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        苦菜總黃酮對(duì)去卵巢豚鼠骨代謝生化指標(biāo)的影響

        2016-07-23 03:16:27劉仰斌張志花
        關(guān)鍵詞:骨代謝總黃酮苦菜

        劉仰斌,張志花

        (贛南醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,江西 贛州 341000)

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        ·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

        苦菜總黃酮對(duì)去卵巢豚鼠骨代謝生化指標(biāo)的影響

        劉仰斌,張志花

        (贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,江西贛州341000)

        【摘要】目的:探討苦菜總黃酮對(duì)去卵巢豚鼠骨代謝的影響。方法:用去卵巢方法建立豚鼠骨代謝紊亂動(dòng)物模型,30只雌豚鼠,隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組、骨質(zhì)疏松模型組、陽(yáng)性藥物組、低劑量苦菜總黃酮組(0.1 mg/kg)、高劑量苦菜總黃酮組(0.3 mg/kg)。建模1周后,分別給予生理鹽水、雌激素和不同劑量的苦菜總黃酮,給藥6周后,檢測(cè)豚鼠骨長(zhǎng)度和骨質(zhì)量指數(shù),同時(shí)檢測(cè)血清電解質(zhì)、堿性磷酸酶(AKP)、骨鈣素(BGP)和肝組織抗酒石酸酸性磷酸酶(TrACP-5b)等生化指標(biāo)。結(jié)果:①苦菜總黃酮可以增大股骨和脛骨長(zhǎng)度指數(shù);②苦菜總黃酮可提高降鈣素的含量;③苦菜總黃酮能升高血清AKP,降低TrACP-5b的含量。結(jié)論: 苦菜總黃酮可通過(guò)調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收途徑,改善去卵巢豚鼠骨代謝的紊亂,顯示類雌激素樣功效,對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥可能起治療作用。

        【關(guān)鍵詞】苦菜;總黃酮;去卵巢;豚鼠;骨代謝

        【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.03.002

        隨著年齡的增長(zhǎng),女性卵巢的功能在減退,尤其是絕經(jīng)后雌激素的下降,導(dǎo)致其各代謝系統(tǒng)出現(xiàn)改變,如血脂增高、動(dòng)脈硬化、骨質(zhì)疏松等[1-2]。臨床上多用雌激素來(lái)治療女性因雌激素下降而引起的癥狀,但各種合成的雌激素不良反應(yīng)較大,使其在臨床上的應(yīng)用受限??嗖嗽趪?guó)內(nèi)分布很廣,日常生活中人們長(zhǎng)期應(yīng)用。我們?cè)谇捌诘难芯恐邪l(fā)現(xiàn)苦菜總黃酮具有降血脂、抑菌、抗病毒、抗腫瘤、改善血液系統(tǒng)等作用[3-7],可以降低去卵巢豚鼠的Lee′s指數(shù)并改善其血脂代謝情況[8]。為進(jìn)一步研究和推廣苦菜的作用,我們通過(guò)建立去卵巢豚鼠的骨質(zhì)疏松模型,觀察苦菜總黃酮對(duì)去卵巢豚鼠骨代謝的生化指標(biāo)影響,為苦菜總黃酮在臨床上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1材料與方法

        1.1藥品與試劑苦菜總黃酮按照文獻(xiàn)[3]的方法先配制好,實(shí)驗(yàn)前用雙蒸水稀釋至實(shí)驗(yàn)各組所需濃度。戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司,批號(hào):030A),降鈣素(calcitonin,CT)、血清骨鈣素(bone gla protein,BGP)、抗酒石酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TrACP-5b)、血清堿性磷酸酶(alkaline aphosphatase,AKP)測(cè)試盒(均為上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。水合氯醛(天津海晶精細(xì)化工廠,批號(hào):20061215),其他試劑均為市售分析純。

        1.2主要儀器設(shè)備Gemini XPS熒光酶標(biāo)儀(美谷分子儀器上海有限公司);超速低溫離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司);SN-695型智能放免γ測(cè)量?jī)x(上海核輻光電儀器有限公司);HD-F2600全自動(dòng)生化分析儀(濟(jì)南漢方醫(yī)療器械有限公司)。

        1.3動(dòng)物分組豚鼠30只,SPF級(jí),均為雌性,自由飲食,體質(zhì)量350~400 g,由贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)為SYXK(贛)2007-0002。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則,在實(shí)驗(yàn)前所有豚鼠均給予人道的關(guān)懷,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)時(shí)30只豚鼠隨機(jī)分為5組(每組6只):①正常對(duì)照組(假手術(shù)組),②骨質(zhì)疏松模型組(卵巢切除組),③陽(yáng)性藥物對(duì)照組[卵巢切除+戊酸雌二醇,80 mg/(kg·d)],④低劑量組(卵巢切除+苦菜總黃酮,0.1 mg/kg),⑤高劑量組(卵巢切除+苦菜總黃酮,0.3 mg/kg)。

        1.4方法

        1.4.1動(dòng)物模型制備術(shù)前豚鼠禁食1 d,不禁水。用10%的水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉后,于平臥位消毒,打開(kāi)腹腔,行腹側(cè)雙側(cè)卵巢切除;正常對(duì)照組僅探查卵巢,不切除,余操作同模型組。術(shù)后1周各組行陰道脫落細(xì)胞檢查,以明確卵巢切除成功。陽(yáng)性藥物組按80 mg/kg戊酸雌二醇混懸液灌胃,苦菜總黃酮組分另按0.1 mg/kg、0.3 mg/kg劑量灌胃,給藥體積為0.5 mL/100g 體質(zhì)量,對(duì)照組及骨質(zhì)疏松模型組大鼠給予等體積的生理鹽水,每天1次,連續(xù)6周。

        1.4.2血清生化檢測(cè)給藥6周后,麻醉大鼠,腹腔動(dòng)脈取血,2000 r/min,4 ℃,離心15 min,分離血清,于-80 ℃冰箱保存。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清鈣、鎂和磷的水平;酶分析方法檢測(cè)血清AKP和TrACP-5b活性。

        1.4.3放射免疫學(xué)方法檢測(cè)血清BGP和CT的含量:取血清,解凍后,3000 r/min,離心10 min,取上清100 μL于已編寫(xiě)號(hào)碼的放免專用試管中,加入相應(yīng)的抗血清100 μL,混勻,再分別加入125I標(biāo)記的BGP、CT,混勻,另設(shè)總放射值管、非特異反應(yīng)管(不加入抗血清)及標(biāo)準(zhǔn)管(S0~S5),4 ℃孵育24 h。除總放射管值外,每管加入免疫分離劑500 μL,充分混勻,室溫放置20 min后,4 ℃,3000 r/min,離心10 min,棄上清,在SN-695型智能放免γ測(cè)量?jī)x上測(cè)定cpm(每分鐘多少次衰變)值,半對(duì)數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別計(jì)算每管血清BGP、CT的含量。

        1.4.4骨質(zhì)量及長(zhǎng)度指數(shù)檢測(cè)分別稱量腰椎、股骨、脛腓骨質(zhì)量,測(cè)量股骨、脛腓骨長(zhǎng)度,計(jì)算腰椎、股骨、脛腓骨質(zhì)量指數(shù)(骨質(zhì)量/豚鼠質(zhì)量),股骨和脛腓骨長(zhǎng)度指數(shù)(骨質(zhì)量/骨質(zhì)長(zhǎng)度)。

        2結(jié)果

        2.1血清Ga2+、Mg2+、磷含量與正常對(duì)照組相比,模型組豚鼠血清Ca2+和Mg2+含量降低、磷含量升高(P<0.05);與模型組相比,陽(yáng)性藥物組血Ca2+水平升高,磷下降(P<0.05),苦菜總黃酮各組血Ca2+含量升高(P<0.05),磷含量與模型組無(wú)明顯差異,見(jiàn)表1。

        表1苦菜總黃酮對(duì)去卵巢豚鼠血清電解質(zhì)含量的影響

        分組nGa2+/(mmol/L)Mg2+/(mmol/L)磷/(mmol/L)正常對(duì)照組64.83±0.311.78±0.092.54±0.31模型組64.08±0.34*1.70±0.10*2.90±0.22*陽(yáng)性藥物組64.70±0.68#1.74±0.042.76±0.18#低劑量組65.09±0.39#1.66±0.012.95±0.21高劑量組64.85±0.58#1.75±0.052.85±0.20F3.7122.9332.994P<0.05<0.05<0.05

        注:*P<0.05與正常對(duì)照組相比,#P<0.05與模型組相比。

        2.2血清AKP活性和肝組織TrACP-5b活性與正常對(duì)照組相比,模型組豚鼠血清AKP活性降低(P<0.01),肝組織TrACP-5b活性升高(P<0.05);與模型組相比,陽(yáng)性藥物組肝組織TrACP-5b活性降低(P<0.01),苦菜總黃酮各組AKP活性升高(P<0.01),肝組織TrACP-5b活性降低(P<0.05),見(jiàn)表2。

        表2苦菜總黃酮對(duì)去卵巢豚鼠血清AKP及肝臟TrACP-5b活性的影響

        分組nAKP/(U/L)TrACP-5b/(U/L)正常對(duì)照組612.67±3.613.17±0.42模型組68.17±1.89**3.99±0.31**陽(yáng)性藥物組68.55±2.902.89±0.30#低劑量組613.10±4.51##3.01±0.31#高劑量組615.10±2.20##3.20±0.34#F5.4819.714P<0.05<0.05

        注:*P<0.05,**P<0.01與正常對(duì)照組相比,#P<0.05,##P<0.01與模型組相比。

        2.3血清BGP和CT含量與正常對(duì)照組相比,模型組豚鼠血清CT含量降低(P<0.05);與模型對(duì)照組相比,陽(yáng)性藥物組血清CT含量升高(P<0.01),苦菜總黃酮各組CT含量升高(P<0.01),見(jiàn)表3。

        2.4骨密度、骨長(zhǎng)度和骨質(zhì)量指數(shù)與正常對(duì)照組相比,模型組豚鼠的股骨和脛骨長(zhǎng)度指數(shù)均減小(P<0.05,P<0.01);實(shí)驗(yàn)6周后與模型組相比,陽(yáng)性藥物組、苦菜總黃酮各組股骨、脛骨長(zhǎng)度指數(shù)均提高(P<0.05,P<0.01),見(jiàn)表4。

        表3苦菜總黃酮對(duì)去卵巢豚鼠BGP、CT的影響

        分組nBGP/(ng/mL)CT/(pg/mL)正常對(duì)照組68.39±1.63138.02±23.43模型組611.09±2.1989.13±11.06*陽(yáng)性藥物組68.55±1.51124.61±25.94##低劑量組69.82±1.55111.09±14.97##高劑量組610.32±1.79124.01±19.29##F2.6155.256P>0.05<0.05

        注:*P<0.05與正常對(duì)照組相比,##P<0.01與模型組相比。

        表4苦菜總黃酮對(duì)去卵巢豚鼠骨長(zhǎng)度和骨質(zhì)量指數(shù)的影響

        分組n腰椎質(zhì)量指數(shù)/(g/kg)股骨質(zhì)量指數(shù)/(g/kg)脛腓骨質(zhì)量指數(shù)/(g/kg)股骨長(zhǎng)度指數(shù)/(mm/kg)脛骨長(zhǎng)度指數(shù)/(mm/kg)正常對(duì)照組64.99±0.574.15±0.1418.61±0.66135.35±8.59149.31±8.91模型組64.28±0.363.46±0.0618.14±1.05119.87±3.68**133.01±6.45**陽(yáng)性藥物組64.90±0.744.23±0.2018.50±0.93137.99±5.70##183.76±7.59##低劑量組65.29±0.423.91±0.8618.70±1.01124.53±4.32#139.71±6.78#高劑量組64.98±0.803.99±0.9818.98±1.02127.67±5.94#143.21±7.69#F2.2691.5380.6309.76441.787P>0.05>0.05>0.05<0.01<0.01

        注:**P<0.01與對(duì)照組相比,#P<0.05,##P<0.01與模型組相比。

        3討論

        正常情況下,骨形成和骨吸收通過(guò)各種調(diào)節(jié)信號(hào)緊密相連。當(dāng)骨吸收活躍并引起骨密度降低和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞時(shí),就會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生,隨之而來(lái)就是骨脆性增加和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。骨質(zhì)疏松癥并發(fā)脆性骨折可使患者致殘,嚴(yán)重危及患者生活質(zhì)量[9]。盡管骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)是嚴(yán)重威脅老年人健康的疾病,但是如何診斷和評(píng)估骨質(zhì)疏松癥危害性卻一直沒(méi)有定論。國(guó)內(nèi)外比較常用的是通過(guò)雙能X線進(jìn)行骨密度檢測(cè)[10],但是最近研究認(rèn)為它僅僅能檢測(cè)受測(cè)部位的骨代謝,不能做全身骨質(zhì)情況評(píng)估,更不能很好地預(yù)測(cè)患者骨折的風(fēng)險(xiǎn),因此評(píng)估骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)往往需要綜合個(gè)體情況及骨生化指標(biāo)來(lái)完成[11]。骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)(bone turnover markers,BTMs)雖然不是診斷骨質(zhì)疏松的標(biāo)準(zhǔn),臨床效用有限,但是抗骨質(zhì)疏松治療后,可以通過(guò)骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)全面評(píng)價(jià)人體骨的代謝情況,從而間接判斷抗骨質(zhì)疏松效果并預(yù)測(cè)骨折的風(fēng)險(xiǎn),因此得到不少學(xué)者的高度重視[12]。

        目前用于制作骨質(zhì)疏松模型的動(dòng)物很多,其中實(shí)驗(yàn)鼠因操作簡(jiǎn)單,成本低,實(shí)驗(yàn)要求差異性最少而成為最常用的模型動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)鼠模型制作方法很多,可行卵巢、睪丸、垂體切除,也可使用激素類藥物達(dá)到骨丟失的目的,但最終仍是通過(guò)生化檢查、骨形態(tài)計(jì)量學(xué)等方法監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)該動(dòng)物模型在預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥的效果[13]。本研究中,我們僅通過(guò)切除成年雌性豚鼠的卵巢模擬婦女絕經(jīng)后的狀態(tài),獲得了去卵巢骨質(zhì)疏松豚鼠模型,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組豚鼠均保持平穩(wěn)狀態(tài),沒(méi)有出現(xiàn)豚鼠異常或死亡現(xiàn)象,顯示本模型穩(wěn)定性好,可重復(fù)操作。

        成骨細(xì)胞(Osteoblast,OB)和破骨細(xì)胞(Osteoclast,OC)是骨代謝最重要的核心細(xì)胞,骨代謝的關(guān)鍵就是這兩種細(xì)胞代謝變化的結(jié)果[14-15]。目前反映成骨細(xì)胞的標(biāo)志物較多,如AKP、BGP、Ⅰ型前膠原羧基末端肽(PICP)等,其中AKP和BGP因擁有較好的生物穩(wěn)定性、較低的個(gè)體差異性且檢測(cè)方法簡(jiǎn)單成為評(píng)估成骨細(xì)胞活性的重要指標(biāo)[16],PICP作為成骨代謝產(chǎn)物也是反映成骨細(xì)胞活性的重要指標(biāo),但是其結(jié)果易受干擾,如半衰期只有6~8 min[17],且在體內(nèi)受不同時(shí)間變化而變化,研究發(fā)現(xiàn)PICP人體含量凌晨比中午高20%,Vasikaran S等研究認(rèn)為PICP可能不僅僅來(lái)源于骨代謝,因此沒(méi)有很好的特異性,一定程度上限制了其在實(shí)踐中的運(yùn)用[18]。TrACP是目前臨床上判斷成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性的重要生化標(biāo)志物,也是骨質(zhì)疏松癥重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一。體外實(shí)驗(yàn)證明,在骨吸收過(guò)程中,破骨細(xì)胞活躍,同時(shí)大量分泌TrACP,因此TrACP 水平可反映破骨細(xì)胞活性和骨吸收狀態(tài)[19]。絕經(jīng)期后的女性因內(nèi)源性雌激素減少,骨重建失衡,骨吸收大于骨形成,會(huì)出現(xiàn)TrACP顯著增加。在正常人血清中,TRACP 以兩種基化形式存在:TRACP-5a 和TRACP-5b。其中TRACP-5b 主要由破骨細(xì)胞分泌,故測(cè)定血清中的TRACP-5b 活性,可以反映體內(nèi)OC 活性和骨吸收狀態(tài)。目前研究認(rèn)為T(mén)RACP-5b 的活性直接反映了OC 在骨組織中的數(shù)量,是反映OC活性的特異性指標(biāo),目前已經(jīng)成為第二代骨吸收生化標(biāo)志[19]。

        本實(shí)驗(yàn)中,我們觀察了苦菜總黃酮對(duì)去卵巢豚鼠骨代謝的生化指標(biāo)影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),苦菜總黃酮可改善去卵巢豚鼠骨代謝有關(guān)的生化指標(biāo),可以提高AKP活性,降低肝組織TrACP-5b活性,說(shuō)明其可以提高成骨細(xì)胞活性,抑制破骨細(xì)胞活性,達(dá)到改善骨代謝作用。結(jié)果提示苦菜總黃酮可通過(guò)調(diào)節(jié)骨代謝水平而改善絕經(jīng)后婦女因體內(nèi)雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥的可能,但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

        總之,苦菜總黃酮對(duì)去卵巢成年動(dòng)物的骨代謝失衡有改善作用,能夠提高成骨細(xì)胞數(shù)量和功能,產(chǎn)生類雌激素對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用。通過(guò)對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的作用,在整體上對(duì)絕經(jīng)后的高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥進(jìn)行改善,降低骨折風(fēng)險(xiǎn),這為進(jìn)一步臨床運(yùn)用提供理論基礎(chǔ)。另外苦菜總黃酮水溶性很好,利用度高,不良反應(yīng)少,來(lái)源天然,價(jià)格便宜,因此具有較好的開(kāi)發(fā)前景。

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        Effects of total flavonoids in the Sonchus oleraceus L.on biochemical index of bone metabolism in ovariectomized guinea pigs

        LIU Yangbin,ZHANG Zhihua

        School of Preclinical Medicine,Gannan Medical University,Ganzhou 341000,China

        【Abstract】Objective:To observe the effect of the total flavonoids in the Sonchus oleraceus L.on bone metabolism in ovariectomized guinea pig.Methods:Thirty female guinea pigs were randomly divided into 5 groups,namely control group,ovariectomized model group,positive drug group,and difference dosage groups of total favonoids from Sonchus oleraceus L.(0.1 mg/kg or 0.3 mg/kg).One week following ovariectomy,the pigs were intragastrically administrated with saline,estradiol valerate or total favonoids from Sonchus oleraceus L.respectively,once a day for six weeks.Then all pigs were sacrificed,and the sera were obtained to detect the electrolytes,bone gla protein (BGP),calcitonin(CT),alkaline aphosphatase (AKP),and liver tissues were taken to observe the tartrate-resistant acid phosphatase (TrACP-5b).Bone length and mass index were also determined in all pigs.Results:Total favonoids from Sonchus oleraceus L.was capable of increasing the length index of the femur and tibia,improving the calcitonin content,and elevating serum AKP level and reducing liver TrACP-5b content.Conclusion:Total favonoids from Sonchus oleraceus L.can improve bone metabolism in ovariectomized pigs through regulating bone formation and resorption,which indicates that this agent can produce estrogen-like effect and be potential therapeutic results for postmenopausal osteoporosis.

        【Key words】Sonchus oleraceus L.;total flavonoids;ovariectomy;guinea pig;bone metabolism

        文章編號(hào):1002-0217(2016)03-0210-04

        基金項(xiàng)目:江酉省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃課題(20122033)

        收稿日期:2015-10-08

        作者簡(jiǎn)介:劉仰斌(1970-),男,副教授,碩士,(電話)15979776628,(電子信箱)15979776628@163.com.

        【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】【中圖號(hào)】R 285.5A

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