王燈亮　余良宏　林章雅　林元相　鄭樹法　康德智

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科,福建　福州　350005)

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辛伐他汀體外對(duì)人U251腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響

王燈亮余良宏林章雅林元相鄭樹法康德智

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科,福建福州350005)

〔摘要〕目的觀察辛伐他汀體外對(duì)人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡的作用。方法對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別行辛伐他汀干預(yù)，培養(yǎng)24、48、72、96 h，采用MTT比色法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度及不同時(shí)間干預(yù)后人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞周期的變化；采用TUNEL法檢測(cè)干預(yù)后細(xì)胞凋亡的情況及RT-PCR檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在干預(yù)48 h后檢測(cè)Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果辛伐他汀體外可明顯降低人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性及誘導(dǎo)其凋亡，濃度到達(dá)1.0 μmol/L時(shí)抑制作用明顯，與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。此外，辛伐他汀對(duì)人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制呈明顯的量-效關(guān)系。人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡隨藥物濃度增加而顯著，Caspase-3的表達(dá)亦呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)論辛伐他汀在體外可一定程度上抑制人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)其凋亡，Caspase-3參與細(xì)胞的凋亡過程。

〔關(guān)鍵詞〕辛伐他??；膠質(zhì)瘤細(xì)胞；增殖；凋亡

目前對(duì)膠質(zhì)瘤的治療以手術(shù)為主，輔助放療和化療。由于腫瘤細(xì)胞增殖活躍，向周圍正常腦組織的浸潤(rùn)及腫瘤自身的不斷有新生血管生成等，使其預(yù)后很差，尤其是世界衛(wèi)生組織(WHO)Ⅲ～Ⅳ高級(jí)別膠質(zhì)瘤。為提高膠質(zhì)瘤患者的生存時(shí)間和質(zhì)量，臨床及科研工作者仍在不斷尋找新的治療方法。辛伐他汀是HMG-CoA還原酶抑制劑，一種新型的降血脂的藥物，廣泛用于臨床。研究表明辛伐他汀具有體外抗抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用〔1〕。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察辛伐他汀體外對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及凋亡的作用。

1材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞庫)，辛伐他汀(杭州默沙東公司)，甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(Sigma公司)，RPMI1640、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)，DMSO(Ameresco公司)，小牛血清(杭州四季青生物制品公司)，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，DAB(福州邁新生物技術(shù)有限公司)，Trizol總RNA提取試劑盒(美國Invitrogene公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組的濃度分別為0.2、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L 5組，對(duì)照組為NS組。

1.2.2MTT檢測(cè)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，用10%血清RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為1.0×104/ml，均勻加入96孔培養(yǎng)板，每孔200 μl，培養(yǎng)18 h，棄上清液，加入10%血清RPMI1640培養(yǎng)基，同時(shí)加入不同辛伐他汀(終濃度0.2～8.0 μmol/L)，對(duì)照組加入PBS定容到200 μl，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后換無血清RPMI1640培養(yǎng)基180 μl，同時(shí)加入MTT(5 mg/ml)20 μl，孵育4 h，倒出培養(yǎng)基，每孔加入DMSO150 μl，振蕩10 min，在960型自動(dòng)酶標(biāo)儀上檢測(cè)，490 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的計(jì)算：抑制率(%)=(對(duì)照組A值-試驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，以1.0×104濃度接種于培養(yǎng)瓶，每瓶約3 ml，孵育24 h換液，加入辛伐他汀(終濃度0.2～8.0 μmol/L),對(duì)照組加入等量的PBS。培養(yǎng)48 h后，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，70%乙醇固定，4℃冰箱24 h。0.01%RNA酶消化10 min，碘化丙啶染色20 min。上機(jī)檢測(cè)。以染色熒光強(qiáng)度(DNA)的不同，將細(xì)胞分為G0/G1期、S期和G2/M期，各期細(xì)胞的百分比計(jì)算公式：PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)。

1.2.4人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)購置的人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞，加入含有青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml，10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，每2～3 d更換細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞增殖到瓶底的80%后行細(xì)胞傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞進(jìn)行辛伐他汀處理，對(duì)照組行等量的PBS處理。

1.2.5TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)取辛伐他汀干預(yù)后細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min后行TUNEL染色(具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行)，再行DAB顯色，最后蘇木素進(jìn)行復(fù)染，每張切片選擇6個(gè)陽性染色最明顯的中倍視野(×100)，計(jì)算每個(gè)視野中陽性細(xì)胞的平均數(shù)目。

1.2.6RNA提取與鑒定實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組腫瘤細(xì)胞分別用Trizol試劑吹打提取RNA，依照試劑盒說明操作得到白色沉淀，加入0.01%DEPC水1ml，于37℃水浴5 min，42℃60 min。用DEPC水將各組總RNA調(diào)整至同一濃度?？俁NA提取后以紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260∶A280比值，重復(fù)3次，測(cè)得該比值穩(wěn)定于1.8～2.0，計(jì)算總RNA濃度。

1.2.7RT-PCR半定量檢測(cè)Caspase-3表達(dá)Caspase-3及β-actin的引物委托廈門泰京生物技術(shù)有限公司合成。提取各組總RNA分別逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行半定量RT-PCR，β-actin：上游：5'-TTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3'下游：5'-TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT-3'。Caspase-3基因引物序列如下：上游：5'-AGTCTGACTGGAAAGCCGAA-3'下游：5'-CGGGATCTGTTTCTTTGCAT-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為342 bp。首次循環(huán)先在95℃變形2 min，然后55℃45 s變性、72℃1 min退火，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，以β-actin為內(nèi)參照同時(shí)進(jìn)行PCR。 PCR產(chǎn)物用含0.5 mg/L溴乙啶(EB)的2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀分析結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1辛伐他汀對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖活性的影響辛伐他汀干預(yù)48 h后，MTT法測(cè)定顯示，辛伐他汀對(duì)人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制呈明顯的量-效關(guān)系。見表1。

2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的結(jié)果隨辛伐他汀的濃度增加G0/G1值增加，而S期和G2/M值逐漸降低與對(duì)照組組比較具有顯著性差異(P<0.01)。見表2。

表1　辛伐他汀對(duì)人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

表2　辛伐他汀對(duì)人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖周期的影響±s，%，n=10)

與對(duì)照組比較：1)P<0.01

2.3TUNEL法原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果見圖1。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組處理48 h后，TUNEL染色陽性細(xì)胞，細(xì)胞核固縮呈棕褐色、染色質(zhì)聚集。染色陰性細(xì)胞呈藍(lán)色，細(xì)胞核形態(tài)正常。0.2、1、0、2.0、4.0、8.0 μmol/L辛伐他汀干預(yù)組的凋亡細(xì)胞隨干預(yù)的濃度增加而增加，分別為(2.0±0.89)%、(5.3±1.21)%、(7.5±1.05)%、(9.2±1.47)%、(11.2±1.19)%。辛伐他汀干預(yù)濃度≥1.0 μmol/L時(shí)陽性細(xì)胞與對(duì)照組〔(1.7±0.82)%〕相比有顯著差異(P<0.05)。

2.4RT-PCR檢測(cè)Caspase-3基因表達(dá)各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組干預(yù)48 h后，擴(kuò)增出來的Caspase-3基因，置2%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠掃描儀處理計(jì)算條帶光密度，以其與β-actin 光密度比值來表示。Caspase-3 mRNA產(chǎn)物的表達(dá)隨辛伐他定干預(yù)的濃度增高而增加，對(duì)照組Caspase-3 mRNA表達(dá)值為0.22±0.02，1.0 μmol/L組為0.52±0.02，4.0 μmol/L組0.56±0.01，8.0 μmol/L組為0.66±0.03，辛伐他汀干預(yù)組與對(duì)照組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

圖1　不同濃度的辛伐他汀處理48 h后與對(duì)照組U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡情況(×100)

圖2　辛伐他汀干預(yù)48 h后各組Caspase-3 mRNA表達(dá)

3討論

目前膠質(zhì)瘤治療的效果總體較差，尤其是高級(jí)別膠質(zhì)瘤。雖然臨床上首選手術(shù)治療，并且輔助放療、化療，使部分患者生存時(shí)間延長(zhǎng)，但由于高級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞異常增殖、分化和侵襲性，使這類患者術(shù)后極容易復(fù)發(fā)，平均生存時(shí)間仍很不理想。辛伐他汀是臨床上較新型的降血脂藥物，其通過抑制HMG-CoA還原酶降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成，降低血清膽固醇和血脂的含量，療效肯定。研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物亦有抑制腫瘤增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用〔1,2〕。細(xì)胞凋亡在胚胎發(fā)育、維持穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，同時(shí)它又能清除損傷后不能修復(fù)或潛在惡變的細(xì)胞，此外，細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸亦有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀處理后的48 h，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)聚集、核裂解、胞質(zhì)濃縮，顯示辛伐他汀抗腫瘤與腫瘤細(xì)胞的增殖和細(xì)胞凋亡有關(guān)，DAPI熒光檢測(cè)細(xì)胞染色質(zhì)不完整，呈現(xiàn)典型細(xì)胞凋亡特征，這些亦反映了p53,p21/WAF1,Bcl-2,BAD基因產(chǎn)物的表達(dá)〔3〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示辛伐他汀濃度大于等于1 μmol/L時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的凋亡陽性細(xì)胞與對(duì)照組相比有顯著性差異，細(xì)胞凋亡呈劑量依賴性，而低濃度的辛伐他汀對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制效果不明顯。流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞周期顯示，隨干預(yù)辛伐他汀濃度增加，G0/G1 期的細(xì)胞逐漸增多，處于S期和M期的細(xì)胞數(shù)減少，且呈濃度和時(shí)間依賴性。此外，凋亡蛋白Caspase-3 mRNA表達(dá)隨干預(yù)辛伐他汀濃度的增高亦增高，呈劑量依賴關(guān)系。Caspase-3是半胱天冬酶家族中重要的凋亡執(zhí)行蛋白。大部分凋亡發(fā)生的最后過程都是通過Caspase-3的激活得以實(shí)現(xiàn)。但通常情況下Caspase-3以無活性的酶原形式存在，包括大小亞基及N 端原結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，只有在凋亡因素刺激下，被上游蛋白酶切割才能活化，可作用于多聚ADP核糖基化酶(PARP)和內(nèi)切核酸酶AP24 等在內(nèi)的多種細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能蛋白，引起細(xì)胞凋亡。因此通過激活Caspase酶系統(tǒng)或活化死亡受體，啟動(dòng)Caspase系統(tǒng)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡〔4〕。

Koyuturk等〔5〕研究辛伐他汀誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)辛伐他汀通過c-Jun氨基端激酶而不是p38激酶顯著促進(jìn)ATF-2和c-Jun的磷酸化，其介導(dǎo)的ATF-2和c-Jun的磷酸化和凋亡可以被c-Jun氨基端激酶特異性抑制劑SB600125減弱，而SB202190和SB203580對(duì)其無抑制性作用。這些結(jié)果顯示c-Jun氨基端激酶依賴的ATF-2和c-jun磷酸化在辛伐他汀誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤凋亡中起重要作用。Misirkic等〔6〕發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可以通過抑制AMPK依賴的細(xì)胞自噬作用來抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，Gliemroth等〔7～9〕實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，但對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲沒有明顯抑制作用。研究還發(fā)現(xiàn)辛伐他汀作為腫瘤抑制劑和提高放療作用的敏感型方面是肯定的〔8〕。辛伐他汀體外可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡，F(xiàn)erris等〔10〕進(jìn)行了一組臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期服用辛伐他汀和洛伐他汀對(duì)新發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)。因此，他汀類藥物有望成為膠質(zhì)瘤的治療方法之一。

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〔2014-11-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(Z0516032)；福建省臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目資助(2012)

〔中圖分類號(hào)〕R739.4

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)12-2837-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.004

第一作者：王燈亮(1976-),男,博士,副主任醫(yī)師,主要從事膠質(zhì)瘤研究。