李朦 劉宏偉

[摘要]背景：脂肪源性干細(xì)胞（Adipose derived stem cells，ADSCs）因其具備來源豐富、取材容易、具有多向分化潛能特點(diǎn)而成為現(xiàn)今成體干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)，同時(shí)其在臨床研究及應(yīng)用中也擁有廣闊的前景。完善的提取設(shè)施及最符合臨床使用規(guī)范的細(xì)胞使用及保存方法，是ADSCs能更安全有效的應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵所在。目的：通過對現(xiàn)有的細(xì)胞保存介質(zhì)、保存方法及保存時(shí)間進(jìn)行綜述，為臨床即用型脂肪源性干細(xì)胞的短期運(yùn)送及保存提供理論基礎(chǔ)。方法：廣泛查閱近年相關(guān)文獻(xiàn)，對脂肪源性干細(xì)胞的研究歷史、臨床應(yīng)用及其他成體干細(xì)胞的保存方式及臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用進(jìn)行綜合論述。結(jié)果：4℃條件下保存細(xì)胞，對短期內(nèi)細(xì)胞的活性和生物學(xué)特性影響最小，相對室溫條件下有明顯優(yōu)勢；血清是細(xì)胞培養(yǎng)中重要的成分之一，包含各種血漿蛋白、生長因子、碳水化合物等多種物質(zhì)，能提供氨基酸、維生素、無機(jī)物等細(xì)胞生長必需物質(zhì)，對脂肪源性干細(xì)胞的存活力及細(xì)胞增殖亦有促進(jìn)作用；富血小板血漿（Platelet-rich plasma，PRP）內(nèi)含豐富的血小板，是全血中血小板數(shù)量3倍以上，能釋放出多種生長因子，如血小板衍生生長因子（Platelet derived growth factor，PDGF）、表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）、類胰島素生長因子（Insulin like growth factot，IGF）等，對脂肪源性干細(xì)胞的細(xì)胞增殖及分化功能有明顯的促進(jìn)作用。結(jié)論：4℃條件下使用含豐富的生長因子及無毒性的血清及PRP可能是較好的保存細(xì)胞活性及能安全使用的保存介質(zhì)。

[關(guān)鍵詞]脂肪源性干細(xì)胞；人血清；富血小板血漿；細(xì)胞保存

[中圖分類號]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2016）04-0100-04

問充質(zhì)干細(xì)胞是備受關(guān)注的一類具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，其可在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及肌肉細(xì)胞等多種組織細(xì)胞，如骨髓源性問充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶問充質(zhì)干細(xì)胞等，但因其取材創(chuàng)傷大、純化率低且數(shù)量有限，不能廣泛用于實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用。2001年Zuk等從人脂肪組織中分離出了可以自我更新、具有多向的分化潛能的成纖維樣細(xì)胞群，即脂肪源性干細(xì)胞（Adipose-derived stromal vascular fraction cells/stem cells，SVF/ADSCs）。ADSCs因其具有來源豐富、取材容易、增殖迅速、低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用，不涉及道德倫理問題等優(yōu)點(diǎn)，而受到廣泛關(guān)注及研究。ADSCs作為成體干細(xì)胞家族的新成員，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景，并可能作為一種新的細(xì)胞產(chǎn)品或新技術(shù)用于臨床研究及治療。由于臨床治療的特點(diǎn)和需求，作為細(xì)胞產(chǎn)品從制備完成到治療使用前的這一時(shí)間段（包括細(xì)胞產(chǎn)品的運(yùn)輸過程）如何保持細(xì)胞產(chǎn)品活力的最佳狀態(tài)或進(jìn)入人體后能發(fā)揮較好的治療效果，保存方法是一個(gè)值得高度關(guān)注的問題。

ADSCs來自脂肪組織，可通過脂肪抽吸技術(shù)獲取脂肪組織，使用膠原酶消化后離心可從抽吸的脂肪懸濁液中分離出血管基質(zhì)碎片（stromal vascular fraction，SVF），ADSCs就包含于SVF中。有文獻(xiàn)報(bào)道，在脂肪移植的早期，ADSCs的存在可以促進(jìn)血管再生、增加毛細(xì)血管密度和血供；利用ADSCs進(jìn)行自體脂肪移植即加入細(xì)胞輔助脂肪移植技術(shù)（cell-assisted lipotransfer，CAL）能顯著提高脂肪移植的成活率并保有持續(xù)性，其存活率可達(dá)70%。通過研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs不僅可以通過自我復(fù)制分化為脂肪細(xì)胞，還可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞或周圍細(xì)胞，并且有研究指出在缺氧的環(huán)境下ADSCs可以分泌血管生長因子，通過表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胰島素樣生長因子（insulinike growth factors，IGF）等來阻止脂肪細(xì)胞凋亡的發(fā)生，維持脂肪細(xì)胞的成活率。

1臨床應(yīng)用型細(xì)胞的長期保存

臨床實(shí)踐中干細(xì)胞的應(yīng)用已有一定的發(fā)展，目前采用干細(xì)胞治療的疾病有70多種，包括代謝性疾病、腫瘤、血液性疾病和免疫缺陷性疾病，如臍帶問充質(zhì)干細(xì)胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSC）、骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞（Hematopoietic stem cell，HSC）等的應(yīng)用。然而細(xì)胞的臨床應(yīng)用還存在著許多問題，特別是細(xì)胞的提取需要在嚴(yán)格的藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（Good Manufacturing Practice，GMP）實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，而現(xiàn)今很多醫(yī)院不能滿足細(xì)胞即提即用的條件，又或者細(xì)胞在提取后出現(xiàn)臨時(shí)狀況而不能及時(shí)的應(yīng)用，所以如何保證細(xì)胞的最佳活力，妥善保存細(xì)胞顯得尤為重要。

以往的研究中，許多學(xué)者已提出多種保存方法，主要的保存技術(shù)有：4℃非冷凍保存、程控降溫液氮（-196℃）保存、-80℃直接冷凍保存。細(xì)胞凍存已經(jīng)是國內(nèi)外認(rèn)可的一種相對成熟的細(xì)胞保存方法，2009年Baust JG等人將細(xì)胞的冷凍保存定義為：細(xì)胞、組織或者器官冷凍在-80℃尤其是-140℃以下能保證其存活能力的過程稱為細(xì)胞的冷凍保存。有研究表明凍存1年的人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特性無明顯改變，也已有研究提出細(xì)胞在-196℃液氮環(huán)境下生化反應(yīng)與活力代謝基本處于靜止?fàn)顟B(tài)。Guangpengliu等人曾將人源性ADSCs儲存于液氮中2周后復(fù)蘇，證實(shí)冷凍保存對ADSCs的增殖能力及成骨分化能力無明顯影響，是可以應(yīng)用于骨組織工程中的一種細(xì)胞保存方式。在國內(nèi)，也有低溫凍存對人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響的研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ADSCs凍存于液氮中1、3和6個(gè)月，復(fù)蘇后仍具較高的存活率，并且其生物學(xué)特性保持穩(wěn)定，仍具有多向分化潛能。在過去關(guān)于ADSCs的保存方法研究的報(bào)道相對較少，而對于其他干細(xì)胞的保存較多，例如Laure Calvet等人報(bào)道了109例-80℃簡易凍存法凍存外周造血干細(xì)胞，粒系植入的中位時(shí)間是13d，血小板植入的中位時(shí)間是12d，細(xì)胞活性回收率極高。

雖然如此，細(xì)胞凍存還是存在很多問題，其中最主要的是細(xì)胞膜的不可逆性破壞，以至于細(xì)胞復(fù)活率低、復(fù)蘇后的細(xì)胞活性差。導(dǎo)致這種結(jié)局的原因包括：①細(xì)胞毒性損傷；②在凍融的過程中冷凍保護(hù)劑的滲透性損傷：DMSO是目前最長采用的細(xì)胞凍存保護(hù)劑，但DMSO的臨床應(yīng)用還存在著很大的安全隱患；③細(xì)胞內(nèi)冰晶形成的機(jī)械損傷；④解凍過程中細(xì)胞內(nèi)再結(jié)晶的機(jī)械損傷。當(dāng)降溫速率過快，細(xì)胞內(nèi)外同時(shí)形成冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡，如果復(fù)溫速率過快慢，也同樣如此。所以相對于臨床要求來說，細(xì)胞凍存程序操作繁瑣，且環(huán)境、設(shè)備要求高，不太適合臨床即用細(xì)胞的應(yīng)用。

2間充質(zhì)干細(xì)胞短期保存的相關(guān)研究

現(xiàn)今大多數(shù)的研究主要聚焦于問充質(zhì)干細(xì)胞的長期保存，對于細(xì)胞的短期保存和運(yùn)輸過程中的保存問題甚少有報(bào)道。Lane等提出滿足臨床應(yīng)用要求的保存，復(fù)蘇后細(xì)胞活性至少應(yīng)達(dá)到80%。Daisuke Matsumoto MD.等人將抽吸后的脂肪分別存放于室溫下1、2、4和24h，4℃下1、2、3d，及-80V下1個(gè)月，分別觀察脂肪電鏡下的形態(tài)變化及所含ADSCs的存活情況及活力的變化，結(jié)果顯示，脂肪在室溫下可以存放4h，在4℃下可以存放24h，所獲得的ADSCs沒有生物學(xué)改變。

時(shí)炳正等人比較了4℃條件下不同保存時(shí)間對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞活性和生物學(xué)特性的影響，證實(shí)4℃條件下保存24h的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，活細(xì)胞的比例接近80%，細(xì)胞增殖和分化能力與0h相比無明顯差異，是一種簡潔有效的短期保存方法。陳京等人對臨床治療用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞保存條件進(jìn)行研究，提出在4℃條件下，將間充質(zhì)干細(xì)胞保存在5%人血清清蛋白氯化鈉注射液中0.5h內(nèi)回輸對細(xì)胞活力影響最小。汪大琨等學(xué)者提出臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在長途運(yùn)輸時(shí)，選擇16℃條件下加入1%白蛋白可以有效保證細(xì)胞存活量，但當(dāng)運(yùn)輸時(shí)間大于8h時(shí)，細(xì)胞的存活率明顯下降。也有學(xué)者提出不同意見，周楠等人認(rèn)為無論4℃還是室溫條件下，細(xì)胞在保存介質(zhì)中的活性均在短期內(nèi)呈時(shí)間依賴性下降，細(xì)胞死亡率呈時(shí)間依賴性增加。

3相關(guān)細(xì)胞保存介質(zhì)的研究及選擇

在細(xì)胞應(yīng)用于人體之前，細(xì)胞質(zhì)量與細(xì)胞的保存環(huán)境密切相關(guān)，這也直接關(guān)系到細(xì)胞移殖后的成效。除了溫度和保存時(shí)間以外，細(xì)胞保存液的選擇同樣重要。在整形美容外科，ADSCs可單獨(dú)或混合脂肪后移殖到人體需要的部位，什么樣的細(xì)胞生存環(huán)境更有利于細(xì)胞的存活，使細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖分化能力呢？Yunsong Liu等人將ADSCs混合人富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）后的組織工程骨（ITB）注射到裸鼠的腹股溝區(qū)，通過觀察細(xì)胞的增殖、分化能力來評估骨形成情況，結(jié)果表明，ADSCs與10%～12.5%的PRP混合后骨形成最佳。Sang Jin Cheon等人在研究ADSCs的培養(yǎng)條件時(shí)發(fā)現(xiàn)，VEGF對ADSCs的增殖有明顯促進(jìn)作用，其能夠促進(jìn)血管生成，其中又以成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）最好，并且在實(shí)驗(yàn)中，學(xué)者有將培養(yǎng)細(xì)胞用的胎牛血清換為人血清，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)效果更好。

PRP含有超過生理濃度數(shù)倍的血小板，PRP激活后，血小板釋放出大量的活性因子，這些生長因子和細(xì)胞因子可以通過激活細(xì)胞表面受體來調(diào)控基因的表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化，以及參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解和組織重建過程。生長因子能刺激新生血管生成，增加受損組織的血供和營養(yǎng)，同時(shí)PRP獲取過程創(chuàng)傷小、制備簡便，其對組織再生、創(chuàng)面修復(fù)、細(xì)胞輔助運(yùn)用有很重要的意義。劉景蘭等人對兔ADSCs聯(lián)合PRP對自體脂肪顆粒植入裸鼠皮下后血運(yùn)重建進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)混入PRP后血管生成明顯在增多，他們認(rèn)為ADSCs與PRP聯(lián)合可促進(jìn)移植脂肪顆粒中血管生成。

干細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)一般使用胎牛血清作為細(xì)胞營養(yǎng)的來源，但胎牛血清屬于異源性物質(zhì)，因其抗原性、致病性等原因不能應(yīng)用于臨床。有學(xué)者提出自體或異基因供者的血液成分，例如人血清、血漿、血小板等可作為替代性培養(yǎng)基補(bǔ)充物供臨床使用。Su Jin Kim等人的研究中，證明了ADSC和BMSC在人血清中培養(yǎng)，可以保持干細(xì)胞的增殖和分化能力，是細(xì)胞和基因療法應(yīng)用于臨床的理想選擇。2011年，H Shafaei等人用人胎盤血清代替胎牛血清作作為ADSCs培養(yǎng)基的成分，證實(shí)人胎盤提供的細(xì)胞微環(huán)境比胎牛血清更佳。在Ana Cla、udiaChagas de Paula等人報(bào)道，在成骨培養(yǎng)媒介中加入同種異體的人血清，有利于體外細(xì)胞的體外擴(kuò)增。由此可見，人血清和PRP對ADSCs的增殖及分化均有促進(jìn)作用，同時(shí)取材容易，操作簡單，成本低成效高，臨床應(yīng)用容易實(shí)現(xiàn)。

4小結(jié)

目前對于間充質(zhì)干細(xì)胞保存，采用的保存方法主要為長期深低溫凍存和短期4℃保存。長期低溫凍存設(shè)備要求高、花費(fèi)大，冷凍程序繁瑣，需專人管理，難以推廣，并且還存在著“針狀冰晶胞內(nèi)形成”、“凍存保護(hù)劑”對細(xì)胞的毒性及溫度差致細(xì)胞凋亡的種種問題，所以并不適用于臨床。4℃常規(guī)低溫保存后細(xì)胞相對較安全，并且操作簡單，容易實(shí)現(xiàn)，但長時(shí)保存同樣存在著細(xì)胞的滲透性損傷問題，所以根據(jù)符合臨床使用規(guī)范及設(shè)備條件，探討保存溫度、保存時(shí)間及保存介質(zhì)對于ADSCs生物學(xué)特性的影響，選擇適合的保存方法，才能使細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用得意實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，ADSCs在整形美容外科領(lǐng)域擁有很大的發(fā)展前景，并對修復(fù)組織或器官損傷、組織再生、容量流失及組織缺損的填充具有重要的臨床意義。

編輯/張惠娟