徐小勇++許曉玲++劉玉玲

摘要：以椪柑愈傷組織和試管苗為材料，通過酶解分離原生質體，于液體培養(yǎng)和觀察；采用羥自由基測定試劑盒和電子順磁共振技術分析羥自由基變化，通過流式細胞儀檢測總活性氧水平變化。結果發(fā)現，培養(yǎng)的前3 d，愈傷組織原生質體羥自由基和總活性氧水平下降，而葉肉原生質體則升高；培養(yǎng)的后3 d，除愈傷組織原生質體羥自由基水平升高外，其他都下降。椪柑葉肉原生質體可能由于氧化脅迫引起死亡，而愈傷組織原生質體能較好地控制總活性氧水平從而順利進入再生，另外培養(yǎng)6 d時其羥自由基含量的升高可能與細胞壁再生等有關。

關鍵詞：椪柑；原生質體；羥自由基；活性氧

中圖分類號： S666.104+.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0196-03

原生質體指采用機械法或酶解法去除細胞壁的裸露細胞，是研究植物生命理論基礎問題的理想體系，還可對其進行各種細胞及遺傳操作。因此，原生質體技術已廣泛地用于植物體細胞雜交、遺傳轉化、種質資源保存、基因瞬時表達等方面。在柑橘植物上，原生質體培養(yǎng)及體細胞雜交技術為其遺傳育種工作開辟了一條新思路，它已成為柑橘砧木及接穗品種改良的重要手段[1-2]。目前，柑橘原生質體主要從愈傷組織和葉片分離得來，但只有愈傷組織分離的原生質體可再生成植株，而葉肉原生質體目前尚不可分裂再生，還不能用于柑橘遺傳改良[3-4]。迄今，這2種類型原生質體再生能力差異的機制尚不清楚。

雖然原生質體再生能力差異普遍存在于植物、基因型、外植體之間，但是這種現象的相關研究進展緩慢。直至20世紀90年代，有學者發(fā)現活性氧在原生質體分離中大量產生[5-7]，然而在原生質體培養(yǎng)階段，不同再生能力的原生質體活性氧含量雖然都表現出下降的趨勢，但是不可再生型原生質體活性氧水平相對較高[8-9]。上述研究表明，氧化脅迫可能是造成不可再生型原生質體再生難的原因。為此，筆者所在課題組以氧化脅迫為切入點開展了柑橘原生質體再生能力差異的研究[10-11]，重點對總活性氧水平及活性氧另一種重要成分（羥自由基）進行檢測，以期了解活性氧在柑橘原生質體再生中的作用。

1材料與方法

1.1植物材料

椪柑（Citrus reticulata）胚性愈傷組織用懸浮培養(yǎng)基（MT+0.5 mg/L ME+1.5 mg/L谷胺酰氨+50 g/L蔗糖）懸浮培養(yǎng)4代后用于原生質體分離；取新鮮椪柑果實，挑選出大粒種子，經消毒后接種于MT培養(yǎng)基上，大約培養(yǎng)30～40 d，葉片充分展開后用于原生質體分離。

1.2椪柑原生質體分離與培養(yǎng)

原生質體的分離與純化參照Xu等的方法[10]，稍作修改。

愈傷組織原生質體的分離：取3 g愈傷組織于培養(yǎng)皿中，分別加入2 mL的0.7 mol/L EME培養(yǎng)基（MT+0.7 mol/L蔗糖+0.5 g/L ME）和酶液（2%纖維素酶R-10+2%離析酶R-10+12.8%甘露醇+0.011% NaH2PO4+0.12% MES+0.36% CaCl2·2H2O）。封口膜封口，28 ℃暗條件下酶解 18～20 h。

葉肉原生質體的分離：用手術刀片將試管苗葉片切成 1～2 mm 寬的條狀，之后放入預先加入2 mL 0.6 mol/L EME（MT+0.6 mol/L蔗糖+0.5 g/LME）培養(yǎng)基中，最后加入 2 mL 酶液（2% 纖維素酶R-10+2%離析酶R-10+10.9%甘露醇+0.011% NaH2PO4+0.12% MES+0.36% CaCl2·2H2O）。封口膜封口，28 ℃暗條件下酶解20～24 h。

酶解完成后的原生質體（酶解混合物）通過孔徑為 45 μm 的不銹鋼篩網過濾，并用CPW13洗滌、離心。然后采用CPW13/CPW26界面梯度離心，用吸管將2個液面間的原生質體帶吸出。最后將原生質體懸浮于液體培養(yǎng)基MA（MT+0.15 mol/L蔗糖+0.45 mol/L甘露醇+40 mg/L腺嘌呤）中，封口轉入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3椪柑原生質體培養(yǎng)過程中羥自由基含量變化的測定

分別采用羥自由基測定試劑盒和電子順磁共振（EPR）儀方法測定。

羥自由基測定試劑盒測定方法：參照南京建成生物科技有限公司的羥自由基測定試劑盒說明書進行。試驗重復3次，數據采用軟件SPSS 17.0進行分析。

電子順磁共振儀測定方法：首先收集原生質體懸液，離心棄上清，用CPW13清洗2次，再用CPW13重懸原生質體，最后將90 μL原生質體懸液與30 μL濃度為200 mmol/L的二甲基吡啶N-氧化物（DMPO）溶液充分混勻后，采用電子順磁共振儀（Brucker ESP300）記錄捕獲羥自由基的電子順磁共振信號。

1.4椪柑原生質體培養(yǎng)過程中活性氧含量的測定

采用碧云天生物技術有限公司的活性氧檢測試劑盒進行測定。具體步驟如下：首先將原生質體懸浮于10 μmol/L的二氯熒光素雙醋酸鹽（DCFH-DA）溶液中，37 ℃水浴鍋內孵育20 min，每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和原生質體充分接觸。之后，用原生質體培養(yǎng)液MA將處理完的原生質體洗滌3次，以充分除去未進入原生質體內的DCFH-DA。最后設置1個對照管，按照1 ∶1 000的體積比加入陽性對照Rosup，并設置1個未加DCFH-DA的陰性對照。做好前處理后，30 min內上樣，用FACSAria流式細胞儀進行檢測。試驗重復3次，數據采用SPSS 17.0進行分析。

2結果與分析

2.1椪柑原生質體培養(yǎng)與取材

為便于采集原生質體用于試驗分析，本研究采用液體培養(yǎng)方法，并進行持續(xù)觀察。剛分離的椪柑愈傷組織原生質體與葉肉原生質體細胞膜完整（圖1-A、圖1-D），活力較高，而在培養(yǎng)6 d的過程中表現出明顯差異。絕大多數愈傷組織原生質體的細胞膜保持完整，且在培養(yǎng)6 d時多數原生質體變橢圓（圖1-E、圖1-F），表明已完成了細胞壁再生。葉肉原生質體在培養(yǎng)3 d時就大量破裂死亡，培養(yǎng)6 d幾乎全部破裂（圖1-B、圖1-C）。因此，本研究以剛分離（0 d）、培養(yǎng)3、6 d的原生質體為試驗材料，進行羥自由基和總活性氧水平的檢測。

2.2椪柑原生質體羥自由基含量的測定

本研究中，采用間接法（羥自由基測定試劑盒）和直接法（電子順磁共振測定法）分析了椪柑原生質體羥自由基含量的變化。

2.2.1羥自由基測定試劑盒檢測椪柑原生質體培養(yǎng)過程中產羥自由基能力變化從剛分離到培養(yǎng)6 d，愈傷組織原生質體產羥自由基能力先下降后上升；而葉肉原生質體則相反，即先上升后下降（圖2）。 剛分離時的愈傷組織原生質體產羥自由基能力是葉肉原生質體的2.6倍，這種差異可能與原生質體來源不同有關。培養(yǎng)3 d時，愈傷組織原生質體體內抗氧化系統被激活[10]，產羥自由基能力受到抑制；而在培養(yǎng)6 d時，產羥自由基能力卻意外升高。對于葉肉原生質體，在培養(yǎng)3 d時出現大量破裂死亡現象（圖1-B），這與其產羥自由基能力的上升相符合，至培養(yǎng)6 d時，葉肉原生質體幾乎全部破裂，產羥自由基能力也明顯下降。

2.2.2電子順磁共振波譜儀檢測椪柑原生質體培養(yǎng)過程中羥自由基變化本研究利用自旋捕捉劑DMPO捕捉羥自由基后，經電子順磁共振儀檢測，得到羥自由基的特征譜圖，根據相對峰高可判斷信號的強弱，即羥自由基含量的高低。通過比較愈傷組織原生質體和葉肉原生質體的電子順磁共振譜圖（圖3、圖4），發(fā)現2種原生質體皆無DMPO-OH·的EPR 譜的典型譜線，可能是原生質體含有的金屬離子影響了 DMPO-OH· 的EPR譜信號，但仍可通過信號強弱判斷相對羥自由基含量的高低。對于愈傷組織原生質體，在培養(yǎng)的0、3、6 d，0 d的DMPO-OH·的信號最強，3 d時減弱，6 d時又增強（圖3）；而葉肉原生質體在3 d時DMPO-OH·的信號最強，6 d時最弱（圖4），這些研究結果與產羥自由基能力測定結果一致。可見，該方法能快速檢測原生質體或細胞中羥自由基變化。此外，對于如何消除或減少細胞內其他成分對羥自由基信號的干擾還有待進一步研究。

2.3流式細胞儀測定椪柑原生質體培養(yǎng)過程中總活性氧含量變化

由于各種活性氧能氧化熒光染料DCFH-DA成發(fā)強綠色熒光的DCF，利用流式細胞儀檢測細胞胞內的DCF熒光強度即可反映細胞的總活性氧水平。本研究中也采用該方法檢測了原生質體在培養(yǎng)6 d過程中總活性氧含量的變化。結果

表明，剛分離的愈傷組織原生質體具有較高水平的活性氧，但在培養(yǎng)3 d時顯著下降，之后略有降低。而葉肉原生質體的活性氧含量在培養(yǎng)前3 d無顯著差異，即前期保持較高的活性氧水平，之后下降（圖5）。

3討論

在正常的代謝下，高等植物細胞不可避免地產生羥自由基、超氧陰離子和過氧化氫等活性氧，逆境條件下活性氧會過多積累，易引起氧化脅迫，引發(fā)或加劇膜脂過氧化，甚至造成細胞死亡。在葡萄、油菜、煙草等幾種植物上開展的研究結果表明，活性氧的水平對原生質體再生能力會產生一定的影響[5-7]，因此本研究檢測了羥自由基和總活性氧水平的變化。椪柑愈傷組織原生質體和葉肉原生質體在培養(yǎng)的6 d過程中，其羥自由基和總活性氧含量表現出不同的變化規(guī)律。目前已知，原生質體分離是一個逆境過程，易引起活性氧的過多積累，會造成細胞的損傷或死亡[12-14]。因此，培養(yǎng)早期活性氧的控制是原生質體重新進入細胞周期的關鍵。本研究中，在培養(yǎng)的前3 d，愈傷組織原生質體的羥自由基和總活性氧水平都下降?？紤]到分離后愈傷組織原生質體的抗氧化酶（超氧化歧化酶、過氧化物酶）活力和抗氧化物質含量（還原型維生素C、還原型谷胱甘肽）都升高[10]，因此我們認為分離后抗氧化系統的激活是原生質體再生的必要條件。而對于不可分裂再生的葉肉原生質體，培養(yǎng)的前3 d，其羥自由基和總活性氧水平略有升高，這可能是造成其大量死亡的重要原因之一。在培養(yǎng)的后3 d，愈傷組織原生質體的總活性氧水平略有下降，而羥自由基含量上升，此外過氧化氫含量也是上升的[10]，我們分析愈傷組織原生質體的羥自由基升高可能與細胞壁再生及分裂有關?？梢?，活性氧在原生質體再生中具有雙面性，既會造成原生質體再生難，也會對原生質體再生起重要的調控作用。

雖然我們的研究已清楚了氧化脅迫是椪柑愈傷組織原生質體與葉肉原生質體再生能力差異的原因。但仍有一些問題有待解決。如抗氧化物質的添加是否可以促進原生質體再生？2種類型的原生質體其活性氧主要分布在哪些部位？主要相關基因是哪些？部分工作已在進行中，相信隨著研究進一步的深入，將揭示柑橘原生質體再生能力差異的機制，同時為促進利用原生質體再生體系進行柑橘及其他果樹遺傳改良和種質創(chuàng)新奠定理論與技術基礎。

參考文獻：

[1]徐小勇，劉繼紅，鄧秀新. 柑橘生物技術研究進展[J]. 中國生物工程雜志，2003，23（8）：35-38.

[2]Grosser J W，Gmitter F. Protoplast fusion for production of tetraploids and triploids：applications for scion and rootstock breeding in citrus[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2011，104（3）：343-357.

[3]Tusa N，Ferrauto G，Calderaro E. Investigations on protoplast regeneration from leaves of monoembryonic and polyembryonic Citrus species[C]. Italy：Proceedings of International Society Citriculture，1992：180-182.

[4]徐小勇，劉繼紅. 紫外線滅活的原生質體作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)柑橘原生質體的研究[J]. 江蘇農業(yè)科學，2009（6）：74-75.

[5]Papadakis A K，Roubelakis-Angelakis K A. The Generation of active oxygen species differs in tobacco and grapevine mesophyll protoplasts[J]. Plant Physiology，1999，121（1）：197-206.

[6]Papadakis A K，Siminis C I，Roubelakis-Angelakis K A. Reduced activity of antioxidant machinery is correlated with suppression of totipotency in plant protoplasts[J]. Plant Physiology，2001，126（1）：434-444.

[7]Yasuda K，Watanabe Y，Watanabe M. Generation of intracellular reactive oxygen species during the isolation of Brassica napus leaf protoplasts[J]. Plant Biotechnology，2007，24：361-366.

[8]Papadakis A K，Fontes N，Gerós H，et al. Progress in grapevine protoplast technology[M]//Roubelakis-Angelakis K . Grapevine Molecular Physiology & Biotechnology. Netherlands：Springer，2009：429-460.

[9]Tewari R K，Watanabe D，Watanabe M. Chloroplastic NADPH oxidase-like activity-mediated perpetual Hydrogen peroxide generation in the chloroplast induces apoptotic-like death of Brassica napus leaf protoplasts[J]. Planta，2012，235（1）：99-110.

[10]Xu X Y，Xie G S，He L，et al. Differences in oxidative stress，antioxidant systems，and microscopic analysis between regenerating callus-derived protoplasts and recalcitrant leaf mesophyll-derived protoplasts of Citrus reticulata Blanco[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2013，114（2）：161-169.

[11]何麗. 椪柑原生質體再生能力差異的機理與調控初探[D]. 揚州：揚州大學，2013.

[12]Butt A D，Bestwick C S. Generation of chemiluminescence during enzymatic isolation of protoplasts from leaves of Oryza sativa[J]. Journal of Plant Physiology，1997，150（6）：729-733.

[13]Papadakis A K，Roubelakis-Angelakis K A. Oxidative stress could be responsible for the recalcitrance of plant protoplasts[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2002，40（6/8）：549-559.

[14]Cutler A J，Saleem M，Wang Hong. Cereal protoplast recalcitrance[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，1991，27（3）：104-111.劉子記，申龍斌，楊衍，等. 甜椒核心種質遺傳多樣性與親緣關系分析[J]. 江蘇農業(yè)科學，2016，44（5）：199-202.