MAP。于陰莖背側(cè)顯露出陰莖海綿體，刺入充滿肝素鹽水24G針頭后接三通管并連壓力轉(zhuǎn)換器以測定ICP。盆神經(jīng)節(jié)緊鄰前列腺后外側(cè)緣，打開腹腔并找出盆神經(jīng)節(jié)將其作為電刺激部位且給予電刺激(刺激參數(shù)：0、5V，25Hz，2ms；刺激持續(xù)1min間隔5min后重復(fù))，用RM6240型多導(dǎo)生理信號采集處理系統(tǒng)來記錄第1、7分鐘ICPmax/MAP 值。

1.2.3血漿H2S濃度測定：取一1.5mL的EP管，依次加入250μL的1%醋酸鋅、400μL三蒸水、100μL大鼠新鮮血漿、133μL的20mmol/L對苯二銨鹽酸鹽以及三氯化鐵(30mmol/L，133μL)，室溫孵育10 min后加入250μL的10%三氯乙酸，離心(4℃,17500g)10min后取上清液于96孔板中，用酶標(biāo)儀測670 nm波長的吸光度并算得血漿H2S濃度。

1.2.4測定陰莖海綿體組織H2S的含量和生成率 測壓后以1%戊巴比妥鈉對各大鼠以安樂死方式處死并截取陰莖海綿體，以PBS液(10 mmol/L，pH7.4)對其脫血處理，將陰莖海綿體組織和PBS液(0.10mol/L，pH 7.4)以10:1比例制成組織勻漿，取0.5mL勻漿于1.5mL的EP管中并依次加入20μL-半胱氨酸(0.01mol/L)、30μL生理鹽水及20μL 5-磷酸吡哆醛(2mmol/L)，將EP管置于37℃溫水中30min后先后加入1%(W/V) 乙酸鋅及10%(W/V)三氯醋酸各250μL，繼續(xù)37℃溫水靜置60min，先后加入對苯二銨鹽酸鹽(20mmol/L)和三氯化鐵(30mmol/L)各133μL，20min后加樣于孔板中并用酶標(biāo)儀測670nm 波長處吸光度，以 nmol/mg 表示組織中H2S含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1血漿Hcy濃度、勃起功能及陰莖內(nèi)源性H2S含量比較

兩組大鼠體重、血漿Hcy和H2S的濃度、ICPmax/MAP(0、5V)值、陰莖組織H2S含量與生成率見表1。

表1　兩組大鼠體重、血漿Hcyt和H2S濃度、ICPmax/MAP(0、5V)、海綿體H2S含量及生成率比較

與C組比較，aP<0.05;與H組比較，bP<0.05。

2.2血漿Hcy與海綿體H2S含量的相關(guān)性分析

三組大鼠血漿Hcy水平與陰莖海綿體組織H2S含量之間均呈負(fù)相關(guān)性，見表2。

表2　大鼠血漿Hcy值與陰莖海綿體H2S含量的相關(guān)性

3討論

一項(xiàng)國內(nèi)的流行病學(xué)報(bào)告顯示，與2003年相比，中度和重度ED患者分別增加了2倍和10%，中長病程ED患者增加了2～3倍[6]。ED和許多疾病因素如Hhcy、糖尿病、代謝綜合征、高血壓等有關(guān)[7]。Hcy是由飲食吸收的蛋氨酸(Met)硫化而形成，通過甲基團(tuán)轉(zhuǎn)移活化S-腺苷蛋氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)镠cy。Hcy代謝循環(huán)有兩條途徑：第一是在vitB12作為Met合成酶作用下，甲基供體(N5-甲基四氫葉酸)重新甲基化生成Met；第二是vitB6為輔酶的胱硫醚-β-合成酶(cystathi-onine-beta-synthase，CBS)催化Met與絲氨酸縮合生成胱硫醚，后者在胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine gamma-lyase, CSE)催化下分解成H2S、半胱氨酸和α-酮丁酸，此為合成谷胱苷肽的重要途徑，可使細(xì)胞中許多成分免受氧化破壞[8]。血漿Hcy水平與遺傳、環(huán)境、年齡、吸煙、惡性腫瘤等因素密切相關(guān)，任何因素及代謝酶(CBS、CSE等)和輔助因子(葉酸、vitB12等)的缺乏均可致血漿中Hcy異常蓄積而出現(xiàn)Hhcy。高Hcy是多功能的損傷因子，它能誘導(dǎo)血管局部的炎癥細(xì)胞釋放多種炎癥因子致使動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成；同時(shí)還可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白出現(xiàn)錯(cuò)誤的重疊，損傷平滑肌與內(nèi)皮細(xì)胞功能；可以刺激血管平滑肌細(xì)胞過度增殖與重塑；也可以通過增加活性氧的含量來直接抑制內(nèi)皮舒張并損傷內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的功能；此外，Hhcy大鼠陰莖海綿體中血紅素氧合酶-2(HO-2)和一氧化氮合酶(NOS)表達(dá)減弱導(dǎo)致其相應(yīng)的CO和NO含量下降也是Hhcy性ED的發(fā)病原因之一[9]。

內(nèi)源性H2S主要由兩種依賴磷酸吡哆醛的關(guān)鍵酶(CSE和CBS)以Hcy代謝過程中的L-半胱氨酸為底物而合成[10]。H2S在體內(nèi)以1/3的氣體H2S和2/3的NaHS形式存在。H2S可以通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)皮源性超極化因子(EDHFs)和血管內(nèi)皮細(xì)胞舒張因子(EDRFs)來舒張血管平滑肌，而對海綿體的松弛作用僅部分地依賴于陰莖勃起的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)或環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)系統(tǒng)的經(jīng)典途徑，它主要是通過激活A(yù)TP敏感的鉀離子(K+-ATP)通道使膜電位發(fā)生超極化反應(yīng)，致受膜電位影響的電壓依賴性Ca2+通道關(guān)閉使平滑肌松弛。此外，H2S還可與NO、CO和睪酮以協(xié)同作用作用的方式來促使平滑肌舒張，且H2S通過抑制Bcl-2蛋白表達(dá)而抑制平滑肌的增殖和促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，以及抑制NADPH氧化酶(一種產(chǎn)生超氧化物的重要酶)的表達(dá)和抑制TNF-α等誘導(dǎo)超氧化物的形成來改善平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞功能從而改善勃起功能。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H組血漿Hcy水平明顯高于C組，經(jīng)給予補(bǔ)充葉酸和vitB12治療后其血漿Hcy水平明顯下降，故V組血漿Hcy水平顯著低于H組。而勃起功能ICPmax/MAP(0、5V)值、血漿H2S濃度、陰莖海綿體H2S含量和生成率均依次為C組>V組>H組，且血漿Hcy水平與陰莖海綿體H2S含量呈負(fù)性相關(guān)。這說明隨著血漿Hcy水平的升高，高濃度Hcy通過氧化應(yīng)激及刺激血管平滑肌細(xì)胞過度增殖與重塑等機(jī)制來損傷內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞的功能，直接或間接的致使陰莖組織生成H2S能力減弱，內(nèi)源性H2S含量減少，最終致大鼠的勃起功能下降。采用及時(shí)補(bǔ)充葉酸和vitB12能有效的降低血漿Hcy水平并增加內(nèi)源性H2S的量，從而改善Hhcy大鼠的勃起功能，但高濃度的Hcy如何導(dǎo)致H2S含量的減少和Hhcy致勃起功能下降的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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基金項(xiàng)目：①黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號：H2015073。

作者簡介：杜從林(1986～)男，湖北麻城人，在讀碩士研究生。 通訊作者：桂士良(1972～)男，黑龍江林口人，在讀博士研究生，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：guishiliang2008@163.com。

中圖分類號:R697+.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號：1008-0104(2016)04-0016-03

(收稿日期：2015-12-07)

The correlation between plasma homocysteine and contents of hydrogen sulfide in the corpus cavernosum of hyperhomocysteinemia in rats

DUCong-lin，LUOZhen-guo，GUIShi-liang，CHIBao-jin，HAOPeng

(Department of Urinary, The First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154003，China)

Abstract:Objective: To study the relationship between plasma homocysteine(Hcy) and contents of hydrogen sulfide(H2S) in the corpus cavernosum of hyperhomocysteinemia(Hhcy) rats; and to explore the mechanism of Hhcy rats with decreased erectile function. Methods：Twenty four healthy male wistar rats were fed in the same conditions. One week later, they were randomly divided into control group (C group with eight rats) and model group (sixteen rats). By intragastric administration and twice one day, model group rats were given with methionine(1g·kg-1·d-1) and physiological saline(3mL per time) while group C with physiological saline(3mL per time). Six weeks later, the levels of model group rats were all over 16.0 μmol/L. Then model group rats were randomly divided into Hhcy group(H group,eight rats) and vitamin B12group(V group,eight rats). The group H was given with methionine and physiological saline by intragastric administration and twice one day like before while group V was given with methionine(1g·kg-1·d-1) and physiological saline(3mL per time) and folate(0.5mg·kg-1·d-1) and vitamin B12(50μg·kg-1·d-1). Six weeks later, all rats were detected the concentrations of Hcy in plasma and H2S in the plasma and penile tissue. Results：As the levels of plasma Hcy of group C、V and H became higher and higher, the contents of H2S in the plasma and penile tissue correspondingly became lower and lower. There was negative correlation between plasma Hcy and H2S in the corpus cavernosum. Conclusion：Increased levels of plasma Hcy may result in reduction of endogenous H2S, and this may be the reason of reduced erectile function with Hhcy. Folate and vitamin B12could make erectile function better.

Key words:hydrogen sulfide; homocysteine; erectile dysfunction; corpus cavernosum