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(1.中國農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，北京 100094；2.北京市畜牧總站，北京 100101)

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基于表達譜芯片技術分析老齡化對小鼠卵母細胞發(fā)育能力的影響

常卓1，2，傅祥偉1，朱士恩1

(1.中國農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，北京 100094；2.北京市畜牧總站，北京 100101)

摘要：探討了生殖老化對小鼠卵母細胞后期發(fā)育及基因表達水平的影響。結果表明，與青年小鼠相比，老齡小鼠MII期卵母細胞經(jīng)體外受精后早期胚胎原核形成的時間發(fā)生延遲(1 h)，囊胚發(fā)育率有顯著差異(61.98% vs.70.95%，P<0.05)。提取老齡和青年CD1小鼠MII期卵母細胞總RNA，使用基因表達譜芯片對其進行分析。結果表明，生殖老化導致1 737個基因表達表現(xiàn)出顯著差異，其中64.9%的基因表達上調(diào)，35.1%的基因表達下調(diào)，生殖老化導致Hdac10等基因產(chǎn)生極顯著的表達差異，小鼠卵母細胞質(zhì)量下降，最終影響其后期發(fā)育能力。

關鍵詞：卵母細胞；生殖老化；減數(shù)分裂；基因表達；小鼠

生物體在機體其它器官老化前生殖機能就已開始退化，即發(fā)生生殖老化現(xiàn)象。與雄性哺乳動物不同的是，雌性哺乳動物在渡過其壽命的1/3時已發(fā)生生殖老化，生殖機能表現(xiàn)出顯著下降，表現(xiàn)在卵母細胞的數(shù)量和質(zhì)量上，如卵巢早衰、減數(shù)分裂中染色體分離異常以及線粒體功能障礙等[1]。而人們對于生殖老化影響卵母細胞后期發(fā)育的情況知之甚少。

Hamatani和Pan等人曾通過表達譜芯片技術分析青老年小鼠卵母細胞全基因組表達，但在雜交前使用RNA線性擴增的方法得到cRNA[2，3]。而本實驗不進行RNA線性擴增，免去繁瑣的擴增過程和擴增中可能會導致的核酸污染，更重要的是避免擴增不均一而放大或減小基因表達差異，最終得出不準確的結果。本實驗主要研究生殖老化對小鼠卵母細胞后期發(fā)育潛力是否造成影響，并進一步以老齡和青年CD1小鼠MII期卵母細胞為實驗材料進行基因表達譜分析，探索生殖老化影響卵母細胞后期發(fā)育的分子機理。

1材料和方法

1.1實驗動物

選取同時購入的青年(6～8周)和老齡(40～44周)CD1小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)作為青年組和老齡組，飼養(yǎng)環(huán)境為控溫20～25℃；控光14 h光照(6：00～20：00)和10 h黑暗(20：00～6：00)，自由采食、飲水，經(jīng)1周的適應性飼養(yǎng)后進行實驗。操作均符合實驗動物福利等相關法規(guī)。

1.2GV期卵母細胞收集及體外成熟培養(yǎng)

將小鼠采用脫頸法處死，無菌采集其卵巢置于含有4 mg/mL牛血清白蛋白(BSA)、37℃的操作液(M2)中。在實體顯微鏡下剝離卵巢附帶的結締組織等并清洗2～3次。將清洗后的卵巢置于M2操作液中，使用1 mL注射器的針頭(直徑0.45 mm)將其撕碎，在實體顯微鏡下回收卵丘-卵母細胞復合體(COCs)。將COCs移入300 IU/mL的透明質(zhì)酸酶溶液中，在37℃恒溫臺上消化2 min，用M2操作液充分洗凈卵母細胞周圍的顆粒細胞，挑選形態(tài)正常的GV期卵母細胞計數(shù)、備用。

將以上采集的青年組和老齡組GV期卵母細胞在37℃的體外成熟液(M16)滴中洗滌3次以后，移入覆蓋石蠟油的M16液(30 μL/滴)中，平均每滴15～20枚。然后將其置于37℃、5%CO2和100%濕度的條件下進行體外成熟培養(yǎng)至MII期。挑選形態(tài)正常的MII期卵母細胞計數(shù)、備用。

1.3MII期卵母細胞體外受精

選取健康的8～10 w CD1雄性小鼠，采用脫頸法處死，分別取出兩側附睪尾置于37℃恒溫臺上的無菌濾紙上，用濾紙吸附表面的脂肪和血跡。將附睪尾于提前平衡過夜的HTF受精液滴中剪開后使精子上浮，然后置于37℃、5%CO2和100%濕度的條件下孵育1～1.5 h，精子得以充分獲能。

將青年組和老齡組MII期卵母細胞在37℃的HTF受精液中洗滌3次以后，移入HTF受精液滴(75 μL/滴)中，平均每滴25～30枚。使用移液器吸取10 μL精子懸浮液加入含有卵母細胞的液滴中，使精子密度為5×106個/mL。受精4 h后，將卵母細胞從受精液滴中移出，在37℃的HTF培養(yǎng)液中充分洗凈，并移入覆蓋石蠟油的新鮮HTF培養(yǎng)液滴(75 μL/滴)中，于37℃、5%CO2和100%濕度的條件下培養(yǎng)，觀察其發(fā)育能力，統(tǒng)計胚胎原核形成的比例、胚胎卵裂率和囊胚發(fā)育率。

1.4表達譜芯片測定

各收集600枚青年組和老齡組形態(tài)正常的MII期卵母細胞，用口吸管吸取至1.5 mL PCR管中，瞬時離心使卵母細胞沉降至管底，棄除管內(nèi)多余操作液，于-80℃冰箱中作為芯片樣品保存。根據(jù)QIAGEN RNeasy Mini Kit試劑盒說明進行芯片樣品總RNA提取和純化、cDNA制備、熒光標記cRNA合成、cRNA純化等操作操作。使用分光光度計對已純化的cRNA濃度進行測定，A260/A280比值在1.9～2.2即為符合標準的cRNA。對cRNA樣品片段化和芯片雜交，經(jīng)洗滌后進行掃描。采用Feature Extraction 10.7.1.1軟件處理得到的原始圖像，并提取原始數(shù)據(jù)，使用Genespring12.5軟件標準化處理原始數(shù)據(jù)，轉化為log以2為底的對數(shù)，最后在二維直角坐標系平面中繪制散點圖，進行分析。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計

本試驗所有數(shù)據(jù)分析均采用SPSS12.0軟件中的獨立樣本t-test進行分析。P<0.05表示有顯著差異。

2結果

2.1生殖老化對小鼠MII期卵母細胞后期發(fā)育的影響

對116枚老齡組和113枚青年組MII期卵母細胞進行體外受精后，選取不同時間在實體顯微鏡下觀察原核形成的情況。如圖1所示，與青年組相比，老齡組卵母細胞受精后原核形成較為延遲，老齡組受精后5 h的原核形成率(33.62%)顯著低于青年組4 h的原核形成率(41.77%)；老齡組受精后6 h時原核形成率(59.56%)與青年組5 h時原核形成率(55.19%)差異不顯著。此外，表1所示，體外受精胚胎的卵裂率無顯著差異，但囊胚發(fā)育率存在顯著差異(61.98%±1.77 vs.70.95%±1.61，P<0.05)。

圖1　老齡和青年CD1小鼠卵母細胞體外受精后原核形成的動態(tài)曲線

表1生殖老化對CD1小鼠MII期卵母細胞體外受精后發(fā)育能力的影響

卵母細胞/枚卵裂率(%±SE)囊胚發(fā)育率(%±SE)老齡組11688(75.93±2.19)a72(61.98±1.77)a青年組11390(79.73±1.07)a80(70.95±1.61)b

注：同列不同上標小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2生殖老化對小鼠MII期卵母細胞基因表達的影響

a)差異表達基因統(tǒng)計和篩選

選擇老齡組和青年組樣本信號均與背景有顯著差異的探針為有效探針，然后對有效探針對應的基因再次進行篩選，標準為差異倍數(shù)FC值≥2.0。

結果如表2所示，一共有30 606個探針為有效探針，其中1 737個基因的FC值≥2.0，表達上調(diào)基因609個，表達下調(diào)基因1 128個；FC值≥3.0的基因共計104個(16個表達上調(diào)基因和88個表達下調(diào)基因)；FC值≥5.0的基因共計33個(5個表達上調(diào)基因和28個表達下調(diào)基因)，均為cDNA片段或產(chǎn)物為長鏈非編碼RNA(lincRNA)。因此生殖老化導致小鼠MII期卵母細胞中5.68%的基因表達顯著改變，其中64.9%的基因表達下調(diào)，35.1%的基因則表達上調(diào)。

參考Su等人的標準[4]，F(xiàn)shr、Has2和Ptgs2這三種卵丘顆粒細胞特有的基因FC值均小于5.0，因此實驗結果不受顆粒細胞基因表達的干擾。

表2老齡和青年小鼠卵母細胞差異表達基因統(tǒng)計

有效探針差異表達顯著基因(%)表達上調(diào)基因FC≥2.0(%)FC≥3.0(%)FC≥5.0(%)表達下調(diào)基因FC≥2.0(%)FC≥3.0(%)FC≥5.0(%)306061737(5.68%)609(35.1%)1651128(64.9%)8828

b)差異表達基因分析

選擇FC≥3.0的基因在Gene Ontology分析結果中查找其功能。88個表達下調(diào)基因中，除57個基因為cDNA片段或產(chǎn)物為lincRNA外，7個基因功能未知，24個基因參與的生理過程見表3；16個表達上調(diào)基因中，除10個基因為cDNA片段或產(chǎn)物為lincRNA外，1個基因功能未知，5個基因參與的生理過程見表4。這些基因的FC在3.0以上，而且參與細胞代謝的多個過程，說明其轉錄水平的改變對卵母細胞的正常機能影響較大。

表3FC≥3.0的表達下調(diào)基因

基因FC值參與生理過程Was3.5328肌動蛋白纖維聚合、解聚和維持Dmnt13.4574DNA表觀修飾Kif5a4.5493微管結合和驅(qū)動Mdh1b3.0572氧化還原反應Olfr6294.3944Olfr3194.2702Olfr11154.1717Olfr974.0493Olfr1223.8028Olfr4823.5418Olfr743.3624Olfr6353.3468Olfr3983.0456G蛋白偶聯(lián)受體信號傳導Bzrap14.8013苯二氮受體結合Scm143.2984基因轉錄Itk3.2545免疫應答Defb193.7226防御細菌感染Cd383.3621炎癥反應Rin14.7186細胞內(nèi)吞Arvcf4.1307鈣依賴性細胞間粘附Vangl23.1179WNT信號傳導Gabarapl23.7063高爾基體轉運Rab374.5323小GTP酶介導的信號傳導

表4FC≥3.0的表達上調(diào)基因

基因FC值參與生理過程Mpo4.3863炎癥反應Pigb3.3760糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白合成和代謝Ndufv13.0008氧化磷酸化Ctla2b3.2678負向調(diào)控肽鏈內(nèi)切酶活性Hdac104.3969組蛋白表觀修飾(H3K9,H4K16)

3討論

雌性哺乳動物隨著年齡增加，其生殖能力下降。研究證明，這種生殖老化乃至失去生殖力的現(xiàn)象表現(xiàn)在多個方面，包括生殖激素的水平下降或紊亂、卵巢卵泡庫儲備下降、卵母細胞數(shù)量持續(xù)減少、卵母細胞質(zhì)量下降以及子宮內(nèi)膜接受性減弱等[5，6]。以昆明白小鼠為實驗模型，選取6～8周、36周和48周分別定為青年組、中年組和老年組，各組進行卵母細胞體外成熟培養(yǎng)。實驗結果表明，老年組卵母細胞體外受精后原核形成的時間比青年組和中年組時間延遲1 h[7]；老年倉鼠自然交配后合子形成原核的時間較青年倉鼠也存在約1 h的延遲[8]；老化的牛卵母細胞與解凍后的精子進行IVF，合子的原核也推遲出現(xiàn)[9]。從本實驗結果可看出，由老齡和青年CD1小鼠卵母細胞體外受精所得胚胎的囊胚發(fā)育率均具有顯著差異，且整體處理組卵母細胞形成原核的時間延遲約1 h，說明生殖老化導致卵母細胞質(zhì)量下降，進而影響后期發(fā)育能力，與前人實驗結果相一致[10～13]。

目前已有許多文獻報道以卵母細胞作為實驗材料使用表達譜芯片技術進行研究[14～16]，如Pan等人使用表達譜芯片對各個發(fā)育時期卵泡內(nèi)的卵母細胞轉錄譜進行分析，研究卵母細胞成熟過程中重要生理過程的機制。之前也有報道使用芯片技術研究生殖老化導致的染色體非整倍性等異常現(xiàn)象[2，3]。本實驗中，老齡小鼠卵母細胞內(nèi)約有5.68%的基因轉錄水平發(fā)生明顯變化，與Hamatani等人結果類似[2]，老齡小鼠卵母細胞DNA受ROS積累等不利因素影響而更容易被損傷[17，18]，組蛋白H3K9和H4K16等位點的乙酰化參與修復DNA損傷，從而保證受精后各種關鍵事件的按時發(fā)生[20]，組蛋白去乙酰化酶HDAC10能夠特異性對H3K9和H4K16進行去乙?；?，而生殖老化對H3K9和H4K16乙?；綗o影響[21，22]，與HDAC10的作用不沖突。因此老齡小鼠卵母細胞Hdac10表達的上調(diào)導致H3K9和H4K16乙?；浇档?，可能會降低合子內(nèi)母源組蛋白乙?；迯褪軗p傷DNA的作用，推遲原核形成。

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cDNA Microarray-Based Analysis of Effects of Aging on Developmental Competence of Murine Oocyte

CHANG Zhuo1,2，F(xiàn)U Xiang-wei1，ZHU Shi-en1*

(1.College of Animal Science and Technology，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2.Beijing General Station of Animal husbandry，Beijing 100101，China)

Abstract：The purpose is to investigate the correlation between the old and young mouse oocyte early embryonic development and the molecular alteration of the old mouse oocyte.Compared with young mice oocytes，the early embryonic pronucleus formation of old mice oocytes after in vitro fertilization(IVF)delays 1 h，ratios of blastocysts appear significant difference(IVF：61.98% vs.70.95%，P<0.05).Furthermore，results of cRNA microarray-based analysis show that within the increasing of age，1737 genes expression showed significant difference(fold-change is not less than 2).Ratios of up-regulated and down-regulated genes are 64.9% and 35.1% respectively，which make oocyte quality decline.Therefore，differentially expression of genes which affected by the reproductive aging，such as Hdac10，makes oocyte quality decline，and has an great impact on the development competence ultimately.

Key words：oocyte；reproductive aging；meiosis；genetic expression；mouse

收稿日期：2016-04-26

基金項目：國家自然科學基金(項目編號31372307)

作者簡介：常卓(1989-)，女，碩士研究生，畜禽遺傳資源保護與利用。 通信作者：朱士恩(1956-)，男，教授，博士生導師。E-mail：zhushien@cau.edu.cn

中圖分類號：S814.3

文獻標識碼：A

文章編號：1005-2739(2016)04-0007-05