鄭　磊　張鳳春　李玉妹　袁棟才　魏　琰

(哈勵(lì)遜國際和平醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，河北　衡水　053000)

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APOE ε4等位基因與尿AD7c-NTP聯(lián)合檢測(cè)在阿爾茨海默病早期診斷中的價(jià)值

鄭磊張鳳春1李玉妹1袁棟才1魏琰1

(哈勵(lì)遜國際和平醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，河北衡水053000)

〔摘要〕目的探討載脂蛋白ε4(APOE ε4)等位基因與尿阿爾茨海默病(AD)相關(guān)神經(jīng)絲蛋白(AD7c-NTP)聯(lián)合檢測(cè)在AD早期診斷中的價(jià)值。方法根據(jù)精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)(DSM-Ⅳ)和美國國立神經(jīng)病、語言交流障礙和卒中研究所-老年性癡呆及相關(guān)疾病學(xué)會(huì)(NINCDS-ADRDA)有關(guān)AD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將臨床診斷疑似AD患者156例歸為疑似AD(PAD)組，另選120例健康者作為對(duì)照組。分別檢測(cè)各組APOE ε4等位基因頻率和尿AD7c-NTP含量。結(jié)果①APOE ε4等位基因表達(dá)頻率在PAD組顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；②尿AD7c-NTP在 PAD組中的含量較對(duì)照組顯著升高(P<0.01)；③APOE ε4與AD7c-NTP聯(lián)合檢測(cè)具有較好的診斷價(jià)值。結(jié)論APOE ε4等位基因與尿AD7c-NTP聯(lián)合檢測(cè)是監(jiān)測(cè)及診斷AD早期病變的較好指標(biāo)，提升二者單獨(dú)應(yīng)用時(shí)的預(yù)測(cè)價(jià)值，為AD早期診斷及療效監(jiān)測(cè)提供參考。

〔關(guān)鍵詞〕阿爾茨海默??；阿爾茨海默病相關(guān)神經(jīng)絲蛋白；載脂蛋白E ε4；早期診斷

阿爾茨海默病(AD)是一種嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病，臨床上以記憶損失和認(rèn)知功能下降為主，是老年癡呆的常見形式，極大的威脅老年人的生命及健康〔1〕。目前，AD的診斷主要依據(jù)患者臨床表現(xiàn)并結(jié)合電子計(jì)算機(jī)X射線斷層掃描技術(shù)，核磁共振及神經(jīng)心理學(xué)量表等綜合評(píng)價(jià)。然而，由于AD的潛伏期較長(zhǎng)，從癥狀出現(xiàn)到確診一般要3年左右時(shí)間，且在AD確診時(shí)患者多已存在明顯的神經(jīng)元損害，而此時(shí)進(jìn)行藥物干預(yù)治療的效果有限〔2〕。因此，探尋準(zhǔn)確特異的生物標(biāo)記物早期鑒別診斷AD易發(fā)人群，實(shí)現(xiàn)AD早發(fā)現(xiàn)早治療的目標(biāo)已勢(shì)在必行。本研究旨在探討APOE ε4等位基因與尿AD7c-NTP聯(lián)合檢測(cè)在AD早期診斷中預(yù)測(cè)效果及臨床意義。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象2012年6月至2014年3月我院神經(jīng)內(nèi)科收治患者276例。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國精神障礙診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)(DSM-Ⅳ)及美國國立神經(jīng)疾病、語言溝通障礙和腦卒中研究所-阿爾茨海默病及相關(guān)疾病學(xué)會(huì)(NINCDS-ADRDA)有關(guān)AD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，由2名副高職稱以上的神經(jīng)科醫(yī)師明確診斷；②按照簡(jiǎn)易智能狀態(tài)量表(MMSE)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，臨床診斷為認(rèn)知功能正常者M(jìn)MSE評(píng)分均≥25分，臨床診斷疑似AD患者M(jìn)MSE評(píng)分均在10～26分；③按照臨床癡呆評(píng)定量表(CDR)判定AD癡呆的嚴(yán)重程度，并根據(jù) CDR值進(jìn)行分組，其中CDR=0為正常健康對(duì)照組，CDR=1為輕度癡呆組，CDR=2為中度癡呆組，CDR=3為重度癡呆組。排除標(biāo)準(zhǔn)：①長(zhǎng)期大量服用抗精神病藥物和曾有嚴(yán)重頭部外傷史；②患者累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的內(nèi)科疾??；③患有嚴(yán)重精神疾病患者；④認(rèn)知功能檢查過程不能配合的患者。按照以上標(biāo)準(zhǔn)，共收集認(rèn)知功能正常者120例〔對(duì)照組，平均年齡(70.4±8.2)歲，MMSE(29.7±1.4)，CDR=0，臨床診斷疑似AD(PAD)患者156例(PAD組)，平均年齡(72.2±9.2)歲，MMSE(16.2±2.6)，CDR=2〕，各組在年齡，性別，教育年限方面差異無顯著性(P>0.05)。

1.2研究方法

1.2.1樣本采集所有研究對(duì)象空腹抽取靜脈血10 ml，采用肝素鋰抗凝保存，常溫保存時(shí)間不多于24 h，晨尿30～50 ml，4℃保存時(shí)間不多于7 d。

1.2.2限制性內(nèi)切酶基因亞型分型利用Hixson等〔3〕的PCR及限制性內(nèi)切酶APOE基因亞型分型方法，通過紅細(xì)胞裂解液分離靜脈血樣本(10 ml)中的白細(xì)胞，白細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌3次后，提取基因組DNA進(jìn)行基因擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為F4(5′-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3′)和F6(5′-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3′)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HhaⅠ酶切(酶切位點(diǎn)為GCGC)后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳后分離條帶的位置及數(shù)量區(qū)分不同的APOE等位基因亞型。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)尿AD7c-NTP酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒購自深圳市安群生物工程有限公司，嚴(yán)格按試劑說明書操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件行t及χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1APOE等位基因在對(duì)照組、PAD組中表達(dá)頻率的比較PAD組APOE ε4等位基因較對(duì)照組的表達(dá)頻率顯著提高(χ2=16.53，P<0.01)，而APOE ε2或ε3等位基因?qū)φ战M和PAD組間中表達(dá)頻率無差異(P>0.05)，見表1。

表1　APOE等位基因在各組的表達(dá)頻率〔n(%)〕

2.2兩組尿樣AD7c-NTP的含量PAD組尿樣中AD7c-NTP的含量較對(duì)照組顯著升高〔(4.62±1.53)ng/ml vs (1.28±1.16)ng/ml，t=19.91，P<0.01〕。PAD組1.44 ng/ml患者比例〔78.85%(123/156)〕明顯高于對(duì)照組〔16.67%(20/120)，P<0.05〕。

2.3APOE ε4與AD7c-NTP聯(lián)合診斷與單獨(dú)診斷比較尿AD7c-NTP水平在APOE ε4等位基因陽性的患者中顯著升高〔(5.36±1.64)vs(3.52±1.42)ng/ml，t=7.53，P<0.01〕，PAD組中APOE ε4陽性者ADTC-NTP值>14.4 ng/ml的患者比例高于陰性者〔91.30%(62/69)vs 70.11%(61/87)，P<0.05〕。此外，相比于APOE ε4等位基因陰性患者，該基因陽性的患者在平均發(fā)病年齡上明顯提前〔(62.22±8.72)vs(76.53±9.36)歲，t=9.85，P<0.01〕。

3討論

預(yù)計(jì)到2050年，全世界將有8 000萬人遭受AD困擾〔4〕。由于AD病因及發(fā)病機(jī)制尚未闡明，現(xiàn)有以AD病理特征為基礎(chǔ)的病理學(xué)檢測(cè)仍為AD診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，然而AD病理檢測(cè)活檢受限，加之結(jié)果受檢測(cè)人員專業(yè)素養(yǎng)和主觀性影響，使其無法滿足臨床對(duì)AD早期診斷的迫切需求〔5～7〕。因此，探尋準(zhǔn)確特異的生物標(biāo)記物早期診斷鑒別AD易發(fā)人群，監(jiān)測(cè)病程進(jìn)展和藥物療效，以實(shí)現(xiàn)AD早發(fā)現(xiàn)早治療的目標(biāo)已勢(shì)在必行。

近期，全基因組關(guān)聯(lián)研究證實(shí)，APOE基因多態(tài)性與AD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系密切，其APOE ε4等位基因是AD最強(qiáng)的遺傳危險(xiǎn)因素，與早發(fā)性和遲發(fā)性AD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加呈正相關(guān)〔8，9〕。已經(jīng)證實(shí)，APOE ε4以劑量相關(guān)方式增加AD的發(fā)病率并使患者發(fā)病年齡提前，F(xiàn)arrer等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，91%的APOE ε4純合基因攜帶者在68歲左右發(fā)病，而在APOE ε4非攜帶者中，僅20%的人在85歲時(shí)才發(fā)生AD。研究表明，APOE與Aβ代謝密切相關(guān)，其中，APOE ε4可強(qiáng)烈影響Aβ沉積所形成的老年斑，并促進(jìn)腦淀粉樣血管病發(fā)生，而二者正是AD最主要的病理特征〔11～15〕。此外，APOE還與AD其他的風(fēng)險(xiǎn)因子密切相關(guān)，已經(jīng)證實(shí)，APOE ε4可通過與動(dòng)脈粥樣硬化，周圍血管疾病及2型糖尿病等協(xié)同作用增加AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。近年來，APOE ε4作為AD發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)因子正逐漸成為探索AD發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)，然而單純的以APOE ε4等位基因預(yù)測(cè)AD仍存在一些局限。如Itabashi等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)，僅通過APOE ε4診斷AD的敏感度和特異度不高(50%左右)，且不能有效監(jiān)測(cè)AD病程進(jìn)展和藥物療效。因此，單獨(dú)應(yīng)用APOE ε4作為AD診斷的生物標(biāo)記物時(shí)，應(yīng)結(jié)合其他生物標(biāo)記物聯(lián)合診斷以提高其在AD早期診斷的價(jià)值。

已經(jīng)證實(shí)，早期AD患者腦脊液和尿液中AD7c-NTP的表達(dá)水平都選擇性增加〔17〕。AD7c-NTP屬神經(jīng)絲蛋白家族的一個(gè)成員，AD7c-NTP主要存在于組織學(xué)尚完整的變性神經(jīng)元中的表達(dá)增加，待神經(jīng)元細(xì)胞衰亡后，大量的AD7c-NTP被釋放到腦脊液中，后經(jīng)尿液排出。de la Monte等〔18〕發(fā)現(xiàn)，在AD病程的早期AD7c-NTP基因過度表達(dá)，從而引起AD7c-NTP免疫活性的增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致磷酸化tau蛋白免疫介導(dǎo)的細(xì)胞骨架病變，但AD7c-NTP不參與淀粉樣蛋白的聚積。越來越多的證據(jù)表明，AD7c-NTP的異常變化是AD病程早期的生物學(xué)事件，其在腦脊液和尿液中的含量與AD疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)〔19，20〕。若腦脊液或尿液中含量異常增高，早期可疑或可能AD占62%，死后確定診斷的AD占84%。然而，有對(duì)腦脊液中AD7c-NTP進(jìn)行檢測(cè)有損傷大腦的風(fēng)險(xiǎn)，且需專業(yè)人員及特殊設(shè)備，使其在應(yīng)用時(shí)存在一定的局限性。AD患者尿液中AD7c-NTP的水平較正常老人顯著增加，與年齡無關(guān)。尿AD7c-NTP診斷早期AD的特異度為90%，靈敏度為80%～85%，與腦脊液標(biāo)本的檢測(cè)相比具有取材簡(jiǎn)單、無創(chuàng)、易復(fù)查等特點(diǎn)，使其在AD早期診斷具有較好的應(yīng)用價(jià)值〔17〕。

本研究證實(shí)，在疑似AD患者中，APOE ε4等位基因的表達(dá)頻率顯著增高，而尿AD7c-NTP的水平亦顯著升高，二者的變化與AD疾病早期進(jìn)展關(guān)系密切。通過APOE ε4與AD7c-NTP聯(lián)合檢測(cè)可互補(bǔ)二者在單獨(dú)應(yīng)用時(shí)的不足，提升AD診斷的預(yù)測(cè)價(jià)值，可為AD易發(fā)人群篩查及早期診斷提供生物學(xué)參考。

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〔2014-12-30修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：河北省2013年醫(yī)學(xué)科學(xué)研究課題計(jì)劃指導(dǎo)性課題(No.20130345)；哈勵(lì)遜國際和平醫(yī)院研究生課題(No.201202)

〔中圖分類號(hào)〕R749

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)12-2914-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.041

1哈勵(lì)遜國際和平醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

第一作者：鄭磊(1983-),男，主管檢驗(yàn)師,碩士，主要從事細(xì)胞生物學(xué)研究。