朱弘元++康健++范昕

摘要：從葡萄表皮分離獲得1株對霉菌具有明顯抑制作用的解淀粉芽孢桿菌B15，對其發(fā)酵液經(jīng)過酸沉、Sephadex LH-20層析柱，對抑菌脂肽的特性進行研究。結果發(fā)現(xiàn)，該菌株產(chǎn)脂肽對葡萄灰霉病菌有較好的抑制效果，60～100 ℃ 處理或pH 值為2～10的脂肽對灰霉病菌的抑菌活性幾乎沒有影響；脂肽有效最低抑菌濃度為0.017 mg/mL。經(jīng)高效液相色譜法（HPLC）和質譜分析發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌B15產(chǎn)脂肽主要活性成分為iturin A、fengycin。

關鍵詞：脂肽；解淀粉芽孢桿菌；分離純化；抑菌機理；鑒定

中圖分類號： TS201.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0186-04

1945年，Johnson等報道枯草芽孢桿菌產(chǎn)生抗菌物質[1]。1968年，Arima等首次發(fā)現(xiàn)枯草芽抱桿菌能夠產(chǎn)生抗菌脂肽surfactin[2]。除枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）外，解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（B. lichemformis）、環(huán)狀芽孢桿菌（B. circulan）、蠟樣芽胞桿菌（B. cereus）和短小芽孢桿菌（B. pumilus）等[3-9]都能產(chǎn)生抗菌脂肽。近年來，不斷有新的脂肽被發(fā)現(xiàn)。

脂肽應用廣泛。天然脂肽提取物可以直接用于提高原油采收率、治理環(huán)境如生物修復、生物降解、生物除污等[10-12]，這是目前全球關注的熱點；60%～80%純度的脂肽能作為微型乳劑，用于日用和食品工業(yè)如洗衣液、奶粉等[13-16]，更純的脂肽可用于保健品和藥品等[17-19]。目前，通過基因工程提高了生產(chǎn)菌種的性能，優(yōu)化培養(yǎng)條件有效提高了脂肽的產(chǎn)量，但由于脂肽分子量比較接近（iturin分子量為1 043～1 112 u，surfactin分子量為994～1 064 u，fengycin分子量為1 435～1 580 u）、結構比較復雜、脂肽分子具有聚合現(xiàn)象[20]等，脂肽的分離純化具有一定難度，有待進一步探索。細菌B15是中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院釀酒部從葡萄表皮上分離得到1株對霉菌具有明顯抑制作用的菌株，經(jīng)鑒定為產(chǎn)脂肽的解淀粉芽孢桿菌。本試驗對其產(chǎn)出的脂肽進行分離純化鑒定，對其抑菌機理進行初步研究，為解淀粉芽孢桿菌B15產(chǎn)脂肽的開發(fā)利用奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1材料和設備

1.1.1菌株解淀粉芽孢桿菌B15、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），由中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院釀酒部提供；葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea），由中國科學院植物保護所提供。

1.1.2培養(yǎng)基稱取38 g PDA培養(yǎng)基，溶解到1 000 mL水中，121 ℃滅菌15 min。Landy培養(yǎng)基配制：葡萄糖30 g、L-谷氨酸鈉14.0 g、MgSO4 0.5 g、KCl 0.5 g、KH2PO4 1.0 g、FeSO4 0.15 mg、MnSO4 5.0 mg、CuSO4 0.16 mg，溶解到1 000 mL水中，2 mol/L HCl調節(jié)pH值為7.2，115 ℃滅菌15 min。

1.1.3主要儀器和設備美國產(chǎn)Agilent 1260 Infinity型高效液相色譜儀、高效液相色譜串聯(lián)質譜儀（Water Acquity UPLC-MS/MS）；奧林巴斯熒光顯微鏡BX51；上海滬西產(chǎn)蛋白層析儀。制備型液相色譜，北京慧德易科技有限責任公司生產(chǎn)；冷凍干燥機，北京四環(huán)科學儀器廠生產(chǎn)；冷凍離心機，北京雷勃爾離心機有限公司生產(chǎn)；旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；氮吹儀，天津恒奧科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。

1.2試驗方法

1.2.1分離和純化

1.2.1.1發(fā)酵液的粗分離將B15菌種從種子培養(yǎng)基按4%接種量接種到Landy培養(yǎng)基中，30 ℃ 180 r/min培養(yǎng) 48 h，得到含抑菌組分的發(fā)酵液；將發(fā)酵液 4 ℃ 10 000 r/min離心30 min，收集上清液；用 6 mol/L HCl 調節(jié)pH值至 2.0，邊加 HCl 邊輕微攪拌；4 ℃保藏8 h或過夜；4 ℃ 10 000 r/min離心30 min，棄去上清；用少量無菌水沖洗沉淀，用NaOH調節(jié)pH值至7.0，冷凍干燥。

1.2.1.2抑菌脂肽的純化將凍干樣品以1 ∶10溶解在甲醇中，30 ℃ 120 r/min搖床振搖30 min，過0.22 μm濾膜；吸取2 mL樣品過Sephadex LH-20柱，使用甲醇作洗脫劑，流速為0.3 mL/min，吸光度為210 nm；收集洗脫峰，氮吹濃縮，備用。

1.2.2脂肽特性研究

1.2.2.1抑菌活性測定將PDA培養(yǎng)基滅菌，置于50～55 ℃ 水浴鍋中保持；吸取100 μL濃度為100萬CFU/mL的葡萄灰霉孢子加入PDA培養(yǎng)基，搖晃均勻；倒平板，待凝固時，將無菌的牛津杯放在培養(yǎng)基上輕輕擠壓，使之無縫隙；在牛津杯中加入150 μL純化脂肽，以甲醇作空白，25 ℃培養(yǎng) 7 d，測定其抑菌圈直徑。

1.2.2.2最小抑菌濃度測定將有抑菌活性的洗脫峰溶解在甲醇中，稀釋成不同濃度的溶液，以未處理樣品作為對照，測定其抑菌活性。

1.2.2.3溫度對抑菌活性的影響吸取1 mL脂肽溶液，分別于60、80、100 ℃水浴鍋中水浴30 min、60 min、2 h；另吸取脂肽溶液1 mL，121 ℃處理20 min，冷卻至室溫；以未處理樣品作為對照，分別測定其抑菌活性。

1.2.2.4pH值對抑菌活性的影響吸取1 mL脂肽溶液，分別用6 mol/L HCl、NaOH調節(jié)pH值為2～12，保持2 h，調回初始pH值6.0，以未處理脂肽溶液作為對照，測定其抑菌活性。

1.2.2.5脂肽對真菌菌絲體的影響取對數(shù)生長期葡萄灰霉孢子100萬CFU/mL，接種到高壓滅菌、蓋有22 mm×22 mm 蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h；加入終濃度為 0.3 mg/mL 的脂肽培養(yǎng)4 h，用PBS緩沖液漂洗3次；在待鏡檢菌絲中各加入1滴Calcofluor White、10%NaOH氫氧化鈉染色1 min，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3脂肽的鑒定選取有抑菌效果的洗脫峰樣品進入制備型液相色譜分析，色譜柱為Maisch，規(guī)格為 C18、250 mm×10 mm、5 μm、180 A，使用乙腈和水進行梯度洗提，收集各組分，濃縮；進行抑菌試驗，收集有抑菌效果的組分，用高效液相色譜串聯(lián)質譜儀進行鑒定。

2結果與分析

2.1抑菌脂肽的分離純化

經(jīng)酸沉淀得到的粗提液呈黃褐色。由圖1可見，粗提液經(jīng)濾膜濾菌、過Sephadex LH-20層析柱，所得層析圖中共有3個峰。經(jīng)活性檢測，peak 1具有抑制真菌活性（圖2）。

2.2抑菌脂肽的特性研究

2.2.1不同脂肽濃度的抑菌效果試驗結果表明，抗菌脂肽濃度不同，對葡萄灰霉病菌的抑菌效果有較大差異，脂肽濃度大于0.5 mg/mL時有較好的抑菌效果，抑菌圈直徑大于20 mm（圖3）；濃度小于0.5 mg/mL時，隨脂肽濃度的降低，抑菌效果下降很快，當脂肽濃度小于0.017 mg/mL時，脂肽沒有抑菌作用。因此，解淀粉芽孢桿菌B15產(chǎn)脂肽最小的抑菌濃度（MIC）是0.017 mg/mL。

2.2.2不同溫度和pH值處理的脂肽對灰霉病菌的抑菌效果由圖4、圖5可見，溫度處理的脂肽對灰霉病菌的抑制作用相差不大，幾乎沒有影響；pH 值為2～10時處理的脂肽有較好的抑菌活性，pH值大于12時，脂肽的抑菌活性有較大損失。

2.2.3抑菌脂肽對灰菌病菌菌絲體的影響由圖6可見，正常的葡萄灰霉病菌菌絲體均勻細長，而脂肽處理的葡萄灰霉病菌菌絲體膨脹，數(shù)量減少，并且頂端出現(xiàn)明顯膨大。

2.3脂肽的鑒定

由圖7、圖8、表1可見，具有抑菌活性的脂肽peak1進入制備型液相色譜共收得6個組分，其中1-1、1-2、2組分的m/z分別是1 058、1 058、1 072，對灰霉病菌和酵母具有較好的抑菌效果，推測可能是iturin A，使用高效液相色譜法[21]對1-1、1-2、2組分與Sigma公司的標品進行對比，確定1-1、1-2、2組分分別是2種結構的C15 iturin A、C16 iturin A；3、4、5組分的m/z在1 400～1 600之間，為fengycin類物質，m/z為1 449、1 464可能是C15、C16 fengycin A或C13、C14 fengycin B，m/z為1 477、1 492可能是C17、C18 fengycin A或 C15、C16 fengycin B。

表1抑菌組分的鑒定和性質

組分保留時間

（min）峰分離度抑制菌株種類可能物質1-133.2760.93葡萄灰霉、酵母C15 iturin A1-233.4991.90葡萄灰霉、酵母C15 iturin A235.4781.25葡萄灰霉、酵母C16 iturin A339.0～45.5葡萄灰霉C15、C16 fengycin A；C13、C14 fengycin B446.2841.81葡萄灰霉C15-19 fengycin A；C13-17 fengycin B547.6781.17葡萄灰霉fengycin類物質

3結論

葡萄病害是影響我國葡萄生產(chǎn)的重要問題之一，每年都造成葡萄不同程度的損失。據(jù)統(tǒng)計，我國葡萄生產(chǎn)每年因葡萄病害造成的損失在30%以上[22]。脂肽分子量較小、結構穩(wěn)定，有研究表明，脂肽具有良好的抑制細菌、真菌性能及表面活性，是一種不可多得的新型抗生素，在醫(yī)藥、食品、日用品等行業(yè)有很大的應用潛力。解淀粉芽孢桿菌是第1批通過美國食品和藥物管理局（FDA）安全認證的菌種，在國內(nèi)農(nóng)業(yè)部發(fā)行的微生物肥料生物安全技術通用準則（NY 1009—2006）也是免檢菌種。解淀粉芽孢桿菌B15產(chǎn)脂肽含有抑制真菌的組分，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，該抑菌成分能減少葡萄灰霉孢子的產(chǎn)生并造成菌絲體脹大，脂肽有效抑菌最低濃度為 0.017 mg/mL。經(jīng)液相色譜和質譜儀的鑒定發(fā)現(xiàn)，脂肽主要抑菌成分為iturin A和fengycin類物質，這2種成分均對葡萄灰霉病菌有抑制作用，iturin A還能有效抑制酵母的生長，在生物農(nóng)藥方面有廣闊的應用前景。

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