李東萍++張展++郭珊珊++羅永康

摘 要：為了研究酶解時(shí)間、pH值及酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量大小對(duì)鳙魚(yú)（Aristichthys nobilis）魚(yú)肉蛋白酶解產(chǎn)物加工特性及抗氧化性的影響，本研究采用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對(duì)鳙魚(yú)魚(yú)肉進(jìn)行酶解，對(duì)其酶解產(chǎn)物進(jìn)行加工特性和抗氧化性分析。結(jié)果表明：2 種蛋白酶酶解產(chǎn)物在pH 4條件下的溶解性和熱穩(wěn)定性均低于pH 7。其中，堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物分別在酶解4.0 h和1.0 h具有較優(yōu)的溶解性及熱穩(wěn)定性。堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物具有較優(yōu)的亞鐵離子螯合能力，而乳化性、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率及還原力則是風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物更優(yōu)。酶解產(chǎn)物的加工特性及抗氧化性受蛋白酶種類、酶解時(shí)間、pH值及酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量大小的影響。

關(guān)鍵詞：鳙魚(yú)；魚(yú)肉；酶解產(chǎn)物；加工特性；抗氧化性

鳙魚(yú)（Aristichthys nobilis）又叫花鰱、胖頭魚(yú)，是中國(guó)四大家魚(yú)之一，分布范圍較廣，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]，但由于其肉質(zhì)口感較差，土腥味嚴(yán)重，而且消費(fèi)者更喜食鳙魚(yú)頭的一系列原因，造成了鳙魚(yú)魚(yú)身銷量不佳的現(xiàn)狀。因此，對(duì)鳙魚(yú)肉進(jìn)行再加工，提高其附加值是目前亟待解決的問(wèn)題。動(dòng)植物蛋白多肽鏈內(nèi)部普遍存在著功能區(qū)，功能區(qū)中所蘊(yùn)藏的生物活性肽在母體的蛋白質(zhì)序列內(nèi)不具生物活性，但是通過(guò)蛋白酶酶解后即可發(fā)揮特定的功能[2]。因此，近年來(lái)通過(guò)制備動(dòng)植物蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)而提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和商業(yè)價(jià)值已然成為熱點(diǎn)[3-5]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于利用生物酶解技術(shù)開(kāi)發(fā)食源性生物活性肽已有大量報(bào)道[6-11]，對(duì)蛋白酶解產(chǎn)物功能的研究也有一定報(bào)道，主要包括加工特性（溶解性、熱穩(wěn)定性及乳化性等）及抗氧化性（（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率、亞鐵離子螯合能力及總還原力等）[12-16]。但對(duì)鳙魚(yú)蛋白酶解產(chǎn)物的加工特性及抗氧化性尚未進(jìn)行系統(tǒng)研究。因此，本實(shí)驗(yàn)采用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶分別酶解鳙魚(yú)魚(yú)肉，對(duì)其酶解產(chǎn)物的加工特性及抗氧化性進(jìn)行研究，以期為魚(yú)肉蛋白的開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳙魚(yú)購(gòu)于北京市小月河農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)（質(zhì)量

（1 390±200）g，體長(zhǎng)（44±1）cm）?；铙w運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后敲擊頭部致死，迅速去鱗、頭、內(nèi)臟、骨，洗凈后取肉（白肉），用高速勻漿機(jī)攪成肉糜。

堿性蛋白酶 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；風(fēng)味蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司；三硝基苯磺酸（trinitrobenzenesulfonic acid sol，TNBS）、DPPH、啡咯嗪 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為化學(xué)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UNICO-2700分光光度計(jì) 美國(guó)Unic公司；FE20梅特勒-托利多實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FD-1PF冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司；TGL-16A臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科技儀器廠；LM-125中空纖維超濾設(shè)備 北京旭邦膜設(shè)備有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白酶解產(chǎn)物的制備

鳙魚(yú)魚(yú)糜+去離子水→混合調(diào)整蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度至5 g/100 mL→95 ℃水浴10 min（滅內(nèi)源性蛋白酶）→勻漿→分別添加堿性蛋白酶（pH 8.0，55 ℃）、風(fēng)味蛋白酶（pH 7.0，50 ℃）→分別酶解0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 h→95 ℃水浴10 min（滅酶）→3 600 r/min離心20 min→取上清液

處理1：上清液直接-60 ℃冷凍干燥；處理2：上清液→5 kD超濾分離→透過(guò)液3 kD超濾分離→各區(qū)分物濃縮→-60 ℃冷凍干燥

1.3.2 酶解產(chǎn)物加工特性的測(cè)定

溶解度的測(cè)定參考李雪等[17]的方法并稍作修改，酶解溶液pH值分別調(diào)節(jié)到4和7。熱穩(wěn)定性的測(cè)定參考Fujiwara等[18]的方法并稍作修改，酶解溶液pH值分別調(diào)節(jié)到4和7。乳化性的測(cè)定參考Pearce等[19]的方法。

1.3.3 酶解產(chǎn)物抗氧化性的測(cè)定

DPPH自由基清除能力測(cè)定參考Bougatef等[20]的方法。亞鐵離子螯合力的測(cè)定參考Decker等[21]的方法。總還原力的測(cè)定參考Yildirim等[22]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白酶解產(chǎn)物的加工特性

2.1.1 鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白酶解產(chǎn)物溶解性

由圖1可知，經(jīng)堿性蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶處理的鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白酶解產(chǎn)物在pH 4和pH 7兩種條件下具有較好的溶解性，均高于60%。2 種蛋白酶解產(chǎn)物的溶解性在pH 7條件下較pH 4條件下高，即酶解產(chǎn)物在酸性條件下溶解性較小。李雪等[23]得到了相似的研究結(jié)果，經(jīng)堿性蛋白酶酶解鰈魚(yú)下腳料的酶解產(chǎn)物的溶解性在pH 7時(shí)較pH 4時(shí)高。此外，這一結(jié)果也與鱈魚(yú)、鲅魚(yú)等的研究結(jié)果類似[24]。在pH 7條件下堿性蛋白酶酶解4.0 h的酶解產(chǎn)物溶解度最高，達(dá)到71.82%。在pH 7條件下風(fēng)味蛋白酶酶解1.0 h的酶解產(chǎn)物溶解度最高，達(dá)到74.29%。

2.1.2 鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白酶解產(chǎn)物熱穩(wěn)定性

由圖2可知，經(jīng)堿性蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶處理的鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白酶解產(chǎn)物在pH 7條件下的熱穩(wěn)定性均較pH 4條件下的高。風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性在酶解1.0 h為最高，達(dá)到72.31%（pH 4）和74.00%（pH 7）。而堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性在酶解4.0 h為最高，達(dá)到72.98%（pH 4）和75.12%（pH 7）。熱穩(wěn)定性的研究結(jié)果同溶解性的結(jié)果有較好的一致性。

2.1.3 鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白酶解產(chǎn)物乳化性

蛋白質(zhì)分子的乳化性主要受其分子質(zhì)量、疏水基團(tuán)數(shù)量、彈性及分子結(jié)構(gòu)所影響。一定程度的酶解可以使蛋白質(zhì)溶解度增大，從而使魚(yú)肉蛋白的乳化性得到有效提高，但如果酶解過(guò)度，小分子肽及氨基酸的含量增加過(guò)大，反而不利于乳化性的提高[25-26]。

由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的乳化活性指數(shù)逐漸升高，酶解4.0 h時(shí)達(dá)到247.50 m2/g。風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物的乳化活性指數(shù)在前1.0 h酶解時(shí)，逐漸升高，酶解1.0 h時(shí)達(dá)到369.09 m2/g，之后稍有降低。

2.2鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化性

2.2.1 鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白酶解產(chǎn)物亞鐵離子螯合能力

由圖4a可知，經(jīng)堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解的鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白酶解產(chǎn)物均具有較強(qiáng)的亞鐵離子螯合能力。這可能是酶解過(guò)程中，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部暴露出的羧基以及在氨基酸側(cè)鏈中存在的酸性和堿性氨基酸殘基的原因[27]。在不同酶解時(shí)間條件下，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的亞鐵離子螯合力均顯著高于風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物

（P<0.05）。酶解0.5 h的堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的亞鐵離子螯合力最高，為89.59%，之后隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，而風(fēng)味蛋白酶則呈現(xiàn)波動(dòng)變化，且在整個(gè)酶解過(guò)程中不存在顯著性差異（P>0.05）。圖4b為超濾所得的不同分子質(zhì)量的酶解產(chǎn)物的亞鐵離子螯合能力的差異，分子質(zhì)量小于3 kD的酶解產(chǎn)物的亞鐵離子螯合能力顯著高于高分子質(zhì)量的酶解產(chǎn)物，且堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物亞鐵離子螯合能力較風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物高，這與

圖4a保持了較好的一致性。此外有研究表明，菜豆堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物[28]及草魚(yú)魚(yú)肉木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物[29]均具有較強(qiáng)的亞鐵離子螯合能力。

酶解產(chǎn)物亞鐵離子螯合能力的影響

2.2.2 鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率

酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率的影響

DPPH自由基清除能力，指酶解產(chǎn)物能夠抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并起到降低羥自由基、烷自由基或過(guò)氧化自由基的濃度的作用[30]。由圖5a可知，酶解0.5 h的堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率最高，為50.23%。在0.5～1.5 h，堿性蛋白酶DPPH自由基清除率逐漸降低，隨后至4.0 h，趨于平緩。而風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率則緩慢升高至2.0 h后趨于平緩，酶解3.0 h時(shí)達(dá)到最高為71.48%。不同酶解時(shí)間條件下，風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率均顯著高于堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物（P<0.05）。由圖5b可知，實(shí)驗(yàn)中3 種分子質(zhì)量酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率差異不大，但風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物顯著高于堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物（P<0.05），這與圖5a的結(jié)果相一致。有研究表明，酶解產(chǎn)物中疏水性氨基酸的含量影響酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率，疏水性氨基酸含量越高，DPPH自由基清除率越強(qiáng)[31]。因此推測(cè)，2 種酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率有所差異是由于酶解體系及酶解產(chǎn)物中疏水性氨基酸含量不同。

2.2.3 鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白酶解產(chǎn)物還原力

產(chǎn)物還原力的影響

由圖6a可知，2 種酶解產(chǎn)物均具有一定的還原力。同DPPH自由基清除率結(jié)果相似，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的還原力逐漸降低后趨于平緩；酶解0.5 h時(shí)，還原力最高。風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物的還原力顯著高于堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物（P<0.05），但同酶解時(shí)間關(guān)系不大。由圖6b可知，不同分子質(zhì)量大小的堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的還原力差異不大，而分子質(zhì)量小于3 kD的風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物具有較優(yōu)的還原力。

3 結(jié) 論

酶解時(shí)間、蛋白酶種類以及酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量大小是鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白酶解產(chǎn)物的加工特性和抗氧化性的影響因素。堿性蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物的溶解性及熱穩(wěn)定性分別在酶解4.0 h及酶解1.0 h時(shí)最優(yōu)，2 種酶解產(chǎn)物pH 7條件下的溶解性和熱穩(wěn)定性均較pH 4條件下更好。風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物的乳化性優(yōu)于堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的乳化性。

鳙魚(yú)魚(yú)肉堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物具有較優(yōu)的亞鐵離子螯合能力，而風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物具有更好的DPPH自由基清除率及還原力。分子質(zhì)量<3 kD的鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白酶解產(chǎn)物的亞鐵離子螯合能力顯著高于高分子質(zhì)量的酶解產(chǎn)物，而不同分子質(zhì)量的酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率差異不大。還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證2 種蛋白酶酶解產(chǎn)物的加工特性及抗氧化性，例如將2 種蛋白酶酶解產(chǎn)物加入魚(yú)糜中，通過(guò)測(cè)定過(guò)氧化物值、共軛二烯值等進(jìn)行驗(yàn)證。此外，不同蛋白酶的添加、蛋白酶之間的復(fù)配添加對(duì)酶解產(chǎn)物加工特性及抗氧化性的影響有待研究。

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