李強，金約朋，白永愉，黃新策，周蒙滔

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·論著 基礎研究·

區(qū)域動脈灌注5-FU改善大鼠重癥急性胰腺炎相關的肺損傷

李強1，金約朋2，白永愉1，黃新策1，周蒙滔2

（1.溫州醫(yī)科大學 第一臨床醫(yī)學院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，浙江溫州 325000）

［摘 要］目的 研究區(qū)域動脈灌注（regional arterial infusion，RAI）5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）對大鼠重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）相關的急性肺損傷（acute lung injury，ALI）的作用及其可能的機制。方法 36只健康成年雄性SD大鼠隨機分成3組：對照組（C組）、胰腺炎組（SAP組）、區(qū)域動脈灌注5-FU治療組（5-FU組）。逆行胰膽管注射5%?；悄懰徕c（1 mL/kg）建立SAP模型。5-FU組在誘導SAP模型后立即行區(qū)域動脈灌注5-FU（40 mg/kg）治療，C組和SAP組區(qū)域動脈灌注等量的生理鹽水。建模成功后分別于12、24 h取標本并處死大鼠，胰腺和肺臟組織送病理學檢查，檢測肺組織濕干比，肺組織髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性，血淀粉酶和血中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。結果 與C組比較，SAP組與5-FU組血淀粉酶、血中促炎細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）、肺組織濕干比、肺組織MPO均顯著升高（P＜0.05）；與SAP組比較，5-FU組上述指標均顯著下降（P＜0.05）。光鏡下可見SAP組出現(xiàn)明顯的肺損傷，5-FU區(qū)域灌注治療后肺損傷減輕，病理學評分下降。結論 區(qū)域動脈灌注5-FU對大鼠重癥急性胰腺炎相關的急性肺損傷有改善作用，其作用機制可能與抑制促炎細胞因子的過度表達有關。

［關鍵詞］重癥急性胰腺炎；急性肺損傷；5-氟尿嘧啶；區(qū)域動脈灌注；細胞因子；大鼠

重癥急性胰腺炎（SAP）并發(fā)癥率和死亡率高，急性肺損傷（ALI）是其中比較常見的并發(fā)癥，與炎癥介質的過度激活有密切的關系。臨床上，5-FU治療SAP取得了值得肯定的療效，但其對SAP相關的ALI未見文獻報道。本實驗通過建立大鼠SAP相關的ALI模型，觀察5-FU對SAP大鼠急性肺損傷的治療效果，并探討其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

清潔級健康成年雄性SD大鼠，體重250～300 g，購于溫州醫(yī)科大學實驗動物中心。5-FU注射液（天津金耀氨基酸有限公司）；?；悄懰徕c（美國Sigma公司）；亞甲蘭染色液，HE染色劑和水合氯醛（北京索萊寶科技有限公司）；PE10導管（寧波安萊軟件與器械有限公司）；大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒（美國eBioscience公司）；MPO試劑盒（南京建成生物工程所）。

1.2 動物分組與模型

雄性SD大鼠36只，術前禁食12 h，不禁水。隨機分成三組（n=12），每組又分成12 h和24 h兩個亞組（n=6）。（1）C組：常規(guī)10%水合氯醛溶液（3 mL/kg），腹部皮下注射麻醉后開腹，僅翻動胰腺后關腹。（2）SAP組：依照Aho法［1］建立大鼠SAP模型。應用微泵逆行胰管內注射5%?；悄懰徕c以0.1 mL/min的速度，劑量1 mL/kg。（3）5-FU組：同上SAP制模后，胃左動脈插管亞甲蘭染色確定導管位置［2］后行5-FU區(qū)域動脈灌注，5-FU動脈灌注劑量40 mg/kg，灌注速度6.0 mL/h。C組和SAP組給予動脈灌注等量的生理鹽水。大鼠清醒后自由飲水，禁食。

1.3 標本采集及指標檢測

各組建模后12和24 h，分別再次麻醉大鼠，抽血、取標本，檢測如下指標：（1）采用全自動生化儀（日本日立7600）檢測血清淀粉酶；（2）采用ELISA法檢測血清中的細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平；（3）采集右肺上葉用生理鹽水洗凈后在濾紙上吸干水分并稱重，記錄肺濕重。后置于80 ℃電熱恒溫干燥箱中烘烤72 h，再次稱重，記錄肺干重。肺組織濕干比計算公式：［（肺濕重-肺干重）/肺干重×100%］。（4）采集左肺制成肺組織勻漿，離心取上清液用于檢測MPO活性。（5）取部分胰腺、肺組織置于4%多聚甲醛溶液中固定用于HE染色，觀察肺、胰腺組織改變。胰腺組織按照Schmidt標準［3］，即根據(jù)胰腺間質水腫、腺泡細胞壞死、出血和脂肪壞死、炎癥細胞浸潤進行評分，每項按照嚴重程度分別評分為0～4分。肺組織按照Osman標準［4］，根據(jù)肺水腫和炎癥細胞的浸潤程度進行評分，每項按照嚴重程度分別評分為0～3分。由有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師雙盲進行病理評分。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 胰腺組織光鏡觀察

C組大鼠胰腺鏡下結構基本正常（圖1，C組）。SAP組胰腺腺體結構紊亂，腺泡細胞腫脹，葉間隙增寬，可見灶性壞死，壞死區(qū)內腺泡結構消失，部分腺泡細胞空泡化，伴有炎癥細胞浸潤，24 h組腺泡結構破壞更加嚴重，炎癥細胞浸潤更加明顯（圖1，SAP組）。5-FU組與SAP組比較，胰腺間質水腫、胰腺腺泡細壞死、炎癥細胞浸潤均明顯減輕（圖1，5-FU組）。

2.2 肺組織光鏡觀察

C組大鼠肺組織鏡下結構基本正常（圖2，C組）。SAP組肺組織鏡下可見肺泡和間質水腫、出血，肺泡間隔增寬或塌陷，大量炎性細胞浸潤及紅細胞滲出，肺組織結構紊亂，24 h組以上改變更加明顯（圖2，SAP組）。5-FU組與SAP組比較肺間質水腫、紅細胞滲出及炎細胞浸潤均減輕（圖2，5-FU組）。

圖1　大鼠胰腺組織HE染色（×400）

表1　各組胰腺和肺病理學評分（ ±s）表示

圖2　大鼠肺組織HE染色（×400）

2.3 胰腺和肺組織的病理學評分

SAP組胰腺和肺的病理學評分最高，胰腺和肺的病理損害嚴重。區(qū)域動脈灌注5-FU后，胰腺和肺的病理損害程度減輕、病理學評分減少（P＜0.05）。具體見表1。

2.4 各組血淀粉酶、血清中促炎細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）含量、肺組織濕干比、肺組織MPO活性改變

血淀粉酶SAP組與5-FU組在12 h和24 h均較對照組明顯升高（P＜0.05）。區(qū)域動脈灌注5-FU治療后血清中促炎細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）、肺組織濕干比。中性粒細胞浸潤指標MPO較SAP組均明顯下降，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。具體見表2、表3。

表2　12 h各組血淀粉酶、TNF-α、IL-1β、IL-6的含量、肺組織濕干比、肺組織MPO活性改變

表3　24 h各組血淀粉酶、TNF-α、IL-1β、IL-6的含量、肺組織濕干比、肺組織MPO活性改變

3 討論

重癥急性胰腺炎（SAP）發(fā)生時，胰腺壞死物質吸收入血，刺激炎癥細胞分泌的炎癥介質如TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應，導致全身炎癥反應綜合征（SIRS），嚴重的可導致多臟器功能衰竭（MODS），是SAP致死的主要原因［5］。其中肺損傷是SAP中最易發(fā)生也是最危險的的胰外器官損傷［6］，目前認為與炎癥細胞的浸潤和高濃度的炎癥介質導致的肺血管損傷有密切的關系。本實驗通過逆行胰膽管注射牛磺膽酸鈉成功建立SAP相關的急性肺損傷模型，具體改變如下：胰腺組織病理呈典型的SAP改變，同時伴有血淀粉酶升高，肺組織病理可見肺間質水腫、肺泡間隔增寬，炎性細胞浸潤及紅細胞滲出。

RAI通過動脈導管灌注藥物，使其直接到達病變部位，有效提高藥物在胰腺的濃度，并延長藥物在胰腺的接觸時間，而外周血漿藥物濃度增加并不明顯，從而提高療效而減少藥物的毒副作用［7-9］。

自從上世紀70年代，5-FU就被用于治療急性胰腺炎［10-11］。長期以來，5-FU被認為可干擾DNA和RNA的合成，抑制胰腺腺泡細胞合成和胰淀粉酶和胰蛋白酶的分泌［11］。關于5-FU治療急性胰腺炎的機制的探討，涉及多方面：一項研究表明5-FU確能誘導LPS激活的大鼠巨噬細胞凋亡［12］；也有研究表明區(qū)域動脈灌注5-FU對急性壞死性大鼠胰腺微循環(huán)缺血起到改善作用［13］；近年來有研究認為5-FU可阻斷某些炎癥介質的作用［14-15］，5-FU可抑制過高的促炎細胞因子和抗炎細胞因子的水平，使炎癥反應維持在一個較低的水平，既防止急性胰腺炎早期的免疫過激狀態(tài)，又有效地避免急性胰腺炎中后期的免疫抑制［16］。同時我們前期的研究也顯示，5-FU聯(lián)合奧曲肽對治療犬急性胰腺炎起到良好的治療效果［17］。

已有研究證實急性胰腺炎發(fā)病初期的胰腺損傷啟動機體過度炎癥反應，釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細胞因子，誘發(fā)免疫細胞的過激狀態(tài)，是誘導ALI發(fā)生的主要原因之一［18-21］。本研究結果顯示，5-FU區(qū)域動脈灌注組與SAP組比較，大鼠血中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量降低顯著，胰腺和肺病理損害減輕顯著，說明通過區(qū)域動脈灌注5-FU治療SAP相關的ALI效果明顯。本實驗評價肺損傷的指標除肺病理學檢查外還包括：肺濕干比，肺組織MPO。其中肺濕干比作為肺部滲出指標，反映了肺水腫的程度。誘導SAP后肺濕干比上升，在區(qū)域動脈灌注5-FU治療后出現(xiàn)下降，提示5-FU減輕了肺水腫。在ALI中，中性粒細胞的積聚起到了重要的作用，大量的中性粒細胞激活后會導致炎癥級聯(lián)反應，嚴重的會出現(xiàn)呼吸窘迫綜合征。肺組織MPO反映了肺組織內中性粒細胞的數(shù)量，5-FU治療后MPO的減少提示中性粒細胞在肺組織內積聚減少。

綜上所述，本實驗結果表明區(qū)域動脈灌注5-FU對大鼠SAP相關的ALI起到治療作用，降低了血淀粉酶和血中促炎細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）濃度，減少了中性粒細胞在肺組織內的過度積聚，減輕肺損傷，其主要機制可能與抑制促炎細胞因子的過度表達有關。

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（本文編輯：魯翠濤）

·論著 基礎研究·

［中圖分類號］R576

［文獻標識碼］A

Doi:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.04.007

［收稿日期］2015-11-18

［基金項目］浙江省自然科學基金項目（LY12H03007）；國家自然科學基金項目（81370563）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生重大科技計劃項目（WKJ2012-2-033）；省科技廳公益性應用項目（2012C23108）；溫州市科技局項目（H20110016）。

［第一作者簡介］李強（1990-），男，安徽阜陽人，在讀碩士。

［通訊作者簡介］周蒙滔，主任醫(yī)師，博士生導師，E-mail：zmt0417@hotmail.com。and the 5-FU group increased significantly （P＜0.05）. However， compared with the SAP group at 12 and 24 h，all those parameters were attenuated in the 5-FU group （P＜0.05）. Acute lung injury was observed in SAP group under light microscope. The RAI with 5-FU attenuated the SAP associated acute lung injury and decreased the pathological scores of lungs. Conclusion 5-FU has beneficial effects on SAP associated acute lung injury in rats，which mechanism possibly involves the alleviation the overexpression of proinflammatory cytokines.

Regional arterial infusion with 5-fluorouracil attenuates acute pancreatitis associated lung in-jury in rats model

LI Qiang1， JIN Yu
e-peng2， BAI Yong-yu1， HUANG Xin-che1， ZHOU Meng-tao2. 1The First Clinical Medical College， Wenzhou Medical University， Wenzhou， Zhejiang 325035， China；2Department of Hepatobiliary Surgery， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University ， Wenzhou， Zhejiang 325000，China

Abstractobjective To assess the effects of 5-fluorouracil （5-FU） administered with regional arterial infusion （RAI） on severe acute pancreatitis （SAP） associated acute lung injury （ALI） in rats and to explore the underlying mechanisms. Methods Thirty-six male Sprague-Dawley （SD） rats were randomly divided into 3 groups: control group （C group）， severe acute pancreatitis group （SAP group）， and 5-FU administered with regional arterial infusion group （5-FU group）. SAP model was induced by 5% sodium taurocholate （1 mL/kg） injected into the pancreatic duct. 5-FU （40 mg/kg） was immediately administered with RAI to the 5-FU group following the establishment of the SAP model. Saline was administered the same way to other two groups. The pathological changes in the pancreas and lungs were observed and scored. Serum amylase activity， lung wet/dry weight ratio，lung myeloperoxidase （MPO） activity， and the level of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）and interleukin-6 （IL-6） in the serum were measured at 12 h and 24 h following the induction of SAP. Results Compared with the control group， the serum amylase activity， the levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in the serum，lung wet/dry weight ratio， lung MPO activity， as well as the pathological scores of lungs for both the SAP group

Key wordssevere acute pancreatitis； acute lung injury； 5-fluorouracil； regional arterial infusion； cytokines；rats