魏慶宏

(陽煤集團第三醫(yī)院 骨科，山西 陽泉 045000)

硫酸軟骨素抑制實驗性骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的體內(nèi)研究

魏慶宏Δ

(陽煤集團第三醫(yī)院 骨科，山西 陽泉 045000)

目的 探討硫酸軟骨素對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響，并研究其可能的作用機制。方法 均采用改良Hulth造模法對20只新西蘭兔進(jìn)行造模實驗，每組10只，給藥組從第4周開始每天2次用5 g/mL硫酸軟骨素灌胃，模型組給予等量0.9%NaCl溶液。給藥結(jié)束后取兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織切片后HE染色，觀察組織形態(tài)學(xué)變化。用Propidium Iodide染色法檢測2組兔軟骨細(xì)胞凋亡情況，Ki67染色法檢測細(xì)胞增殖。RT-qPCR檢測mRNA水平上凋亡因子Caspases-3和凋亡抑制因子Bcl-2的表達(dá)變化。結(jié)果 形態(tài)學(xué)觀察及HE染色結(jié)果顯示，給藥組的病理變化程度較模型組輕。給藥組股骨髁、脛骨平臺軟骨評分顯著優(yōu)于模型組(P<0.01)。給藥組凋亡指數(shù)明顯低于模型組凋亡指數(shù)(P<0.01)。給藥組細(xì)胞的Ki67陽性率明顯高于模型組(P<0.001)。給藥組中Caspase-3的mRNA水平明顯低于模型組(P<0.001)(圖3A)；而與此相對的，Bcl-2 mRNA水平明顯高于模型組(P<0.001)。結(jié)論 硫酸軟骨素能夠抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞過度凋亡，并減少凋亡基因Caspase-3的表達(dá)和增加凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)。

硫酸軟骨素；骨關(guān)節(jié)炎；動物模型；軟骨細(xì)胞；凋亡

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)疾病，常見于中老年人群，其主要病理特征是關(guān)節(jié)軟骨退行性變，其中膝骨關(guān)節(jié)炎是臨床上最常見的關(guān)節(jié)炎癥狀[1]。近年來OA成為臨床醫(yī)生的重點研究疾病，并發(fā)現(xiàn)OA的發(fā)病涉及多方面的因素，因此其具體發(fā)病機制目前仍不明了。目前有關(guān)OA的研究尚未完全揭示其發(fā)病機制，完全治愈OA尚十分困難。目前觀點認(rèn)為開發(fā)能有效延緩關(guān)節(jié)軟骨退變的藥物是當(dāng)前治療OA的關(guān)鍵[2-3]。

硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，CS)屬于酸性黏多糖，廣泛存在于人和動物軟骨組織中[4]，是結(jié)締組織的重要組成成分，具有多重藥理作用，除了具有抗炎作用外，還具有保護(hù)心腦血管、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)作用，硫酸軟骨素還參與免疫調(diào)節(jié)，并具有抗腫瘤作用等[5]。臨床上硫酸軟骨素主要用于預(yù)防和治療骨關(guān)節(jié)炎、眼科疾病和心腦血管疾病等。其中CS是骨關(guān)節(jié)炎治療的重要輔助藥物，使用硫酸軟骨素治療骨關(guān)節(jié)炎不但療效顯著，而且作用溫和，不良反應(yīng)小，可以長期服用。本實驗旨在研究硫酸軟骨素對OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響，為硫酸軟骨素治療骨關(guān)節(jié)炎應(yīng)用于臨床治療提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：選取健康6～8月齡新西蘭大耳白兔20只(中南大學(xué)湘雅二院實驗動物室提供)，合格證號：SCXK(湘)2003-0003，雌雄各半，體質(zhì)量2.5～2.8 kg。本研究遵循《實驗動物保護(hù)條例》相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 主要儀器：iQ5實時熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；BX53倒置顯微鏡，日本Olympus公司。

1.1.3 主要試劑：硫酸軟骨素(唐山市福樂藥業(yè)有限公司，國食健字G20040025)；熒光染料Propidium iodide，Sigma公司；熒光染料DAPI，Sigma公司；RNA抽提試劑盒，Omega公司；SYBR熒光定量PCR試劑盒，TAKARA公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TAKARA公司；β-actin引物、Caspase-3引物及Bcl-2引物，生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立：采用改良Hulth造模法建立OA模型[6]，X線檢測顯示兔骨關(guān)節(jié)炎OA模型表明造模成功。取20只新西蘭兔，用0.5%水合氯醛按4 mL/kg腹腔注射麻醉兔，固定四肢后剃毛和術(shù)區(qū)消毒。切斷前交叉韌帶及內(nèi)側(cè)半月板，關(guān)節(jié)沖洗，縫合，行抽屜試驗驗證造模是否成功。造模成功后，將全部兔子隨機分為模型組和給藥組，每組10只。

1.2.2 給藥：根據(jù)Meeh-Rubner公式[7]確定硫酸軟骨素給藥劑量。給藥組每天2次用5 g/mL的硫酸軟骨素灌胃 (具體劑量為1 mg/kg)。模型組每天2次用等體積0.9%NaCl溶液灌胃，給藥6周后處死動物取材并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、基質(zhì)染色、表面規(guī)則性、軟骨厚度和與邊緣結(jié)合度對軟骨行組織進(jìn)行評分比較。

1.2.3 取材與切片：處死動物后立即解剖兔的右側(cè)膝關(guān)節(jié)，取大小股骨內(nèi)髁全層軟骨，用4%多聚甲醛固定后過夜，石蠟包埋后切片，行常規(guī)HE染色。取全部動物股骨內(nèi)髁組織，用4%多聚甲醛固定過夜，余下的軟骨和脛骨平臺的軟骨切取后，用RNA抽提試劑盒抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后供PCR檢測用。

1.2.4 軟骨細(xì)胞凋亡檢測：用Propidium Iodide染色通過紅色熒光標(biāo)記全部10只兔子凋亡細(xì)胞。DAPI染色計數(shù)總體細(xì)胞數(shù)(放大倍數(shù)400)，每張切片取至少10個視野拍照并統(tǒng)計數(shù)據(jù)，凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.5 細(xì)胞增殖檢測：采用增殖指標(biāo)Ki67檢測全部10只兔子軟骨細(xì)胞增殖情況，有紅色熒光的細(xì)胞即Ki67陽性細(xì)胞，DAPI染全部細(xì)胞的細(xì)胞核。增殖指數(shù)PI=Ki67陽性細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.6 熒光定量PCR檢測：RT-qPCR的反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s預(yù)變性， 95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)40次，根據(jù)溶解曲線豐度確認(rèn)PCR擴增過程的特異性。每個樣品重復(fù)3個孔，每組實驗重復(fù)3次，取Ct值進(jìn)行分析。β-actin mRNA為內(nèi)參照，依據(jù)公式ΔCt=Ct靶基因-Ctβ-actin分別計算各給藥組和模型組中靶基因的ΔCt。引物序列如下，Caspase-3-F：5’-TTCATTATTC-AGGCCTGCCG-3’，Caspase-3-R：5’-GCAAAGTGA-CTGGATGAACC-3’； Bcl-2-F：5’-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA-3’，Bcl-2-R：5’-GACG-GTAGCGACGAGAGAAG-3’； β-actin-F：5’-CCGCGCTCGTCGTCG-ACAAC-3’，β-actin-R：5’-AGGGTGAGGATGCCTCTCTT-3’。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，模型組關(guān)節(jié)軟骨變軟且邊緣有骨贅形成，關(guān)節(jié)液量增多；軟骨逐漸失去光澤，呈灰黃色；關(guān)節(jié)表面粗糙，并伴有裂紋、糜爛及潰瘍形成，有的較深可達(dá)骨質(zhì)，軟骨下出現(xiàn)骨板暴露。給藥組的病理變化程度明顯較輕，軟骨色澤明亮，無裂紋及軟化；只有部分標(biāo)本表面有裂紋或者細(xì)小潰瘍，并且無明顯裂紋、糜爛及潰瘍形成。見圖1。

圖1 股骨髁和脛骨平臺的大體形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Gross morphological observation of femoral condyle and tibial plateau

組別 只數(shù)股骨髁脛骨平臺模型組62.00±0.672.30±0.67給藥組60.70±0.48**1.20±0.42**

**P<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.2 HE染色 模型組軟骨結(jié)構(gòu)遭到破壞，表層出現(xiàn)缺損，軟骨細(xì)胞排列紊亂，整體細(xì)胞數(shù)目減少，關(guān)節(jié)深層著色較深，細(xì)胞多有聚集。給藥組的關(guān)節(jié)軟骨表層光滑，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞整體分布均勻，排列規(guī)則。見圖2。

圖2 HE染色(×100)Fig.2 Histological evaluation of tibial plateau (×100 )

2.3 軟骨細(xì)胞凋亡 凋亡軟骨細(xì)胞主要分布在軟骨的中淺層。模型組軟骨凋亡陽性細(xì)胞較多(圖3A)。硫酸軟骨素給藥組凋亡指數(shù)(7.0±2.2)%明顯低于模型組凋亡指數(shù)(20.2±2.8)%(P<0.01)(圖3B)。

圖3 Propidium iodide染色檢測細(xì)胞凋亡A：細(xì)胞凋亡(×400 )；B：PI陽性細(xì)胞***P<0.001，與模型組比較Fig.3 Cell apoptosis detection by propidium iodide stainingA:apoptosis; B:PI positive cells(n=10，±s)***P<0.001，compared with model group

2.4 Ki67增殖指標(biāo)檢測 通過對模型組和給藥組Ki67表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn)，硫酸軟骨素給藥組細(xì)胞的Ki67陽性率(9.0 ± 1.2)%明顯高于模型組(3.1 ± 1.1)%(P<0.001)。見圖4。

圖4 Ki67染色檢測細(xì)胞增殖A:Ki67染色圖片(×400)；B:Ki67陽性細(xì)胞比例***P<0.001，與模型組比較 Fig.4 Cells proliferation detection by Ki67 dyeing A:Ki67 dyeing(×400); B:percentage of Ki67 ***P<0.001，compared with model group

2.5 硫酸軟骨素對Caspase-3和Bcl-2表達(dá)的影響 利用熒光定量PCR分別檢測模型組和給藥組組織中Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，硫酸軟骨素給藥組中Caspase-3的mRNA水平明顯低于模型組(24.0±5.8 vs 7.2±3.5)(P<0.001)(圖5A)；而與此相對的，Bcl-2 mRNA水平明顯高于模型組(3.8±1.4 vs 9.2±2.8)(P<0.001)(圖5B)。

圖5 硫酸軟骨素對Caspase-3和Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響A：Caspase-3 mRNA表達(dá)的變化；B：Bcl-2 mRNA表達(dá)的變化***P<0.001，與模型組比較Fig.5 The influence of chondroitin sulfate on mRNA expression levels of Caspase-3 and Bcl-2 (n=10，±s)A:Caspase-3 mRNA expression; B:Bcl-2 mRNA expression***P<0.001，compared with model group

3 討論

OA是一種常見的關(guān)節(jié)軟骨退行性變，其主要病理特征是關(guān)節(jié)軟骨降解。關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)組成，屬透明軟骨，是一種無血管及淋巴分布的結(jié)締組織。有研究表明，OA患者的軟骨細(xì)胞凋亡程度明顯高于正常軟骨組織[8]。也有研究表明，實驗性兔與人的OA原位雜交及TUNEL結(jié)果相似，并且關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡程度均明顯高于正常軟骨組織，這些結(jié)果說明軟骨細(xì)胞過度凋亡是OA發(fā)生的重要機制[9]。

Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡過程的最重要的調(diào)節(jié)因素之一[10]。Bcl-2常作為凋亡拮抗蛋白存在，其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、臨床治療及預(yù)后等過程均密切相關(guān)，通過調(diào)控Bcl-2的表達(dá)水平并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡已經(jīng)成為腫瘤治療的重要策略之一[11-13]。Caspases蛋白幾乎調(diào)控所有凋亡相關(guān)的信號通路，Caspase-3在其中起核心作用。正常情況下，Caspases蛋白以無活性的酶原存在，Caspases水解成活性Caspases，并進(jìn)一步激活Caspases活化的核酸內(nèi)切酶CAD切割DNA，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。已有多種腫瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)生被證明均與Caspase-3活性變化有關(guān)，并且多數(shù)藥物所誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡都是通過激活 Caspases引起[14]。

硫酸軟骨素是構(gòu)成軟骨組織的重要組成成分，屬于糖胺聚糖的一種[15]，硫酸軟骨素由D-葡糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖以β-1,4-糖苷鍵連接而成的重復(fù)二糖單位組成。硫酸軟骨素改善血液循環(huán)、加速新陳代謝、促進(jìn)滲透液的吸收及炎癥的消除等多種重要功能，其作為改善關(guān)節(jié)病的補充品經(jīng)過多年的應(yīng)用，已經(jīng)證明對改善老年退行性關(guān)節(jié)病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有顯著效果[16]。

本文通過建立兔骨關(guān)節(jié)炎模型，研究硫酸軟骨素對實驗性骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響。本研究利用Propidium iodide染色檢測細(xì)胞的凋亡，硫酸軟骨素給藥組凋亡指數(shù)明顯低于模型組凋亡指數(shù)(P<0.01)，可見硫酸軟骨素可以明顯降低軟骨細(xì)胞的凋亡指數(shù)。之后利用Ki67的表達(dá)水平用來檢測軟骨細(xì)胞的增殖能力，硫酸軟骨素給藥組細(xì)胞的Ki67陽性率明顯高于模型組(P<0.001)，表明硫酸軟骨素處理能夠增強軟骨細(xì)胞的增殖能力?？梢栽黾蛹?xì)胞的增殖指數(shù)。Caspase-3是凋亡蛋白，而Bcl-2一般作為凋亡拮抗蛋白存在，本研究熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，硫酸軟骨素給藥組中Caspase-3 mRNA水平明顯低于模型組(P<0.001)，Bcl-2 mRNA水平明顯高于模型組(P<0.001)(圖5B)。

綜上所述，硫酸軟骨素可以抑制實驗性骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的凋亡，這種抑制可能是通過下調(diào)Caspases-3和上調(diào)Bcl-2實現(xiàn)。

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(編校：王儼儼)

Inhibition of chondroitin sulfate on apoptosis of chondrocyte in experimental osteoarthritisinvivo

WEI Qing-hongΔ

(Department of Orthopedic, The Third Affiliated Hospital of Yangquan Coal Industry(Group)Co.,Ltd, Yangquan 045000, China)

ObjectiveTo explore the inhibitory effect of chondroitin sulfate on apoptosis of chondrocyte in experimental osteoarthritisinvivoand its mechanism.Methods20 New Zealand white rabbits were established osteoarthritis model by improved Hulth modeling method with 10 rabbits in each group, the treatment group

5 g/mL chondroitin sulfate by gavage from the 4thweek, twice daily, and the model group received 0.9%NaCl solution.After treatment, the cartilage tissue of keen was taken out and histomorphology was observed by HE dyeing.The apoptosis of cartilage cells was observed by Propidium Iodide method, and cell proliferation was detected by Ki67 dyeing.The related apoptosis factor of Caspases-3 and Bcl-2 mRNA were detected by RT-qPCR.ResultsThe morphological observation and HE results showed that the pathological change in treatment group was slighter than mondel group.The cartilage scores of condyles of femur and tibial plateau were better than model group(P<0.01).The apoptosis index in treatment group was lower than model group(P<0.01).The Ki67 positive rate in treatment group was higher than model group(P<0.001).The levels of Caspase-3 mRNA was lower and Bcl-2 mRNA was higher in treatment group than model group(P<0.001).ConclusionThe chondroitin sulfate could inhibit the excessive osteoarthritis chondrocytes apoptosis , and reduce the expression of apoptosis gene caspase-3, while increase the expression of apoptosis inhibiting gene Bcl-2.

chondroitin sulfate; osteoarthritis; animal model; cartilage cells; apoptosis

魏慶宏，通信作者，男，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：骨關(guān)節(jié)炎，E-mail：woshiweiqinghong@tom.com。

R33

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.13