丁美云，詹江華，趙麗，趙林勝，張愛華

TGF-β1、Smad2在膽道閉鎖肝纖維化中的作用

丁美云1，詹江華2△，趙麗2，趙林勝2，張愛華2

摘要:目的研究轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1與Smad2蛋白在膽道閉鎖（BA）肝組織中的表達(dá)情況及在肝纖維化進(jìn)程中的作用。方法選取2010年1月—2014年7月尸檢（患兒死于非肝膽疾病，正常對(duì)照組）5例，膽管擴(kuò)張癥肝活檢（膽擴(kuò)組）10例，BA肝活檢（早期肝纖維化組）19例，BA晚期進(jìn)行肝移植患者自體肝活檢（晚期肝硬化組）11例，采用HE染色觀察并評(píng)價(jià)肝標(biāo)本纖維化程度，免疫組化染色檢測(cè)TGF-β1與Smad2蛋白在肝組織中的表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）方法檢測(cè)肝組織中TGF-β1與Smad2基因表達(dá)情況。結(jié)果 （1）HE。正常對(duì)照組肝組織無膠原纖維增生，膽擴(kuò)組有輕度纖維細(xì)胞增生，早期肝纖維化組膠原纖維增生、橋接纖維化現(xiàn)象顯著，而晚期肝硬化組假小葉顯著。（2）免疫組化。TGF-β1蛋白平均光密度值在早期肝纖維化組表達(dá)最高（P<0.05）；Smad2蛋白在4組間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（3）qRT-PCR。膽擴(kuò)組、早期肝纖維化組和晚期肝硬化組3組肝內(nèi)TGF-β1、Smad2 mRNA含量比較早期肝纖維化組均最高（P<0.017）。結(jié)論BA肝纖維化早期TGF-β1、Smad2促進(jìn)纖維化至門管區(qū)-門管區(qū)（P-P）、門管區(qū)-中央靜脈（P-C）型橋樣結(jié)構(gòu)形成；隨著纖維化程度加重，TGF-β1、Smad2表達(dá)促纖維化作用逐漸減弱。

關(guān)鍵詞：膽道閉鎖；肝硬化；轉(zhuǎn)化生長因子β1；Smad2蛋白質(zhì)；肝纖維化

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81570471）；天津市衛(wèi)生行業(yè)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（14KG129）；天津市衛(wèi)生局科技基金資助項(xiàng)目（2014KR09）

作者單位：1天津醫(yī)科大學(xué)研究生院（郵編300070）；2天津市兒童醫(yī)院

作者簡介：丁美云（1988），女，碩士在讀，主要從事小兒普通外科、膽道閉鎖方面研究

△

通訊作者E-mail:zhanjianghuatj@163.com

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是危及嬰幼兒生命的肝膽系統(tǒng)疾病，發(fā)病率為1/8 000～1/5 000，以膽道閉塞、進(jìn)行性肝纖維化為特征，最終進(jìn)展為肝硬化、肝衰竭，是嬰幼兒時(shí)期肝移植的主要指征［1-2］。轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1蛋白能夠調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞生長、分化、凋亡，Smad2蛋白是TGF-β1/Smads促纖維化通路的重要因子，TGF-β1/Smads促纖維化通路在BA肝纖維化進(jìn)程中起重要作用［3］。宋亭亭等［4］證明BA患兒肝內(nèi)TGF-β1蛋白含量在肝門-空腸吻合術(shù)（Kasai手術(shù)）時(shí)期高于肝移植期。但這兩種蛋白在BA肝纖維化進(jìn)展中的作用尚不明確，本研究通過檢測(cè)TGF-β1、Smad2蛋白和基因水平的表達(dá)，探討兩者在BA肝纖維化進(jìn)展中的作用和臨床意義。

1　資料與方法

1.1標(biāo)本來源與分組肝組織標(biāo)本來自天津市兒童醫(yī)院2010年1月—2014年7月間尸檢5例，病例死于非肝膽疾病，為正常對(duì)照組；膽管擴(kuò)張患兒10例（膽擴(kuò)組）；BA患兒19例，為Kasai術(shù)時(shí)所取肝活檢組織，患兒肝內(nèi)纖維組織增生、門管區(qū)增寬最終形成大量門管區(qū)-門管區(qū)（P-P）、門管區(qū)-中央靜脈（P-C）型纖維間隔，無明確假小葉出現(xiàn)，將其定為早期肝纖維化組；天津市第一中心醫(yī)院2013年1月—2014年1月BA晚期肝硬化行肝移植患者自體肝活檢組織11例，患兒肝內(nèi)出現(xiàn)假小葉、間質(zhì)內(nèi)纖維瘢痕逐漸嚴(yán)重，定為晚期肝硬化組；患兒基本情況見表1。本研究經(jīng)天津市兒童醫(yī)院及天津市第一中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過。

Tab.1　General condition in four groups of patients表1　各組患兒一般情況

1.2主要試劑與儀器兔抗人TGF-β1一抗（1∶100），兔抗人Smad2一抗（1∶200），二抗為辣根酶標(biāo)記的羊抗兔聚合物，均購自北京博奧生物技術(shù)有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，見表2。主要儀器：IQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國Bio?Rad公司），手執(zhí)式組織勻漿機(jī)（德國IKA公司）。FastQuant RT Kit（With gDNase）、TRIzol（天根生化公司），SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本處理術(shù)中取各組患兒肝右葉前緣為活檢標(biāo)本，部分置無菌EP管中儲(chǔ)存在-80℃冰箱，用于qRT-PCR檢測(cè)；部分用10%福爾馬林溶液固定8～24 h后經(jīng)石蠟包埋儲(chǔ)存，所有過程均處于同一實(shí)驗(yàn)條件。正常對(duì)照組沒有肝活檢組織，未進(jìn)行TGF-β1、Smad2的qRT-PCR檢測(cè)。

Tab.2　The base sequences of primers for qRT-PCR about TGF-β1 and Smad2表2TGF-β1、Smad2引物序列

1.3.2HE及免疫組化染色將已包埋肝臟蠟塊切成4 μm厚切片分別經(jīng)HE、免疫組化染色（采用S-P兩步法），由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生在100倍、400倍光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織細(xì)胞發(fā)育、肝纖維化程度。免疫組化陽性標(biāo)準(zhǔn)［5］：（1）定性分析，根據(jù)染色強(qiáng)度分為無棕黃色（陰性）、淡棕黃色（弱陽性）、棕黃色（陽性）、棕褐色（強(qiáng)陽性）。（2）半定量分析，根據(jù)肝組織切片內(nèi)陽性細(xì)胞總光密度值/陽性細(xì)胞所占面積求得平均光密度值（AOD）。每張切片內(nèi)讀取任意5張視野，用同一計(jì)算機(jī)成像系統(tǒng)留取相同倍數(shù)顯微鏡下圖片，圖像分析軟件IPP 6.0分析每張圖片，計(jì)算TGF-β1、Smad2蛋白的AOD。

1.3.3qRT-PCR取肝組織按照 TRIzol法研磨提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后合成cDNA。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μL 2×SuperReal PreMix，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，無酶水補(bǔ)足到20 μL。95℃預(yù)變性15 min，95℃變性10 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。分別測(cè)定樣本內(nèi)參（GAPDH）、TGF-β1、Smad2基因擴(kuò)增的Ct值，重復(fù)3次，取3次結(jié)果平均值為最終Ct值；ΔCt=每個(gè)基因Ct值-內(nèi)參Ct；樣本基因相對(duì)定量=2-ΔCt。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用方差分析，多重比較用Bonferroni法；非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)及四分位數(shù)間距［M（Q）］表示，組間比較使用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，多重比較用Bonferroni法進(jìn)行顯著性水平校正。相關(guān)性分析進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組肝纖維化程度正常對(duì)照組肝組織內(nèi)細(xì)胞胞質(zhì)清亮、排列緊密，纖維細(xì)胞少見，無纖維組織增生。膽擴(kuò)組肝內(nèi)細(xì)胞胞質(zhì)微著色，門管區(qū)少許纖維組織增粗。早期肝纖維化組肝內(nèi)細(xì)胞變性，胞質(zhì)著色較重，炎細(xì)胞、纖維細(xì)胞大量增生，纖維組織大量增粗、橋接纖維化。晚期肝硬化組HE染色見肝內(nèi)細(xì)胞壞死、再生，假小葉明顯，見圖1。

2.2肝內(nèi)TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)水平比較免疫組化染色結(jié)果顯示TGF-β1蛋白在早期肝纖維化組表達(dá)高于其他3組（P＜0.05），4組Smad2蛋白半定量結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

A：正常對(duì)照組；B：膽擴(kuò)組；C：早期肝纖維化組；D：晚期肝硬化組；箭頭所指為纖維組織Fig.1　Comparison of hepatic fibrosis between four groups圖1　各組肝纖維化程度比較（HE，×100）

Tab.3　The IHC result showing expressions of TGF-β1 and Smad2 in different groups表3　各組肝組織TGF-β1、Smad2免疫組化染色結(jié)果

2.3肝內(nèi)TGF-β1、Smad2 mRNA表達(dá)水平比較早期肝纖維化組TGF-β1、Smad2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平高于膽擴(kuò)組和晚期肝硬化組（P<0.017），見表4。早期肝纖維化組TGF-β1、Smad2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈正相關(guān)（rs=0.71，P<0.05）。

3　討論

BA患兒常因肝內(nèi)各級(jí)膽管增生、梗阻伴隨進(jìn)行性肝纖維化最終形成肝硬化而危及生命，Kasai手術(shù)可以解決肝門部膽管暫時(shí)性通暢，但是無法終止肝臟纖維化［6］。國外研究認(rèn)為TGF-β1促纖維化通路是促進(jìn)BA肝纖維化進(jìn)展的重要因素，TGF-β1、 Smad2是促纖維化通路蛋白，在BA肝纖維化進(jìn)展中起到一定的作用，但其作用機(jī)制尚不十分清晰［7］。本研究通過檢測(cè)TGF-β1、Smad2在BA肝內(nèi)表達(dá)情況，探討其與BA肝纖維化進(jìn)展的關(guān)系。

Tab.4　Comparison of expression levels of TGF-β1 mRNA and Smad2 mRNA between three groups表4各組TGF-β1、Smad2 mRNA相對(duì)含量比較

3.1TGF-β1、Smad2促進(jìn)BA早期肝纖維化本研究HE鏡下可見BA早期肝纖維化組肝內(nèi)門管區(qū)擴(kuò)大、纖維組織增生形成纖維間隔，纖維化逐漸加重至P-P、P-C型橋接纖維化，同時(shí)早期肝纖維化組TGF-β1 mRNA表達(dá)水平高于膽擴(kuò)組和晚期肝硬化組，高表達(dá)的TGF-β1 mRNA促進(jìn)TGF-β1蛋白的產(chǎn)生與分泌，導(dǎo)致TGF-β1蛋白表達(dá)明顯升高，Smad2 mRNA同樣在早期肝纖維化組含量最高，與TGF-β1 mRNA有較高相關(guān)性，然而Smad2蛋白表達(dá)水平在各組間無明顯差異。Gaarenstroom等［8-10］研究認(rèn)為Smad2蛋白以單體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，在TGF-β1蛋白激活下發(fā)生磷酸化，磷酸化的Smad2形成特定絡(luò)合物向細(xì)胞核移動(dòng)，在細(xì)胞核內(nèi)啟動(dòng)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白等相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)促纖維化基因轉(zhuǎn)錄速度，繼而磷酸化的Smad2發(fā)生去磷酸化作用返回細(xì)胞質(zhì)，在胞質(zhì)與胞核之間穿梭傳遞促纖維化信號(hào)，最終促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白生成，激活肝星形細(xì)胞、活化肌成纖維化細(xì)胞，從而促進(jìn)肝纖維化。BA肝內(nèi)伴隨TGF-β1蛋白增多，Smad2蛋白在胞質(zhì)與胞核之間“磷酸化與非磷酸化”循環(huán)效率升高導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄速度的加快，可能是Smad2蛋白促纖維化的方式。Vrljicak等［11］研究TGF-β1/Smads在腎纖維化中作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，腎小球內(nèi)Smad2蛋白表達(dá)情況與其mRNA含量不一致，Smad2 mRNA表型特征影響Smad2 mRNA翻譯為Smad2蛋白。這可能也是BA肝內(nèi)Smad2 mRNA高表達(dá)而Smad2蛋白無明顯增高現(xiàn)象的一個(gè)原因，需要進(jìn)一步研究。在BA肝纖維化早期，TGF-β1、Smad2 mRNA共同升高，升高的TGF-β1 mRNA調(diào)控TGF-β1蛋白含量增多，TGF-β1蛋白加快Smad2蛋白磷酸化從而加快促纖維化信號(hào)傳遞，促進(jìn)ECM等生成從而加重BA肝纖維化。

3.2TGF-β1、Smad2在BA晚期肝硬化時(shí)表達(dá)減弱本研究HE鏡下可見BA晚期肝硬化時(shí)假小葉遍布、肝細(xì)胞不斷增生，而肝內(nèi)TGF-β1蛋白平均光密度值及其mRNA含量不斷下降，這表明BA肝硬化期TGF-β1 mRNA的轉(zhuǎn)錄受到抑制，其含量減少、促纖維化作用減弱。Smad2蛋白含量在肝纖維化進(jìn)程中沒有變化，在晚期肝硬化時(shí)期伴隨TGF-β1蛋白減少其磷酸化速率減慢、促纖維化作用減弱。宋亭亭等［4］認(rèn)為BA患兒肝硬化時(shí)期由于肝內(nèi)纖維組織增生、血運(yùn)紊亂等導(dǎo)致TGF-β1蛋白大量減少，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

綜上所述，TGF-β1、Smad2協(xié)同促進(jìn)BA早期肝纖維化至P-P、P-C型橋接結(jié)構(gòu)形成；到了晚期肝硬化時(shí)TGF-β1、Smad2 mRNA表達(dá)減少導(dǎo)致TGF-β1蛋白表達(dá)減弱，兩者促纖維化作用減輕。同時(shí)，本研究推測(cè)Smad2蛋白通過“磷酸化-去磷酸化”循環(huán)效率影響B(tài)A肝內(nèi)TGF-β1通路的促纖維化作用，這需要建立BA小鼠模型進(jìn)行體外抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，干擾Smad2磷酸化過程可能在BA肝纖維化早期阻斷TGF-β1促纖維化通路，從而終止肝纖維化進(jìn)程。

參考文獻(xiàn)

［1］Salzedas-Netto AA，Chinen E，de Oliveira DF，et al.Grade IV fibrosis interferes in biliary drainage after kasai procedure［J］.Transplant Proc，2014，46（6）：1781-1783.doi：10.1016/j.transproceed.2014.05.045.

［2］Zhan JH，Chen YJ.How to evaluate the diagnosis and management of biliary atresia in the era of liver transplantation［J］.Chin J Pediat Surg，2014，35（4）：245-247.［詹江華，陳亞軍.肝移植時(shí)代如何看待膽道閉鎖的診治［J］.中華小兒外科雜志，2014，35（4）：245-247］.doi：10.3760/cma.j.issn.0253-3006.2014.04.003.

［3］Iordanskaia T，Hubal MJ，Koeck E，et al.Dysregulation of upstream and downstream transforming growth factor-β transcripts in livers of children with biliary atresia and fibrogenic gene signatures［J］.J Pediatr Surg，2013，48（10）：2047-2053.doi：10.1016/j. jpedsurg.2013.03.047.

［4］Song TT，Zhan JH，Gao W，et al.Expression of CD14，CD34 and transforming growth factor-β1 in the liver biopsy of biliary atresia ［J］.Chin J Pediat Surg，2015，36（1）：24-28.［宋亭亭，詹江華，高偉，等.膽道閉鎖肝組織CD14、CD34、TGF-β1表達(dá)研究［J］.中華小兒外科雜志，2015，36（1）：24-28］.doi：10.3760/cma.j. issn.0253-3006.2015.01.015.

［5］Jiang Y，Jin XM，Tu K.A primary study using the method of average positive stained area percentage to measure the immunohistochemistry results［J］.Journal of Biomedical Engineering，2007，24（3）：650-653.［姜洋，金小明，屠康.平均陽性染色面積百分比法分析免疫組化結(jié)果初探［J］.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2007，24（3）：650-653］.doi：10.3321/j.issn：1001-5515.2007.03.039.

［6］Zhan JH.The early screening and counter measures of biliary atresia ［J］.Tianjin Med J，2015，43（1）：1-3.［詹江華.膽道閉鎖早期篩查現(xiàn)狀及對(duì)策［J］.天津醫(yī)藥，2015，43（1）：1-3］.doi：10.3969/j. issn：0253-9896.2015.01.001.

［7］Kamato D，Burch ML，Piva TJ，et al.Transforming growth factor-β signalling：role and consequences of Smad linker region phosphory?lation［J］.Cell Signa，2013，25（10）：2017-2024.doi：10.1016/j. cellsig.2013.06.001.

［8］Gaarenstroom T，Hill CS.TGF-β signaling to chromatin：how Smads regulate transcription during self-renewal and differentiation ［J］.Semin Cell Dev Biol，2014，32（1）：107-118.doi：10.1016/j. semcdb.2014.01.009.

［9］Lee JH，Lee H，Joung YK，et al.The use of low molecular weight heparin-pluronic nanogels to impede liver fibrosis by inhibition the TGF-β/Smad signaling pathway［J］.Biomaterials，2011，32 （5）：1438-1445.doi：10.1016/j.biomaterials.2010.10.023.

［10］Iordanskaia T，Koeck E，Rossi C，et al.Integrin β-8，But Not β-5 or-6，protein expression is increased in livers of children with bili?ary atresia［J］.J Pediatr Gastroenterol Nutr，2014，59（6）：679-683.doi：10.1097/MPG.0000000000000518.

［11］Vrljicak P，Myburgh D，Ryan AK，et al.Smad expression during kidney development［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2004，286（4）：625-633.

（2015-10-19收稿2016-01-18修回）

（本文編輯李國琪）

中圖分類號(hào)：R726.574

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.11958/20150242

The effects of TGF-β1 and Smad2 on liver fibrosis of biliary atresia

DING Meiyun1,ZHAN Jianghua2△,ZHAO Li2,ZHAO Linsheng2,ZHANG Aihua2
1 The Graduate School of Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2 Tianjin Children’s Hospital△Corresponding AuthorE-mail:zhanjianghuatj@163.com

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression and function of transforming growth factor(TGF)-β1 and Smad2 in liver fibrosis of biliary atresia(BA).MethodsLiver biopsy specimens were collected from autopsy(normal group,n=5), congenital biliary dilatation(CBD group,n=10),BA patients underwent Kasai procedure(early hepatic fibrosis group,n=19) and liver transplantation(transplantation group,n=11).The first three groups were collected from January 2010 to July 2014 in Tianjin Children’s Hospital,and the last group was collected from January 2013 to January 2014 in Tianjin First Central Hospital.The hematoxylin and eosin(HE)stain were used to observe the degree of liver fibrosis of four groups. Immunohistochemistry(IHC)was used to observe expressions of TGF-β1 and Smad2 in liver tissues of these samples. Quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR)was used to test the quantitative mRNA of TGF-β1 and Smad2 in these samples.ResultsResults of HE showed that no fibrosis in autopsy group,mild fiber cell hyperplasia in CBD group,severe fibrosis in Kasai group and significant pseudolobule in transplantation group.Results of IHC showed that TGF-β1 was expressed in the cytoplasm of hepatocytes,bile duct cells,lymphocytes and neutrophils.The average optical density of TGF-β1 was the highest in Kasai group compared with that of other three groups(P<0.05).There was no significant difference in Smad2 expression in cytoplasm of hepatocytes,bile duct cells and lymphocytes between four groups （P＞0.05).Results of qRT-PCR showed that both TGF-β1 mRNA and Smad2 mRNA were the highest in early hepatic fibrosis group than those of CBD group and transplantation group(P<0.017).ConclusionIn early stage of BA,TGF-β1 and Smad2 promote liver fibrosis until the formation of P-P,P-C desmosome structure.However,with BA fibrosis becomes more serious,the pro-fibrogenic function of TGF-β1 and Smad2 becomes less.

Key words:biliary atresia;liver cirrhosis;transforming growth factor beta1;Smad 2 protein;liver fibrosis