吳彬彬，劉春花，陳宏運(yùn)，顏曉慶，晏斌，楊莉麗，梁巖，3，*

（1.中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院食品安全與環(huán)境技術(shù)研究室，廣東深圳518055；2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東深圳518036；3.中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所，新疆烏魯木齊830011）

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植物果蔬發(fā)酵液對S180荷瘤小鼠抗腫瘤作用研究

吳彬彬1，劉春花1，陳宏運(yùn)1，顏曉慶1，晏斌1，楊莉麗2，梁巖1，3，*

（1.中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院食品安全與環(huán)境技術(shù)研究室，廣東深圳518055；2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東深圳518036；3.中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所，新疆烏魯木齊830011）

摘要：研究植物果蔬發(fā)酵液對S180荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用，探討植物果蔬發(fā)酵液抑制腫瘤的作用機(jī)制。采用S180細(xì)胞接種KM小鼠構(gòu)建荷瘤模型，并灌胃植物果蔬發(fā)酵液。通過試劑盒進(jìn)行甘油三酯、膽固醇以及抗氧化活性等的測定。采用MTT法測定脾細(xì)胞增值率，LDH法測定NK細(xì)胞活性。低中高劑量植物果蔬發(fā)酵液對腫瘤的抑制率分別為18.2%、25.5%和52.7%。不同劑量的發(fā)酵液對NK細(xì)胞活性、血清總膽固醇和體重?zé)o顯著影響，但具有提高T細(xì)胞活性的趨勢。此外，高劑量的植物果蔬發(fā)酵液能顯著降低甘油三酯水平和肝臟指數(shù)（P＜0.05），抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明低、高劑量發(fā)酵液能增強(qiáng)T-SOD活性。植物果蔬發(fā)酵液可能通過改善機(jī)體免疫和抗氧化能力發(fā)揮抗腫瘤作用，具體機(jī)制還需要深入研究。

關(guān)鍵詞：植物果蔬發(fā)酵液；免疫；抗氧化；抗腫瘤

癌癥是人類健康的殺手，一直嚴(yán)重威脅著人們的健康。據(jù)2014年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，僅2012年全球新增癌癥患者1 400多萬，而中國新增307萬，占全球總量的21.9%［1］。癌癥的發(fā)生與發(fā)展與多種因素有關(guān)。近年來，科學(xué)研究表明水果、蔬菜及其發(fā)酵液能夠降低癌癥的患病率［2-4］。植物果蔬類發(fā)酵液一般是由幾十種水果及蔬菜經(jīng)益生菌發(fā)酵而來，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、礦物質(zhì)和多糖［5］。本研究從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)入手，研究植物果蔬發(fā)酵液（plant fermentation extract，PFE）的抑癌作用并探討可能的作用機(jī)制，為果蔬發(fā)酵類健康保健食品的開發(fā)和慢性疾病的治療提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞與動物

S180細(xì)胞：由香港科技大學(xué)提供；YAC-1細(xì)胞：購于普諾賽生命科技有限公司；SPF級KM小鼠：購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK（粵）2013-0002。

1.1.2試劑與耗材

PFE（古元真酵素）：由中科臺富科技有限公司提供；脂多糖（LPS）、刀豆蛋白A（ConA）：購于美國Sigma公司；環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CY）：購于深圳化試科技有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）：購于廣州市唯民生物科技有限公司，T-SOD、CAT、MDA和AOC等試劑盒：購于南京建成生物工程研究所。

1.1.3儀器與設(shè)備

CKX41倒置光學(xué)顯微鏡：購于Olympus公司；Thermo 371CO2培養(yǎng)箱、MULTISKAN GO酶標(biāo)儀：購于Thermo公司；AR224CN電子天平：購于奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.2方法

1.2.1接種

將正常培養(yǎng)的S180細(xì)胞接種到KM小鼠腹腔傳代3次以上，無菌取出，制成細(xì)胞懸液，除空白對照組（blank control group，BCG）外，其余小鼠4×105個(gè)/只接種于右側(cè)腋下，24 h后隨機(jī)分為模型組（model group，MG）、環(huán)磷酰胺組（cyclophosphamide treatment group，CYG）、低劑量組（low dose group，LDG）、中劑量組（middle dose group，MDG）和高劑量組（high dose group，HDG）。CYG腹腔注射CY（20 mg/kg/day），LDG灌胃PFE 7.5 mL/kg/day，MDG灌胃PFE 15 mL/kg/day，HDG灌胃PFE 30 mL/kg/day。

1.2.2指標(biāo)測定

1）瘤種：末次灌胃結(jié)束，對小鼠進(jìn)行禁食處理，眼球取血后脫臼處死，剝離小鼠腫瘤并進(jìn)行稱重。抑瘤率/%=（對照組平均瘤重-劑量組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100。

2）器官指數(shù)：處死小鼠后，無菌取脾臟、胸腺及肝臟，分別稱重，并計(jì)算器官指數(shù)，脾或胸腺指數(shù)=脾重或胸腺重（mg）/體重（g）。

3）NK細(xì)胞活性測定：無菌獲取的脾臟，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。臺酚藍(lán)染色計(jì)數(shù)后，RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/mL。取脾細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞（YAC-1細(xì)胞）各100 μL，加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板中，分別設(shè)置對照組，實(shí)驗(yàn)組和靶細(xì)胞最大釋放組，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，然后將96孔培養(yǎng)板以1 500 r/min離心5 min，每孔吸取上清100 μL置96孔平底培養(yǎng)板中，同時(shí)加入LDH基質(zhì)液100 μL，反應(yīng)3 min，每孔加入1 mol/L的HCl 30 μL，在酶標(biāo)儀490 nm波長處測定OD值，計(jì)算NK細(xì)胞活性。

4）ConA、LPS誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：根據(jù)Liu等［6］的方法并做修改，調(diào)整脾細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL，分3孔加入24孔培養(yǎng)板中，分別為對照組，ConA組（2.5 μg/mL）和LPS組（10 μg/mL），置5%CO2、37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔輕輕吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入MTT（5 mg/mL）50 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，混勻。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，測定570 nm波長吸光值，計(jì)算增值率，增值率/%=（OD處理組-OD實(shí)驗(yàn)組）/OD對照組×100。

5）抗氧化能力及血脂等實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作測定血清T-SOD（總過氧化氫歧化酶）、MDA（丙二醛）和CAT（過氧化氫酶）以及甘油三酯、總膽固醇等含量。

1.3統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），數(shù)據(jù)為Mean±SE，組間比較采用LSD法，P＜0.05為具有顯著差異。

2　結(jié)果與討論

2.1PFE對S180荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用

PFE對S180荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用見圖1。

PFE對S180荷瘤腫瘤生長具有抑制作用，可明顯減輕腫瘤的重量。隨著劑量的增加，瘤重逐漸減輕。低中高PFE組的腫瘤抑制率分別為18.2%、25.5%和52.7%。與模型組相比，高劑量PFE能顯著抑制S180荷瘤的生長（P＜0.05）。

2.2PFE對S180荷瘤小鼠體重及血脂等的影響

PFE對S180荷瘤小鼠體重及血脂等的影響見表1。

圖1　PFE對S180荷瘤小鼠的腫瘤重量及腫瘤抑制作用Fig.1　Effect of PFE on tumor weight and tumor inhibition ratio of tumor-bearing mice（x±s）

表1　PFE對S180荷瘤小鼠體重、甘油三酯及總膽固醇的影響Table 1　Effect of PFE on body weight，triglyceride and total cholesterol of tumor-bearing mice

表2　PFE對S180荷瘤小鼠胸腺指數(shù)，脾臟指數(shù)及肝臟指數(shù)的影響Table 2　Effect of PFE on thymus index，spleen index and liver index of tumor-bearing mice

表3　PFE對脾臟NK細(xì)胞活性及淋巴細(xì)胞增殖的影響Table 3　Effect of PFE for NK cell activity and lymphocytes proliferation

從表1可以看出，與模型組相比，不同劑量PFE 對S180荷瘤小鼠體重?zé)o顯著影響，對血清總膽固醇也無顯著影響，但高劑量PFE能顯著降低血清甘油三酯濃度（P＜0.05）。

2.3PFE對S180荷瘤小鼠免疫器官及細(xì)胞的影響

PFE對S180荷瘤小鼠免疫器官及細(xì)胞的影響見表2、表3。

從表2可以看出，與模型組相比，除高PFE組的肝臟指數(shù)顯著降低外，其他各PFE組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)均無顯著變化。NK細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)和LPS刺激脾細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度PFE均對小鼠NK細(xì)胞活性和脾臟B細(xì)胞活性無顯著影響，但Con A刺激實(shí)驗(yàn)表明PFE對脾臟T細(xì)胞活性雖無顯著增強(qiáng)作用（P＞0.05），但具有提高T細(xì)胞活性的趨勢。

2.4PFE對S180荷瘤小鼠抗氧化能力的影響

PFE對S180荷瘤小鼠抗氧化能力的影響見表4。

表4　PFE對S180荷瘤小鼠CAT，MDA和T-SOD活性的影響Table 4　Effect of PFE on CAT，MDA and T-SOD of tumorbearing mice

CAT檢測結(jié)果表明各劑量的PFE均輕微降低血清CAT活性（P＞0.05），提示PFE具有較弱清除羥自由基的能力。同時(shí)，與模型組相比，中高劑量PFE也能夠降低血清MDA含量，說明中高劑量PFE可能在防止脂質(zhì)過氧化方面具有積極作用。T-SOD測定結(jié)果表明PFE能夠增強(qiáng)荷瘤小鼠T-SOD酶活力。

3　結(jié)論與討論

PFE是由水果蔬菜等經(jīng)發(fā)酵、過濾而來的液體，與果蔬相比，具有營養(yǎng)均衡、易儲存等特點(diǎn)。多項(xiàng)研究表明PFE及其提取物具有良好的抗癌作用［7-9］。李香云等［10］通過測定PFE及大鼠血清中的微量元素含量，初步揭示了PFE的抗癌功效，盧明等［11］研究發(fā)現(xiàn)PFE可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、提高機(jī)體免疫力發(fā)揮抑癌作用，Satoru等［12］發(fā)現(xiàn)石榴發(fā)酵物也具有一定的癌癥預(yù)防作用，王智鼎等［13］則通過檢測小鼠的免疫系統(tǒng)，確定果蔬發(fā)酵飲品能夠改善小鼠機(jī)體的免疫力。由于果蔬發(fā)酵含有豐富的物質(zhì)，如維生素、多糖、多酚和黃酮等，因此，其可能通過多方面的作用抑制腫瘤的生長，發(fā)揮抑癌作用。

本研究從小鼠常規(guī)指標(biāo)、免疫力和抗氧化等多方面研究了PFE對癌癥的抑制作用，發(fā)現(xiàn)PFE能夠降低機(jī)體甘油三脂的水平，這與水果能降低甘油三酯的研究相一致［14-15］。本研究還發(fā)現(xiàn)PFE在改善機(jī)體抗氧化能力方面具有一定的積極作用。MDA的含量可以衡量脂質(zhì)過氧化程度，間接反映出細(xì)胞受損傷程度，而SOD是能夠直接清除自由基的酶，其活性直接反映機(jī)體的抗氧化水平，因此通過測定機(jī)體內(nèi)SOD和MDA的含量能夠反映機(jī)體的抗氧化水平。PFE具有降低MDA含量、增強(qiáng)T-SOD活性的趨勢，表明其可能通過增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力發(fā)揮抑癌作用。此外，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PFE具有改善T淋巴細(xì)胞活性的趨勢，這與王智鼎等的研究結(jié)果具有一定的相似性?？傊?，PFE可能通過提高機(jī)體抗氧化能力和改善機(jī)體免疫能力等多種方式綜合發(fā)揮抗癌作用，但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］Stewart BW，Wild CP.World Cancer Report 2014［R］.2014：1-630

［2］ Liu H，Wang XC，Hu GH，et al.Fruit and vegetable consumption and risk of bladder cancer：an updated meta-analysis of observational studies［J］.European Journal of Cancer Prevention，2015，24 （6）：508-516

［3］ Vieira AR，Vingeliene S，Chan DS，et al.Fruits，vegetables，and bladder cancer risk：a systematic review and meta-analysis［J］.Cancer medicine，2015，4（1）：136-146

［4］ Shukla R，Goyal A.Novel dextran from Pediococcus pentosaceus CRAG3 isolated from fermented cucumber with anti-cancer properties［J］.International journal of biological macromolecules，2013，62：352-357

［5］李曉青，劉俊江，陳宏運(yùn)，等.植物發(fā)酵液的發(fā)展及其功效［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2014（1）：70-72

［6］Liu X，Wang L，Zhang C，et al.Structure characterization and antitumor activity of a polysaccharide from the alkaline extract of king oyster mushroom［J］.Carbohydrate polymers，2015，118：101-106

［7］McCann MJ，Gill CI，G OB，et al.Anti-cancer properties of phenolics from apple waste on colon carcinogenesis in vitro［J］.Food and chemical toxicology：an international journal published for the British Industrial Biological Research Association，2007，45（7）：1224-1230

［8］Liu M，Toshima Y，Wu XL，et al.Inhibitory effects of vegetable and fruit ferment liquid on tumor growth in Hepatoma-22 inoculation model［J］.Asia Pac J Clin Nur，2007，16（S1）：443-446

［9］Liu M，Cai YQ，Zhao Y，et al.Inhibitory effects of the ferment liquids on sarcoma［J］.Journal of Nanjing Medical University，2005，19 （6）：294-298

［10］李香云，練鴻振，陳逸珺，等.ICP-MS法測定大鼠血清和果蔬發(fā)酵液中的微量元素［J］.光譜學(xué)與光譜分析.2008，28（9）：2181-2186

［11］盧明，蔡云清，戶島裕司，等.果蔬發(fā)酵液體內(nèi)外的抑癌作用及對免疫功能的影響［J］.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006，13（1）：57-59

［12］Kawaii S，Lansky EP.Differentiation-promoting activity of pomegranate（Punica granatum）fruit extracts in HL-60 human promyelocytic leukemia cells［J］.J Med Food，2004，7（1）：13-18

［13］王智鼎，李岳飛，宋艷，等.一種復(fù)合果蔬發(fā)酵飲品增強(qiáng)免疫力功能研究［J］.食品研究與開發(fā)，2014，35（17）：115-118

［14］Cho KD，Han CK，Lee BH.Loss of body weight and fat and improved lipid profiles in obese rats fed apple pomace or apple juice concentrate［J］.Journal of medicinal food，2013，16（9）：823-830

［15］Dadjo Y，Panahi Y，Pishgoo B，et al.Effects of Supplementation with Heracleum persicum Fruit Extract on Serum Lipids in Patients Undergoing Coronary Angiography：A Pilot Trial［J］.Phytother Res，2014，29（1）：141-143

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.011

作者簡介：吳彬彬（1988—），男（漢），研究助理，碩士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

*通信作者：梁巖（1968—），女（漢），研究員，研究方向：環(huán)境科學(xué)、微生物學(xué)。

收稿日期：2015-05-25

Inhibitory Effects of Plant Fermentation Extract on Tumor Growth in S180 Tumor-bearing Mice

WU Bin-bin1，LIU Chun-hua1，CHEN Hong-yun1，YAN Xiao-qing1，YAN Bin1，YANG Li-li2，LIANG Yan1，3，*

（1.Laboratory for Food Safety and Environmental Technology，Shenzhen Institutes of Advanced Technology，Chinese Academy of Sciences，Shenzhen 518055，Guangdong，China；2.Digestive Department of the Shenzhen Hospital of Peking University，Shenzhen 518036，Guangdong，China；3.Xinjiang Institute of Ecology and Geography，Chinese Academy of Sciences，Urumchi 830011，Xinjiang，China）

Abstract：Anti-tumor effect of plant fermentation extract（PFE）on S180 tumor-bearing mice was studied and the possible mechanisms were explored.Kunming mice transplanted with S180 cells were treated with a PFE via intragastric administration.Reagent kits of triglyceride and total-cholesterol were employed for concentration detection in the serum.Contents of carnitine acylcarnitine translocase（CAT），malondiadehyde（MDA）and superoxide dismutase（SOD）in the serum were examined.The MTT method was used in the spleen lymphocyte transformation experiment and LDH was used to detect the NK cell activity.The inhibition ratios of PFE among the 3 treatment groups were 18.2%，25.5%and 52.7%，respectively.However，the treatments showed no significant differences compared to the control in variables of T cell activity，NK cell activity，total-cholesterol content and body weight.High PFE concentration significantly reduced triglyceride level and spleen index（P＜0.05）.Lastly，both low and high PFE concentrations enhanced the antioxidation capacity of S180-bearing mice. The PFE was demonstrated to possess anti-tumor effects in the present in vivo study.Both improved immune response and antioxidation abilities appeared to be responsible for the effects，while further investigation is needed in the future.

Key words：plant fermentation extract；immunity；antioxidation；anti-tumor