王丹丹　宋寧寧　亢春彥　陳建中

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院乳腺外科　鄭州　450014　2)河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理學(xué)教研室　新鄭　451191

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常山酮抑制乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的作用研究

王丹丹1)宋寧寧1)亢春彥2)陳建中1)

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院乳腺外科鄭州4500142)河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校病理學(xué)教研室新鄭451191

【摘要】目的探討常山酮抑制乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的作用。方法本實驗分為溶劑組及常山酮組，以人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及BALB裸鼠為研究對象，首先通過體外實驗，使用MTT法、劃痕試驗及Western blot觀察各組MDA-MB-231增殖、遷移及bax、bcl-2、cleaved-caspase3等凋亡相關(guān)蛋白的表達情況；然后制備乳腺癌腦轉(zhuǎn)移模型，通過神經(jīng)功能評分及腦部HE染色觀察各組腦轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果常山酮顯著抑制了MDA-MB-231的增殖和遷移能力，增加了bax及cleaved-caspase3蛋白的表達水平，并減少了MDA-MB-231向腦部的定植。結(jié)論常山酮可能通過抑制細(xì)胞增殖及遷移、促進凋亡等機制抑制乳腺癌細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移。

【關(guān)鍵詞】乳腺癌；腦轉(zhuǎn)移；常山酮

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，尤其在發(fā)展中國家[1]。腦轉(zhuǎn)移是乳腺癌后期常見的轉(zhuǎn)移癌類型，由于存在血腦屏障(blood brain barrier，BBB)，大多數(shù)抗癌藥物都不可以到達顱內(nèi)轉(zhuǎn)移灶發(fā)揮作用，導(dǎo)致乳腺癌腦轉(zhuǎn)移生存率極低，嚴(yán)重影響乳腺癌患者預(yù)后[2]。特別隨著近些年癌癥研究的巨大進步，乳腺癌患者的生存期有所延長，腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率正在增加。尋找能夠通過血腦屏障的高效抗癌藥物對乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的治療具有巨大的現(xiàn)實意義。常山酮為一種小分子生物堿，從我國傳統(tǒng)中藥常山中提取，之前主要應(yīng)用于預(yù)防及治療禽類球蟲病。但近十幾年，國內(nèi)外多項高質(zhì)量研究證實，常山酮具有較為廣譜的抗癌效果，能夠抑制黑色素瘤、肝癌、膀胱癌及乳腺癌等發(fā)展[3]。研究表明，常山酮能夠通過血腦屏障，且可以通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性、抑制轉(zhuǎn)化生長因子β受體信號通路發(fā)揮綜合的抗癌效果[4-5]，但常山酮能否抑制乳腺癌腦轉(zhuǎn)移尚缺乏研究。本實驗旨在探討常山酮對乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的治療效果，并初步探討其內(nèi)在機制。

1材料與方法

1．1實驗材料及分組本實驗使用裸鼠(BALB/c-nu/nu，雌性，6周齡，體質(zhì)量16～22 g)購于南京大學(xué)模式動物研究所；人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231購于美國ATCC公司。常山酮購于美國Sigma公司?？筨ax、cleaved-caspase3及GAPDH購自Santa Cruz 公司。MTT試劑盒購于中國康為試劑公司。本研究分為溶劑組及常山酮組。

1．2MTT試驗使用MTT試驗測定人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖情況。首先，將MDA-MB-231以1×104的密度接種于24孔板，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中24 h，之后分別加入DMEM及常山酮(終濃度為100 nM)，再繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后吸出上清，以終濃度62.5 μg/mL加入MTT，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)4 h，吸出上清，加入DMSO后再將上清取出，在570 nm波長下觀察吸收值，每組重復(fù)8次。

1．3劃痕試驗使用劃痕試驗測定人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移能力。將MDA-MB-231接種于24孔板，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞至生長到90%左右，用200 μL槍頭在2組培養(yǎng)孔底部自上而下畫一條豎線，然后分別加入DMEM及常山酮(終濃度為100 nM)。37 ℃、5% CO2條件條件下培養(yǎng)24 h后拍照觀察，并使用Image J軟件計算2組劃痕兩側(cè)細(xì)胞之間的平均距離。每組重復(fù)8次。

1．4Western blot使用Western blot方法測定人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231bax及cleaved-caspase3的表達情況。劃痕試驗中計算完劃痕兩側(cè)細(xì)胞間的平均距離后，提取各組細(xì)胞全蛋白，于12%的SDS-PAGE中分離，之后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉后分別加入抗-bax及抗cleeaved-caspase3抗體，于室溫下孵育2 h，PBST清洗后加入對應(yīng)二抗，于室溫下孵育1.5 h，清洗后加入ECL發(fā)光液，在化學(xué)發(fā)光顯示儀器中觀察各組各蛋白的情況，使用Image J測定各組條帶密度情況。每組重復(fù)8次。

1．5乳腺癌腦轉(zhuǎn)移模型制作以20只雌性BALB/c-nu/nu裸鼠為研究對象，依據(jù)Taskar等[5]的方法麻醉小鼠后，打開胸腔，向其左心室注射1.75×105MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞，縫合傷口，5周時通過改良的神經(jīng)功能評分(mNSS)及腦部切片HE染色觀察裸鼠神經(jīng)功能體征及明確乳腺癌腦轉(zhuǎn)移情況。溶劑組及常山酮組分別在手術(shù)時開始隔天腹腔注射DMEM及常山酮50 mg/kg至實驗結(jié)束。

2結(jié)果

2．1常山酮對MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移的影響常山酮(100 nM)顯著抑制了MDA-MB-231細(xì)胞的增殖及遷移能力。見表1。

表1　拉帕替尼、常山酮+拉帕替尼對MDA-MB-231

注：與溶劑組相比，*P<0.05

2．2常山酮對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響常山酮(100 nM)顯著促進了MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡。見圖1及表2。

圖1　2組bax、cleaved-caspase3表達情況

組別Bax/GAPDHCleavedcaspase3/GAPDH溶劑組0.131±0.020.219±0.03常山酮組0.423±0.06*0.691±0.07*

注：與溶劑組相比，*P<0.05

2．3常山酮對MDA-MB-231細(xì)胞向腦部定植能力的影響常山酮(50 mg/kg)抑制了MDA-MB-231向腦部定植能力。見表3。

表3　常山酮對MDA-MB-231向腦部定植

注：與溶劑組相比，#P<0.05

3討論

因存在血腦屏障，目前大多數(shù)抗癌藥物對乳腺癌腦轉(zhuǎn)移無效，目前臨床上多使用全腦放療配合化療的治療方式改善患者神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[6]，療效雖然肯定，但存在復(fù)發(fā)快及化療不良反應(yīng)等問題，導(dǎo)致乳腺癌腦轉(zhuǎn)移患者生存率極低[7]。

乳腺癌細(xì)胞能夠促進基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌量及活性，其能夠溶解組織中及血管的基質(zhì)，進而促進乳腺癌轉(zhuǎn)移；乳腺癌細(xì)胞也能夠促進周圍炎癥細(xì)胞分泌生長轉(zhuǎn)換因子β等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子參與癌細(xì)胞的增殖、分化及遷移和血管新生過程，最終導(dǎo)致乳腺癌轉(zhuǎn)移[8]。常山酮為一種小分子生物堿，國內(nèi)外學(xué)者首先發(fā)現(xiàn)其能夠通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性進而具有抗纖維化的能力，之后又發(fā)現(xiàn)其能夠抑制生長轉(zhuǎn)化因子β下游信號通路作用而廣泛應(yīng)用于抗腫瘤研究[3，9-10]。如上所述，基質(zhì)金屬蛋白酶及生長轉(zhuǎn)化因子β在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中作用巨大。常山酮還被證實能夠通過血腦屏障到達腦內(nèi)，因此常山酮可能為乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的理想藥物之一。

本研究首先利用體外培養(yǎng)的方式，探討常山酮對人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖、遷移及凋亡的影響。本研究發(fā)現(xiàn)常山酮(100 nM)能夠顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖及遷移能力，且顯著下調(diào)了凋亡蛋白bax及cleaved-caspase3的水平，說明常山酮具有抑制乳腺癌發(fā)展的能力；然后采用制作乳腺癌腦轉(zhuǎn)移模型的方法，在將MDA-MB-231細(xì)胞注射至裸鼠外周血中的同時開始對其應(yīng)用常山酮(50 mg/kg)，發(fā)現(xiàn)常山酮能夠顯著減少MDA-MB-231細(xì)胞向腦部的定植作用，提示常山酮可能能夠遷移至腦部、預(yù)防并治療乳腺癌的腦轉(zhuǎn)移。然而常山酮預(yù)防、治療乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的劑量-反應(yīng)關(guān)系、具體分子機制、有無不良反應(yīng)等問題仍需進一步研究。

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(收稿 2016-05-22)

【中圖分類號】R737.9

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)15-0039-02