榮毅楨　侯亞飛　徐順

摘 要：通過理論計算方法研究桃仁紅花煎治療心血管疾病的藥理學行為。首先將從桃仁紅花煎各味中藥中分離得到的672個小分子與30個與心血管疾病有關的靶標（55個結合位點）進行初步對接，篩選出活性成分，構建小分子——靶標相互作用網絡；接下來將虛擬篩選出來的活性較高的分子與部分靶標作進一步的精細對接，研究其相互作用機理，為治療心血管疾病的新藥設計和開發(fā)提供指導。

關鍵詞：桃仁紅花煎；心血管疾病；分子對接；計算藥理學

桃仁紅花煎出自《素庵醫(yī)案》，主要由紅花、當歸、桃仁[1]、香附、延胡索、赤芍、川芎、丹參[2]、青皮、生地黃組成。以桃仁、紅花為主藥，配香附、延胡索、青皮行氣以活血，丹參尤屬要物，研究表明其對心血管疾病有較好的治療作用，與赤芍配伍有抗凝血作用，而與川芎、赤芍、生地黃等配伍則有預防血栓形成的功效。臨床表明桃仁紅花煎具有降低血壓、有效對抗動脈粥樣硬化、保護心血管的效果[3]。然而對該方劑具體的藥理學研究很少。中藥體系成分復雜，具有與多種藥靶作用，調控多種生物途徑的復雜作用機理，因此在分子水平研究中藥作用機理有很大的難度。近年來，隨著計算化學的發(fā)展，人們已經注意到通過計算藥理學研究探討中藥可能的作用機理[4-7]，對中藥現代化研究可能是一條有效的途徑。

本文利用桃仁紅花煎已分離得到的672個化合物分子，再結合一些重要的與心血管疾病有關的靶標，運用理論計算方法研究桃仁紅花煎的藥理學性質，并篩選出活性成分，為新藥的設計與開發(fā)提供指導。

1 桃仁紅花煎中有效成分的虛擬篩選

1.1 桃仁紅花煎中含有小分子化合物的收集

通過查閱大量文獻和數據庫搜集到中藥方劑桃仁紅花煎中十味中藥中已分離得到的化合物672種，均已被確定結構。然后用Cerius2軟件對結構進行優(yōu)化，并對最優(yōu)構象進行加氫及能量優(yōu)化，保存為TRHHJ.sd文件。

1.2 分子對接與打分

在DrugBank數據庫及PDB數據庫篩選出30個與心血管疾病相關的靶標，其中包括環(huán)氧化酶、白細胞介素、血管緊張素轉化酶、腫瘤壞死因子等30個靶酶，共55個結合位點。將672個化合物分子與靶標蛋白的55個結合位點在Cerius2的LigandFit模塊下進行對接。對接之前，首先需對靶標蛋白進行預處理，然后去除原配體，保存。去除原配體也須處理后保存。對接中使用柔性對接，另外將Pose Saving Strategy下的參數Max number of pose saved改為1，其余參數均為默認設置。保存為合適的名字，點擊Ligand Fit下的Dock Ligands按鈕進行對接。對接完成后，還需要進行原配體與靶標蛋白的對接，與上述步驟相同。構建小分子-靶標網絡圖

經過LigandFit對接，我們可以得到672個小分子化合物與靶標蛋白的55個位點對接的DockScore值，取得分前四十的小分子和靶標利用Pajek軟件構建小分子-靶標蛋白相互作用的D-T網絡圖。最后，使用軟件CentiBin計算其Degree值。

通過網絡圖可以直觀的看到多個化合物分子分別靶向多個不同的靶標蛋白，表明中藥的作用機理是多靶點相互協同作用，進一步揭示了中藥復雜的作用機制。

2 活性化合物分子與靶標的精細對接

活性化合物與靶標的精細對接在Autodock軟件中完成。采用拉馬克遺傳算法（Lamarckian GA）以及半經驗自由能的方法分別來尋找和評價配體和受體間相互作用的最佳結合位置及匹配情況，通過分子精細對接得到的結合能和最佳構象在受體中的位置，為新藥的研發(fā)與設計提供更精確的數據。

2.1 配體的篩選

由于Autodock對接不像LigandFit對接可以批量處理，只能逐個進行對接，因此在初步選出的11個化合物小分子中，選出Degree較大的6個化合物分子做精細對接的配體。他們分別是T56、H1、C71、D67、D14、H17。

2.2 受體的選擇

由于檢索到的與心血管疾病相關的靶標較多，若在Autodock軟件中一一做精細對接工作量相對較大，因此根據化合物分子和靶標蛋白質的LigandFit對接篩選出的活性成分，在這30個靶標蛋白中找出與上述11個活性化合物分子結合較好的部分靶標蛋白作為精細對接的受體，如1TVO、1ALU等。

2.3 精細對接

首先是受體分子的準備，將切除原配體的蛋白靶標三維結構導入AutoDock中，去掉溶劑并加極性氫和點電荷。其次是配體小分子的準備，將已經優(yōu)化好的6個小分子也導入Autodock中，轉換格式并保存。接下來選擇Grid選項卡計算格點親和力，輸入受體和配體分子，并設定格點參數，number of points in x-dimension，number of points y-dimension，number of z-dimension均為60，Spacing為0.375，以受體分子作為中心，然后在選項卡下選擇運行Run Autogrid；待Autogrid運行完畢后便是AutoDock的對接了，設定好配體和受體及相應的參數，選擇拉馬克算法進行分子對接，得到一個DLG文件。

2.4 對接的結果

以選出的6個活性化合物分子與靶標蛋白1ALU的精細對接結果為例進行討論。主要根據受體與配體的鍵合自由能、抑制常數等參數來分析受體與配體的結合情況，對接自由能=分子間能（vdw + Hbond + desolv energy）+旋轉能+總內能-其他能量

注：對接自由能=Free Energy of Binding；靜電能=Electrostatic Energy 分子間能量=Final Intermolecular Energy ；旋轉能=Torsional Free Energy 總內能=Final Total Internal Energy ； 非鍵系統能=Unbound System&apos；s Energy

當結合自由能（BE）的絕對值較大而抑制常數偏小時，說明受體與配體之間結合較好。H17的結合自由能最大且抑制常數較小，所以H17與該受體的對接為最佳對接。因此舍棄其他5個分子，僅對上述H17分子做進一步研究。

如圖2所示，H17的結構經過一定程度的旋轉和折疊之后，剛好嵌入1ALU的環(huán)形口袋，二者具有很高的契合度，H17與1ALU上的殘基LYS86、GLU93、LEU64、ASN63、LEU62 等具有明顯的相互作用；苯環(huán)骨架上的羥基和殘基上的羰基發(fā)生了分子間氫鍵作用，可見這個位置上如果有活性氫則有助于配體與受體之間的結合，同時酯基上的羰基與殘基上的N-H發(fā)生了氫鍵作用[10]，說明在該位置如果有C=O等易生成氫鍵的基團時則有助于配體與受體之間的結合，通過鍵能比較發(fā)現，苯環(huán)上的羥基對二者的相互作用影響最大。

3 結論

通過桃仁紅花煎中已知的672個化合物分子與心血管疾病有關的30個靶標蛋白的55個活性位點的對接，虛擬篩選出11個生物活性較高的成分，這些化合物可以作為開發(fā)治療心血管疾病藥物的先導化合物。利用對接結果構建了小分子-靶標蛋白相互作用網絡圖，證實了桃仁紅花煎中所含的化合物分子具有多靶點相互協同作用。接下來選取活性較高的6個分子與部分靶標蛋白做了進一步的精細對接，獲得了活性小分子與靶標蛋白相互作用的定量數據，揭示了桃仁紅花煎在治療心血管疾病方面的作用機理，對篩選出的治療心血管疾病的活性小分子的結構改造，新藥設計和開發(fā)提供了詳 細信息和指導。

參考文獻

[1]王仁芳，范令剛，高文遠，等.桃仁化學成分與藥理活性研究進展[J].現代藥物與臨床：2010，25（6）：426-429

[2]張金濤，于敏佳.丹參化學成分及其臨床應用探討[J].黑龍江科技信息：2011，15（18）：44-44

[3]劉俊峰，張建偉.桃仁紅花煎加減治療腦血管性癡呆 40 例[J].陜西中醫(yī)：2007，28（2）：147-148