西安市兒童醫(yī)院病理科(西安 710002)　陳廣生　安　魯　李　娟　張　強(qiáng)　惠軍朋

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·臨床病理·

Axin基因?qū)θ四I母細(xì)胞瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響*

西安市兒童醫(yī)院病理科(西安 710002)陳廣生安魯李娟張強(qiáng)惠軍朋

摘要目的：研究Axin基因?qū)θ四I母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401生物學(xué)特性的影響為人腎母細(xì)胞瘤的分子病理機(jī)制及治療、預(yù)后提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。方法：采用基因工程的方法構(gòu)建含 Axin基因的真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-Axin，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染G401細(xì)胞，建立高表達(dá)的G401細(xì)胞系。用MTT實(shí)驗(yàn)、克隆形成能力實(shí)驗(yàn)、侵襲能力實(shí)驗(yàn)三種方法檢測(cè) Axin基因?qū)401細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。結(jié)果：重組載體pIRES2-EGFP-Axin經(jīng)PCR和雙酶切鑒定結(jié)果顯示：在約2500 bp大小處出現(xiàn)一條特異性條帶，轉(zhuǎn)染G401細(xì)胞后，經(jīng)Western blotting結(jié)果顯示：Axin蛋白在G401細(xì)胞中成功表達(dá)，同時(shí)，轉(zhuǎn)染了pIRES2-EGFP-Axin質(zhì)粒的G401細(xì)胞生長速度顯著減慢(P<0.05)；G401細(xì)胞的克隆形成能力和侵襲力均顯著降低(P<0.05)。結(jié)論：我們成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體PIRES2-EGRP-Axin，且通過Western blotting 檢測(cè)篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的G401細(xì)胞系，最后Axin體外實(shí)驗(yàn)對(duì)G401細(xì)胞生物學(xué)特性影響表明：Axin基因與腎母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系。

主題詞腎母細(xì)胞瘤/治療基因/治療應(yīng)用細(xì)胞分裂@ Axin@ G401

在1997年對(duì)天然突變系小鼠基因分析中發(fā)現(xiàn)了基因Axin (Axis formation inhibition)[1]。 由于Axin能夠下調(diào)β-catneni的水平而被視為一種腫瘤抑制因子[2]。 后來人們發(fā)現(xiàn)了與Axin同源的蛋白，為Conductin(又稱Axi l和Axin 2)，與Axin有著相似的生物學(xué)功能[3]。Axin與許多人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。腎母細(xì)胞瘤(Nephroblastoman)是嬰幼兒最多見的惡性實(shí)體瘤之一，具有較高的致死率，是導(dǎo)致兒童因腫瘤死亡的主要腫瘤之一 ，其發(fā)病原因目前尚不清楚，但有證據(jù)表明腎母細(xì)胞瘤的形成可能與一定的內(nèi)環(huán)境改變和基因變異有關(guān)。有關(guān)Axin在腎母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制研究，在國內(nèi)外尚未見相關(guān)研究。國外研究發(fā)現(xiàn)：在兒童腎母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)有Axin1基因的缺失或突變或雜合性消失，提示Axin基因與腎母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系[4]。本研究擬通過初步探索Axin對(duì)人腎母細(xì)胞瘤生物學(xué)特性的影響，來探討Axin在腎母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制，為腎母細(xì)胞瘤的生物治療提供依據(jù)。

材料與方法

1材料與試劑人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞株G401由西安市兒童醫(yī)院病理科提供；質(zhì)粒 pIRES2-EGFP 、真核轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000由Invitrogen公司提供； NheI、 SalI購于TaKaRa公司； PCR引物由上海生工合成；其余試劑均由西安晶彩生物科技有限公司提供。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1PCR引物設(shè)計(jì)和真核表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)GenBank公布的小鼠Axin基因的序列，設(shè)計(jì)全長引物，P1(上引): 5′-GCGGCTAGCAT GCAGAGTCCCAAAATGAAT-3′含有NheI的酶切位點(diǎn)(劃線部分)和啟始密碼；引物 P2(下引): 5′-GCAGTCGACTCAGTCCACCTTTTCCACCTT-3′含有SalI的酶切位點(diǎn)(劃線部分)及終止密碼子。以pCMV5-HA-Axin質(zhì)粒為模板，用P1和P2引物擴(kuò)增Axin基因的全長，將基因Axin純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)NheI和SalI酶切，克隆至pIRES2-EGFP質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，卡那霉素平板篩選陽性克隆，命名為pIRES2-EGFP-Axin。小量提取陽性克隆菌質(zhì)粒，以NheI與SalI酶切鑒定，測(cè)序由上海生工完成。

2.2真核載體pIRES2-EGFP-Axin轉(zhuǎn)染高表達(dá)的G401細(xì)胞并篩選穩(wěn)定的細(xì)胞系：細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%小牛血清)在37℃、5% CO2濃度條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞重新接種于6孔板(瞬時(shí))和24孔板(穩(wěn)定)中，貼壁細(xì)胞在長滿底面積80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑說明書操作。于轉(zhuǎn)染后48 h收集6孔板內(nèi)細(xì)胞，作為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表型鑒定用。于轉(zhuǎn)染后72 h按1∶10比例傳代于60 mm直徑培養(yǎng)皿中，然后加入適量(400～2000 μg/ml)G418進(jìn)行篩選，兩周后挑取單個(gè)細(xì)胞集落，擴(kuò)大培養(yǎng)，然后作為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞表型鑒定用。

2.3Western blotting鑒定：Axin蛋白在G401細(xì)胞中的表達(dá)：蛋白提取RIPA裂解液試劑盒購于西安晶彩生物科技有限公司, 采用BCA法測(cè)定樣品蛋白質(zhì)的濃度，確定相同上樣量所需體積數(shù)。SDS-PAGE及Westren blotting：采用SDS-PAGE不連續(xù)系統(tǒng)進(jìn)行電泳.電泳結(jié)束后將與凝膠電泳大小一致的6張濾紙和1張PVDF膜浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中5～10 min，凝膠置負(fù)極，PVDF膜正極，濾紙覆蓋，排除氣泡。濕轉(zhuǎn)法恒壓為80V轉(zhuǎn)印約1.5 h，轉(zhuǎn)膜結(jié)束膜用立春紅染色，標(biāo)記蛋白Marker條帶。膜于TBS中漂洗15 min，脫脂奶粉37℃封閉2 h。封閉結(jié)束后加入一抗，4℃過夜。TBST洗滌三次后加入相應(yīng)HRP標(biāo)記二抗室溫作用1 h，TBST充分洗滌后ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯色，壓片，曝光，顯影，定影后晾干保存。

2.4噻唑藍(lán)(MTT)比色法繪制細(xì)胞生長曲線：用0.25%胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染含Axin表達(dá)質(zhì)粒細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞，按每孔600個(gè)細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板，37℃、5% CO2孵箱中孵育，每天取出一96孔板加MTT溶液(5 mg/ml)20μl，37℃，孵育4 h后，棄上清，每孔加入150μl DMSO，震蕩10 min， 使結(jié)晶物充分溶解；測(cè)定490 nm 處測(cè)OD值，繪制細(xì)胞生長曲線。

2.5克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力：0.25%胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染含Axin表達(dá)質(zhì)粒細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，按每孔100個(gè)細(xì)胞接種于六孔板中。37℃、5% CO2孵箱中靜止培養(yǎng)2～3周，克隆形成后用Giemsa染色30 min ，計(jì)數(shù)直徑>1mm 的克隆細(xì)胞數(shù)目。

2.6侵襲試驗(yàn)測(cè)試G401細(xì)胞的侵襲能力：將購于BD公司的人工基質(zhì)膠Matrigel按每孔40 μl加入Transwell小室的聚碳酸酯膜(微孔濾膜孔徑為8 μm)的上室面，在4℃進(jìn)行風(fēng)干，將細(xì)胞分為3組，無血清饑餓24 h后，胰酶消化，終止消化且離心后棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗2遍，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，稀釋至密度為106/ml，取100 μl細(xì)胞液加入Transwell上室中，在下室中加入含10%血清培養(yǎng)基500 μl，24 h后，甲醇固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色15～20 min，輕輕甩去染色液，用蒸餾水洗滌各孔，將上室取出，從聚碳酸酯膜內(nèi)側(cè)面用吸水紙吸干水分，自然干燥， 測(cè)定前，將各實(shí)驗(yàn)組上室置入新的24 孔板中，每孔加0.6 ml 33%醋酸脫色，充分震蕩，每組設(shè)定5 復(fù)孔；同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(33%醋酸)；比色：每孔取脫色液150 μl 加入96 孔板中，在570 nm 處測(cè)定OD 值。

結(jié)果

1pIRES2-EGFP-Axin真核表達(dá)載體的構(gòu)建核酸電泳結(jié)果顯示： Axin基因成功克隆至載體pIRES2-EGFP中，約在2500 bp處出現(xiàn)了一條特異性條帶。重組質(zhì)粒的PCR和雙酶切鑒定如圖1所示。

2Axin蛋白在人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的表達(dá)鑒定取轉(zhuǎn)染72 h后的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞表型用Western blotting法進(jìn)行鑒定Axin蛋白的表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果顯示：正常的G401細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了空載質(zhì)粒的G401細(xì)胞中均未檢測(cè)到Axin蛋白的表達(dá)，只有轉(zhuǎn)染了pIRES2-EGFP-Axin質(zhì)粒的G401細(xì)胞中檢測(cè)到了特異性的Axin蛋白條帶(如圖2所示)。

圖1重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-Axin的PCR和雙酶切鑒定(M: DNA marker；1：重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-Axin的PCR擴(kuò)增；2：重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-Axin的NheI與SalI雙酶切)

圖2β-actin在G401中的表達(dá)和Axin在G401中的表達(dá)的Western blotting(1、2：正常的G401細(xì)胞；3、4：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的G401細(xì)胞；5、6：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES2-EGFP-Axin的G401細(xì)胞)

3MTT法繪制G401細(xì)胞的生長曲線來觀察細(xì)胞的生長增殖能力見圖3。①正常培養(yǎng)的人G401細(xì)胞；②轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP質(zhì)粒的G401細(xì)胞；③轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-Axin質(zhì)粒的G401細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Axin的表達(dá)使G401細(xì)胞的生長減慢，明顯受到抑制，與①組和②組對(duì)照細(xì)胞組之間有顯著性差異 (P<0.05)；而①組與②組之間無顯著性差異 (P>0.05)。

4克隆形成能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。對(duì)照組的細(xì)胞克隆數(shù)分別為：332 ± 9.8；331 ± 10.1，而轉(zhuǎn)染了pIRES2-EGFP-Axin質(zhì)粒的G401細(xì)胞克隆數(shù)顯著減少為215± 9.6，與對(duì)照組比較具有顯著性差異(P<0.05)。

5G401細(xì)胞侵襲試驗(yàn)見圖5。以穿過Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)來表示瘤細(xì)胞的侵襲力，本實(shí)驗(yàn)中采用測(cè)OD值的方法來間接的反應(yīng)G401細(xì)胞的侵襲力。細(xì)胞的侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)照組的細(xì)胞侵襲力分別為0.9896± 0.01；0.9798± 0.05。而轉(zhuǎn)染了pIRES2-EGFP-Axin實(shí)驗(yàn)組的侵襲力顯著降低到0.4783± 0.11(P<0.05)。

圖3　不同實(shí)驗(yàn)組下細(xì)胞的生長曲線

圖4　不同實(shí)驗(yàn)組下細(xì)胞的克隆形成能力

圖5　不同實(shí)驗(yàn)組下細(xì)胞的侵襲能力

討論

腎母細(xì)胞瘤是兒童發(fā)病率最高的惡性腫瘤[5]。有APC或PTCH(patched)基因突變的病人患病率較高[6]。最近在腎母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)有Axin1基因的缺失或突變或雜合性消失，這些突變主要位于C末端第6～10個(gè)外顯子處[7]。Axin自身二聚體的形成對(duì)抑制TCF的轉(zhuǎn)錄活性有很大影響[8]，在有APC、β-catenin 或Axin1突變的HCC或結(jié)腸癌細(xì)胞中野生型Axin1的表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在腫瘤中檢測(cè)到Axin基因的缺陷以及腺病毒轉(zhuǎn)染野生型Axin到Axin突變的癌細(xì)胞和APC突變的癌細(xì)胞，導(dǎo)致β-catenin的降解及細(xì)胞凋亡[9]，這些都進(jìn)一步說明Axin是腫瘤抑制因子。通過導(dǎo)入野生型Axin或者APC可能成為治療這些癌癥的一種手段[10]。

本實(shí)驗(yàn)初步探索Axin基因?qū)θ四I母細(xì)胞瘤G401細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。成功構(gòu)建含有Axin基因的真核表達(dá)載體，Western blotting鑒定結(jié)果顯示：Axin基因在G401細(xì)胞中成功表達(dá)。Axin基因?qū)θ四I母細(xì)胞瘤生物學(xué)影響的結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-Axin質(zhì)粒的G401細(xì)胞的增殖和生長，受到明顯抑制，細(xì)胞的生長速度顯著減慢；克隆形成能力實(shí)驗(yàn)表明：Axin蛋白在G401細(xì)胞中的表達(dá)影響其增殖能力，其克隆形成能力顯著降低；G401細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)表明：轉(zhuǎn)染含有Axin基因的質(zhì)粒的G401細(xì)胞的侵襲能力顯著低于對(duì)照組的G401細(xì)胞的侵襲能力。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Axin基因可抑制G401細(xì)胞的增殖、克隆形成能力和侵襲能力。提示：Axin可能會(huì)成為人腎母細(xì)胞瘤基因治療的有效靶點(diǎn)。

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(收稿：2015-12-01)

【中圖分類號(hào)】R737.11

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.05.049

Biological effects of Axin gene on human Wilms' tumor cells

Department of Pathology, Xi，an Children，s Hospital (Xi，an 710002)Chen GuangshengAn LuLi Juanet al

ABSTRACTObjective： Research effects of biological characteristics of Axin gene on human Wilms tumor cell G401 to molecular pathogenesis, treatment and prognosis of Wilms tumor provide basic research basis. Methods：Constructed eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP-Axin by genetic engineering methods, transfected stably G401 cell, establishing of G401 cell lines of high expression, By MTT assay, colony forming ability experiments and invasion experiment three methods detect effects of biological characteristics of Axin gene in G401 cell. Results：Recombinant vector pIRES2-EGFP-Axin by PCR and double digestion results showed that about 2500 bp appeared in a specific band, after transfected G401 cell, Western blotting results showed: Axin protein successfully expressed in G401 cell. Meanwhile MTT assay in vitro experiments showed that: transfected pIRES2-EGFP-Axin G401 cell growth slowed significantly(P<0.05), Colony formation and invasion experiment results also show: after transfected plasmid pIRES2-EGFP-Axin the G401 cell colony formation and invasion were significantly reduced(P<0.05).Conclusion：We successfully constructed the recombinant eukaryotic expression vector PIRES2-EGRP-Axin, and screened stably transfected cell lines through Western blotting analysis, the last Axin in vitro effects on the biological characteristics of G401 shows: a certain relationship between Axin gene with the occurrence and development of Wilms' tumor.

KEY WORDSNephroblastoma/therapyGene/therapeutic useCell division@Axin@G401

*陜西省自然科學(xué)基金資助(2010JM4026)