王宏偉 徐燕 李海龍 陳鳳琴 吳紅彥

摘要：目的 觀察黃芩苷對(duì)胃癌BGC-823、MGC-803細(xì)胞遷移的影響，探討其可能的作用機(jī)制。方法 劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室觀察Toll樣受體（TLR）激活后以及黃芩苷干預(yù)TLR激活后胃癌BGC-823、MGC-803細(xì)胞遷移能力；RT-qPCR和Western blot檢測(cè)胃癌BGC-823、MGC-803細(xì)胞的TLR4、激活蛋白-1（AP-1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果 脂多糖（LPS）可促進(jìn)胃癌BGC-823、MGC-803細(xì)胞遷移，黃芩苷可抑制LPS干預(yù)后胃癌BGC-823、MGC-803細(xì)胞遷移；LPS可上調(diào)TLR4、AP-1、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)，黃芩苷可下調(diào)LPS干預(yù)后胃癌BGC-823、MGC-803細(xì)胞的TLR4、AP-1、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)論 黃芩苷可阻斷TLR4-AP-1-VEGF的激活，從而抑制胃癌BGC-823、MGC-803細(xì)胞的遷移。

關(guān)鍵詞：脂多糖；Toll樣受體；黃芩苷；遷移；胃癌

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.017

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）08-0064-05

炎癥與腫瘤關(guān)系密切，慢性炎癥與25%以上癌癥的發(fā)生相關(guān)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[1]。胃癌的發(fā)生與慢性炎癥密切相關(guān)，“Hp感染-淺表性胃炎-萎縮性胃炎-異型增生-胃癌”是典型的炎癥與癌癥相關(guān)的例子。尋找一種既抗炎又抗腫瘤的藥物是抗腫瘤研究的重要方向。黃芩苷是唇形科

植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根中提取的一種黃酮類化合物。研究表明，黃芩苷有抗腫瘤[2]、抑菌抗炎[3]等藥理作用。脂多糖（LPS）是Toll樣受體（TLR）的外源性配體，能激活TLR的核因子（NF）-κB及激活蛋白-1（AP-1）等信號(hào)通路，引起多種細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[4]。本實(shí)驗(yàn)采用LPS干預(yù)胃癌BGC-823、MGC-803細(xì)胞激活TLR，觀察LPS對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，并用黃芩苷加以干預(yù)，觀察黃芩苷對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，初步探討其可能的作用機(jī)制，為黃芩苷治療炎癥相關(guān)性腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株

胃癌MGC-803、BGC-823細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.2 藥物與試劑

黃芩苷，南京狄爾格醫(yī)療器械有限公司，CAS號(hào)21967-41-9。高糖DMED培養(yǎng)基，健順生物公司；胎牛血清（FBS），杭州四季青公司；Maker和Transwell小室，Thermo scientific公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒，大連寶生物公司，引物均由大連寶生物公司合成；一抗TLR4、AP-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）購(gòu)自Affinity公司，二抗購(gòu)自碧云天公司。

1.3 主要儀器

光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司），超凈工作臺(tái)（蘇靜安泰），CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司），微量移液槍（日本立洋），TGL-16G離心機(jī)（上海醫(yī)療器械七廠），低溫離心機(jī)（Beckman公司），電泳儀（北京六一儀器廠），微量上樣器（上海生工生物工程有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%FBS高糖DMEM，加青霉素、鏈霉素（100 U/mL），37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)胃癌MGC-803、BGC-823細(xì)胞。每隔2 d換完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)按1∶2比例傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于預(yù)先底部畫線的6孔板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至滿，用10 μL無菌槍頭垂直于底部劃線性劃痕，PBS漂洗3次去除脫落細(xì)胞，再用無血清培養(yǎng)液[分為對(duì)照組（只加培養(yǎng)液）、LPS組（1、10、100、1000、10 000 ng/mL）、黃芩苷40 μmol/L+LPS 1000 ng/mL組]干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)。劃痕后0、12、24、36 h隨機(jī)選擇劃痕區(qū)3個(gè)視野拍照，比較各組間劃痕愈合的差異，用愈合率代表細(xì)胞遷移能力。計(jì)算細(xì)胞愈合率[（愈合前細(xì)胞間空白區(qū)域面積-愈合后細(xì)胞間空白區(qū)域面積）÷愈合前細(xì)胞間空白區(qū)域面積×100%]。

2.3 Transwell小室實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞饑餓12 h后，按5×105個(gè)/mL細(xì)胞的密度接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)的Transwell小室中，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，吸出小室中培養(yǎng)液，換新的無血清培養(yǎng)基[分為對(duì)照組（只加培養(yǎng)液）、LPS組（1000 ng/mL）、黃芩苷40 μmol/L+LPS 1000 ng/mL組]繼續(xù)培養(yǎng)，在下室中加600 μL含25%FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，經(jīng)PBS洗滌，甲醛固定，甲醇滲透，結(jié)晶紫染色后鏡下選3個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)，取其平均值，以穿過小室細(xì)胞數(shù)代表細(xì)胞的遷移能力。

2.4 RT-qPCR檢測(cè)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胃癌MGC-803、BGC-823細(xì)胞分為對(duì)照組（只加培養(yǎng)液）、LPS組（1000 ng/mL）、黃芩苷40 μmol/L+LPS 1000 ng/mL組，干預(yù)24 h，提取各組總RNA，37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃反轉(zhuǎn)錄成cDNA；95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，65 ℃、30 s，經(jīng)過40個(gè)循環(huán)，cDNA擴(kuò)增，檢測(cè)TLR4、AP-1、VEGF mRNA表達(dá)。PCR反應(yīng)結(jié)束后分析融解曲線，從而判定擴(kuò)增產(chǎn)物是否有非特異性擴(kuò)增；分析擴(kuò)增曲線，計(jì)算Ct值，采用2?ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.5 Western blot檢測(cè)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胃癌MGC-803、BGC-823細(xì)胞分為對(duì)照組（只加培養(yǎng)液）、LPS組（1000 ng/mL）、黃芩苷（40 μmol/L）+LPS（1000 ng/mL）組干預(yù)24 h，加入蛋白裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）提取總蛋白，將蛋白煮沸變性后，經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白分離，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，一抗（TLR4、AP-1、VEGF、GAPDH）孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，加入ECL于Bio-rad凝膠成像儀中進(jìn)行反應(yīng)，采用Image J軟件對(duì)Western blot結(jié)果進(jìn)行定量分析，灰度值以累積吸光度值表示，結(jié)果以目的蛋白與GAPDH累積吸光度的比值表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)意義。

4 結(jié)果

4.1 劃痕實(shí)驗(yàn)黃芩苷對(duì)胃癌MGC-803、BGC-823細(xì)胞遷移能力的影響

與對(duì)照組比較，LPS組劃痕愈合程度明顯高于對(duì)照組，并隨濃度的增大，愈合程度也逐漸增強(qiáng)，其中，1000 ng/mL LPS組愈合程度最強(qiáng)，24 h時(shí)效果最明顯，見圖1、圖2。根據(jù)以上結(jié)果，選用1000 ng/mL LPS作為L(zhǎng)PS組。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果，選用40 μmol/L黃芩苷干預(yù)作為黃芩組。繼續(xù)用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察黃芩苷對(duì)LPS干預(yù)后2株胃癌細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS+黃芩苷組較LPS組愈合程度慢，差異有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.01），見圖3、圖4。

4.2 Transwell實(shí)驗(yàn)黃芩苷對(duì)胃癌MGC-803、BGC-823細(xì)胞遷移能力的影響

選用1000 ng/mL LPS作為L(zhǎng)PS組，選用40 μmol/L黃芩苷干預(yù)作為黃芩苷組，繼續(xù)用Transwell實(shí)驗(yàn)觀察黃芩苷對(duì)胃癌MGC-803、BGC-823細(xì)胞遷移能力的影響。與對(duì)照組比較，LPS組2株細(xì)胞穿過小室細(xì)胞數(shù)較多（P<0.01）；與LPS組比較，LPS+黃芩苷組穿過小室細(xì)胞數(shù)較少（P<0.01），見圖5、圖6。

4.3 黃芩苷對(duì)Toll樣受體4、激活蛋白-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，LPS組TLR4、AP-1、VEGF mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.01）；與LPS組比較，LPS+黃芩苷組TLR4、AP-1、VEGF mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.01）。結(jié)果見圖7、圖8。

4.4 黃芩苷對(duì)Toll樣受體4、激活蛋白-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，LPS組TLR4、AP-1、VEGF蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01）；與LPS組比較，LPS+黃芩苷組TLR4、AP-1、VEGF蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見圖9、圖10。

5 討論

近年來大量的實(shí)驗(yàn)表明，炎癥不僅與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，與腫瘤轉(zhuǎn)移也密切相關(guān)，在這個(gè)領(lǐng)域目前已取得一些初步成果，如versican-TLR2-TNFα、RANKL-RANK-IKKFα-Maspin通路等[5]。

目前中藥成分抗腫瘤的研究已成為熱點(diǎn)。杜氏等[6]報(bào)道雷公藤紅素抑制HepG2細(xì)胞的遷移，朱氏等[7]研究痰瘀同治方藥物血清有影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的作用。我們的前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可通過死亡受體通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移[8]。

LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，在慢性炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谟肔PS營(yíng)造一個(gè)腫瘤的炎性微環(huán)境，觀察LPS是否促進(jìn)胃癌MGC-803、BGC-823細(xì)胞遷移以及黃芩苷是否抑制炎性微環(huán)境胃癌細(xì)胞的遷移。本研究通過劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室實(shí)驗(yàn)證實(shí)了LPS可促進(jìn)以上2株胃癌細(xì)胞的遷移，且發(fā)現(xiàn)黃芩苷可抑制LPS干預(yù)的胃癌MGC-803、BGC-823細(xì)胞遷移。研究發(fā)現(xiàn)，LPS與TLR4結(jié)合后可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、VEGF及白細(xì)胞介素-8，同時(shí)LPS可使肺癌細(xì)胞的VEGF表達(dá)升高，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[9]。本研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。

Qian等[10]研究顯示，LPS可激活膀胱癌細(xì)胞的TLR4 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活MAPK。Ouyang等[11]進(jìn)一步研究表明，MAPK可激活A(yù)P-1，AP-1以由c-Jun、c-Fos和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域形成的異源二聚體的形式存在于細(xì)胞中，在腫瘤的發(fā)生和演進(jìn)過程中起關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，且VEGF基因啟動(dòng)子中含有多個(gè)AP-1結(jié)合位點(diǎn)，活化的AP-1可以通過VEGF促使腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移。因此，可以認(rèn)為L(zhǎng)PS激活腫瘤細(xì)胞的TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活MAPK，從而激活A(yù)P-1，最終激活VEGF，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

Feng等[12]研究顯示，黃芩苷可下調(diào)TLR4表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS干預(yù)的2株胃癌細(xì)胞TLR4、AP-1、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高，而黃芩苷可下調(diào)LPS干預(yù)后的TLR4、AP-1、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)。由此可以認(rèn)為，黃芩苷可能通過抑制LPS與TLR4的結(jié)合，從而抑制MAPK激活A(yù)P-1，抑制VEGF表達(dá)，進(jìn)而抑制2株胃癌細(xì)胞的遷移。

本實(shí)驗(yàn)只觀察LPS及黃芩苷對(duì)胃癌MGC-803、BGC-823細(xì)胞遷移的影響及可能的作用機(jī)制，其對(duì)2株胃癌細(xì)胞侵襲的影響尚未可知，需進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)觀察驗(yàn)證。

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