高詠涵，謝鯤鵬，謝明杰

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點實驗室，遼寧 大連 116081)

環(huán)丙沙星聯(lián)合不同中藥對金黃色葡萄球菌突變選擇窗的影響

高詠涵，謝鯤鵬，謝明杰Δ

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點實驗室，遼寧 大連 116081)

目的 研究環(huán)丙沙星分別聯(lián)合中藥五倍子、黃柏和地榆對金黃色葡萄球菌突變選擇窗(mutant selection window，MSW)的影響。方法 采用微量肉湯二倍稀釋法測定環(huán)丙沙星、五倍子、黃柏和地榆4種藥物單獨使用及環(huán)丙沙星分別與3種中藥聯(lián)合使用對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)和防耐藥變異濃度(mutant prevention concentration，MPC)，并計算聯(lián)合用藥后的MSW。結(jié)果 環(huán)丙沙星、五倍子、黃柏、地榆單用對金黃色葡萄球菌的MIC分別為0.2 μg/mL、12.5 μg/mL、0.4 mg/mL、0.2 mg/mL。MPC分別為1.6 μg/mL、200 μg/mL、2.56 mg/mL、0.352 mg/mL。環(huán)丙沙星分別與8 MIC五倍子、1/2 MIC黃柏和1 MIC的地榆聯(lián)用后，可使環(huán)丙沙星對金黃色葡萄球菌的MSW均縮小了4倍；其中環(huán)丙沙星與4 MIC的黃柏聯(lián)用能關(guān)閉金黃色葡萄球菌的MSW。結(jié)論 環(huán)丙沙星與五倍子、黃柏和地榆聯(lián)用，可以明顯降低各自單獨用藥對金黃色葡萄球菌的MPC，其中聯(lián)合黃柏降低其MPC幅度最大，MSW縮小效果最好。對臨床合理用藥，防止細(xì)菌耐藥性突變株的產(chǎn)生具有一定的指導(dǎo)意義。

金黃色葡萄球菌；環(huán)丙沙星；五倍子；黃柏；地榆；突變選擇窗

金黃色葡萄球菌是威脅人類的重要病原菌，也是臨床上常見的致病菌之一。環(huán)丙沙星是喹諾酮類藥物中的一種高效廣譜抗菌藥[1]，長期被用于治療金黃色葡萄球菌。隨著環(huán)丙沙星在臨床中用量的增加，金黃色葡萄球菌對環(huán)丙沙星的耐藥率逐年上升[2-3]。Zhao等[4-5]提出的MSW理論認(rèn)為，體內(nèi)的藥物濃度在病原菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)和防耐藥變異濃度(mutation preventive concentration，MPC)之間時，耐藥突變株會被選擇性擴增，導(dǎo)致病原菌耐藥。只有當(dāng)藥物濃度超過MPC值時才會抑制耐藥菌產(chǎn)生。但在實際應(yīng)用中，單藥給藥很難達(dá)到MPC，因此常采用聯(lián)合用藥的方法通過關(guān)閉或縮小MSW來防止耐藥菌的產(chǎn)生。中藥具有毒性低、來源廣、價格低廉等優(yōu)點。金建玲等[6]認(rèn)為中西藥聯(lián)合使用在應(yīng)對細(xì)菌抗藥性方面具有多重優(yōu)勢。本文旨在通過體外測定環(huán)丙沙星與五倍子、黃柏和地榆聯(lián)合用藥后對金黃色葡萄球菌MIC和MPC的影響，研究聯(lián)合用藥是否能關(guān)閉或縮小金黃色葡萄球菌的突變選擇窗(mutant selection window，MSW)，從而為臨床合理用藥，防止細(xì)菌耐藥性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 供試菌株和培養(yǎng)基：金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC26112)，購于中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心。MH肉湯和MH瓊脂，購于中國藥品生物制品鑒定所。

抗菌藥物和試劑：環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CIP)：購于上海生工生物有限公司。五倍子、黃柏和地榆由遼寧師范大學(xué)中藥現(xiàn)代化實驗室提供。其他試劑購于賽拓(大連)生物科技有限公司。

儀器：THZ-82B氣浴恒溫振蕩器(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)。HPX-9082MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。TDL-5低速臺式大容量離心機(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 五倍子、黃柏和地榆的制備：分別稱取一定量的五倍子、黃柏和地榆，用濃度95%的乙醇在索氏提取器中熱回流提取8 h，將提取液蒸干制成干粉。然后用無水乙醇配成10 mg/mL的藥液，0.22 um濾器過濾備用。

1.2.2 環(huán)丙沙星、五倍子、黃柏和地榆對金黃色葡萄球菌MIC的測定：采用微量肉湯二倍稀釋法[7-8]。在無菌96孔板中，分別加入100 μL培養(yǎng)至對數(shù)期的菌懸液(106cfu/mL)，再分別加入100 μL不同濃度的環(huán)丙沙星和五倍子等中藥，使環(huán)丙沙星的終濃度為0.0625、0.125、0.25、0.5 μg/mL；五倍子的終濃度為6.25、12.5、25、50 μg/mL；黃柏的終濃度為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μg/mL；地榆的終濃度為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μg/mL。每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，以不加藥的培養(yǎng)基作為對照，37 ℃下1000 r/min搖床中培養(yǎng)24 h。然后每孔分別加入20 μL濃度為0.2%的2,3,5-氯代三苯基四氮唑(TTC)，1000 r/min搖床下繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h。用肉眼觀察，以沒有紅色還原物甲臢(TTC 是一種常用的活菌染料，其氧化態(tài)是無色的，該染料進入細(xì)胞后，TTC 和活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，生成紅色的還原產(chǎn)物甲臜。因此活細(xì)胞為紅色，死細(xì)胞為無色)產(chǎn)生的最低濃度作為暫定MIC。再以暫定MIC為基準(zhǔn)，按照20%的抗菌藥物濃度進行線性遞減，重復(fù)MIC的測定步驟。以沒有紅色還原物甲臢產(chǎn)生的最低濃度作為最終的MIC。

1.2.3 環(huán)丙沙星、五倍子、黃柏和地榆對金黃色葡萄球菌MPC的測定[9-11]

① 含單藥瓊脂平板的制備：以單藥的MIC為基準(zhǔn)，用倍比稀釋法分別制備含有環(huán)丙沙星、五倍子、黃柏和地榆的不同藥物濃度MH瓊脂平板(藥物濃度梯度分別是1 MIC～16 MIC)，每個濃度制備4個平板。

② 含兩藥瓊脂平板的制備：分別以環(huán)丙沙星、五倍子、黃柏和地榆4種藥物的MIC和MPC為基準(zhǔn)，采用倍比稀釋法分別制備含環(huán)丙沙星和五倍子，環(huán)丙沙星和黃柏，環(huán)丙沙星和地榆的組合MH瓊脂平板。藥物濃度均從1/4 MIC到MPC，每個藥物濃度的組合制備4個平板。

③ MPC結(jié)果的判定：將培養(yǎng)至對數(shù)期的金黃色葡萄球菌，調(diào)整到濃度為3×1010cFu/mL，然后，取100 μL細(xì)菌濃縮液置于所配制的含不同濃度藥物的MH平皿上，涂布均勻，35 ℃培養(yǎng)72 h。以平皿中無細(xì)菌生長的最低藥物濃度為暫定MPC(MPCpr)，再以MPCpr為基準(zhǔn)，按照20%的抗菌藥物濃度進行線性遞減，重復(fù)MPC的測定步驟，重復(fù)3次，每個濃度3個平板，通過肉眼觀察，以無菌生長的最低藥物濃度作為最終的MPC。

2 結(jié)果

2.1 單獨用藥對金黃色葡萄球菌MIC和MPC的影響 實驗結(jié)果顯示，五倍子、黃柏和地榆均能抑制金黃色葡萄球菌的生長，且抑制作用呈濃度劑量依賴。單獨用藥對金黃色葡萄球菌的MIC和MPC結(jié)果見表1。

表1 單獨用藥對金黃色葡萄球菌MIC和MPC的影響(n=3)Tab.1 Effect of each drug on MIC and MPC of staphylococcas aureus(n=3)

2.2 環(huán)丙沙星聯(lián)合用藥對金黃色葡萄球菌MSW的影響 環(huán)丙沙星與五倍子、黃柏和地榆分別聯(lián)合用藥對金黃色葡萄球菌MSW的影響結(jié)果見表2、表3、表4。當(dāng)環(huán)丙沙星分別與8 MIC五倍子、1MIC地榆和1/2 MIC黃柏聯(lián)用后，環(huán)丙沙星對金黃色葡萄球菌的MSW均縮小了4倍；環(huán)丙沙星與4 MIC黃柏聯(lián)用能完全關(guān)閉金黃色葡萄球菌的MSW。

表2 環(huán)丙沙星聯(lián)合五倍子對金黃色葡萄球菌MSW的影響(n=3)Tab.2 Effect of ciprofloxacin combined with gallnut on the MSW of staphylococcus aureus(n=3)

“+”有耐藥突變株生長，indicates that bacterial growing positively；“-”無耐藥突變株生長，indicates that no bacterial growth

表3 環(huán)丙沙星聯(lián)合黃柏對金黃色葡萄球菌MSW的影響(n=3)

“+”有耐藥突變株生長，indicates that bacterial growing positively；“-”無耐藥突變株生長， indicates that no bacterial growth

表4 環(huán)丙沙星聯(lián)合地榆對金黃色葡萄球菌MSW的影響(n=3)

“+”有耐藥突變株生長，indicates that bacterial growing positively；“-”無耐藥突變株生長，indicates that no bacterial growth

3 討論

目前臨床應(yīng)用抗菌藥物一般遵循MIC理論，認(rèn)為只要藥物濃度高于MIC，就能夠有效殺滅敏感菌[12]。但在實際應(yīng)用中，這種用藥原則是引起細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的原因之一。最新的MSW理論認(rèn)為，當(dāng)藥物濃度位于MSW范圍內(nèi)時，耐藥突變體會被選擇性擴增，產(chǎn)生大量耐藥菌。只有當(dāng)藥物濃度達(dá)到或超過MSW時，才會抑制耐藥菌的產(chǎn)生。但增大給藥劑量，使藥物濃度達(dá)到MSW上限值時，會使機體產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，這種治療方案在臨床上也是不可行的。因此選用2種不同作用機制的抗菌藥物聯(lián)用，通過縮小或關(guān)閉MSW的方法是解決細(xì)菌耐藥性的方法之一[13]。中藥具有天然、污染小、副作用少、過敏反應(yīng)少和不易產(chǎn)生抗藥性等特點，能夠克服抗生素濫用帶來的弊端，因此中藥逐漸成為研究的熱點，中西藥聯(lián)合使用也成為減緩和控制細(xì)菌對抗生素耐藥性逐年增長的一條可行性途徑。本文研究了環(huán)丙沙星聯(lián)合中藥五倍子、黃柏、地榆對金黃色葡萄球菌突變選擇窗(MSW)的影響。結(jié)果顯示，環(huán)丙沙星聯(lián)用一定濃度的五倍子、黃柏和地榆后，可降低環(huán)丙沙星對金黃色葡萄球菌的MPC，其中環(huán)丙沙星與4MIC的黃柏聯(lián)用后能完全關(guān)閉金黃色葡萄球菌的MSW。因此將現(xiàn)有的抗菌藥物與中藥聯(lián)合，通過縮小或關(guān)閉金黃色葡萄球菌的MSW的方法，可以有效地防止細(xì)菌耐藥突變株的產(chǎn)生[16-17]。由于體內(nèi)的藥物濃度是處于一種動態(tài)的變化之中[18]，因此體外的研究結(jié)果，并不能簡單的應(yīng)用于臨床，還應(yīng)通過進一步的研究進行驗證。

[1] 徐紅云，劉春林，李宜錚，等.傷口感染病原菌分布 及耐藥譜分析[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2013，25(11)：1313-1316.

[2] 胡仁靜，嚴(yán)子禾，胡錫池，等.金黃色葡萄球菌的耐藥分析[J].職業(yè)與健康，2009，25(24)：2859-2860.

[3] 陳孝進，彭蘭. 5年臨床常見病原菌對環(huán)丙沙星耐藥趨勢[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2006，16(2)：216-217.

[4] Dong YZ,Zhao XL,Domagala J,et al.Effect of fluoroquilonone concentration on selection of resistant mutants of Mycobactenum bovis BCG and Staphylococcus aureus[J].Antimicro Agents Chemother,1999,43:1756-1758.

[5] Zhao XL, Drlica K.Restricting the selection of antibiotic·resistant mutants：a general strategy derived from fluoroquinolonestudies[J]. Clin Infect Dis,2001,33(l3)：147-156.

[6] 金建玲，徐軻，高培基，等.中西藥聯(lián)合使用在應(yīng)對細(xì)菌抗藥性方面的優(yōu)勢[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2011，39(4)：1002-2392.

[7] 耿昕穎，葛錚，孔令聰，等. 52株不同淡水魚類維氏氣單胞菌耐藥表型的分析[J].中國獸藥雜志，2015，49(6)：1-5.

[8] 趙凌旭，王蕾.中藥黃檗對金黃色葡萄球菌體外抑菌效果的初步研究[J].檢驗醫(yī)學(xué)，2015，(9)：1673-8640.

[9] 李朝霞，劉又寧，王睿，等.左氧氟沙星聯(lián)合萬古霉素縮小金黃色葡萄球菌耐藥突變選擇窗的初步研究[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2007，12(8)：911-914.

[10] 張雨菡，王麗平，陸承平，等. 氟喹諾酮類抗茵藥對臨床分離豬鏈球菌的防耐藥變異濃度測定及一步耐藥突變株的篩選[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2011，42(1)：71 -76.

[11] 姚國新，張麗華，湯遠(yuǎn)亮，等. 金黃色葡萄球菌防耐藥突變濃度測定方法的影響因素分析[J].中國藥師，2010，13(8)：1147-1148.

[12] 崔俊昌，劉又寧，王睿，等.4種氟喹諾酮類藥物對金黃色葡萄球菌的防耐藥變異濃度[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2004，84(22)：1863-1866.

[13] Drlica K.A strategy for fighting antibiotic resistance[J].ASM News,2001,67:27-33.

[14] 陳晴，謝鯤鵬，云寶儀，等.黃柏等中草藥對MRSA的抑菌作用及其對質(zhì)粒的消除作用[J].微生物學(xué)雜志，2013，33(3)：1005-7021.

[15] 李仲興，王秀華，張明明，等.五倍子乙醇提取物對金葡菌的體外抗菌研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2005，16(2)：103-105.

[16] 劉淼，劉海鳳，鄭風(fēng)勁.耐藥突變選擇窗與抗菌藥物防耐藥突變濃度的研究進展[J].四川解剖學(xué)雜志，2012，20(2)：1005-1457.

[17] 陳瑜，張智潔，孫繼梅，等.四種氟喹諾酮藥物對嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌防耐藥變異濃度的測定[J].中國抗生素雜志，2016，3(14)：216-219.

[18] 盛美艷，張蕓，劉明濤，等.環(huán)丙沙星在兔血液與組織液中的藥動學(xué)[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010，41(7)：1001-8255.

(編校：吳茜)

Effect of ciprofloxacin combined with different Chinese traditional medicine on mutant selection window ofStaphylococcusaureus

GAO Yong-han, XIE Kun-peng, XIE Ming-jieΔ

(College of Life Science, Liaoning Normal University, Key Laboratory of Biotechnology and Drug Discovery of Liaoning Province, Dalian 11608, China)

ObjectiveTo study the influence of ciprofloxacin combined with Chinese traditional medicine gallnut, golden cypress and Sanguisorba officinalis on the mutant selection window(MSW) ofstaphylococcusaureus. MethodsThe minimal inhibitory concentration(MIC) and the mutant prevention concentration(MPC) of ciprofloxacin, gallnut, golden cypress, Sanguisorba officinalis each single and combined were measured by the method of broth dilution technique and MSW were calculates respectively.ResultsMIC of ciprofloxacin, gallnut,golden cypress and Sanguisorba officinalis for staphylococcus aureus separately were 0.2 μg/mL, 12.5 μg/mL, 0.4 mg/mL, 0.2 mg/mL and MPC separately were 1.6 μg/mL, 200 μg/mL, 2.56 mg/mL, 0.352 mg/mL. The combination of ciprofloxacin, 8 MIC gallnut,1/2 MIC golden cypress and 1 MIC Sanguisorba officinalis makes MSW of ciprofloxacin for staphylococcus aureus reduced by 4 times; the ciprofloxacin and 4 MIC of golden cypress in combination can close the MSW ofstaphylococcusaureus. ConclusionCompared with each one alone, the combination of ciprofloxacin separately with gallnut, golden cypress and Sanguisorba officinalis can obviously decrease the MPC of staphylococcus aureus, the combination of ciprofloxacin and golden cypress were more evidently in dropping the MPC ofstaphylococcusaureusand the effect of narrower MSW is the best, which give a certain guiding for rational drug use and prevention the production of mutant strains of bacterial resistance.

staphylococcusaureus;ciprofloxacin;gallnut;golden cypress; Sanguisorba officinalis; mutant selection window

高詠涵，女，學(xué)士在讀，研究方向：生物科學(xué)，E-mail：106242825@qq.com；謝明杰，通信作者，女，博士，教授，研究方向：微生物生化，E-mail：xmj1222@sina.com。

R285.5

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.61