黃星奕，陳茂晴，張志才，王順，潘思慧

(江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江，212013)

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基于電子鼻技術(shù)監(jiān)測(cè)金耳深層發(fā)酵

黃星奕，陳茂晴，張志才，王順，潘思慧

(江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江，212013)

摘要利用電子鼻技術(shù)監(jiān)測(cè)金耳深層發(fā)酵過(guò)程尾氣變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)金耳液體發(fā)酵過(guò)程的監(jiān)測(cè)。優(yōu)選出7根對(duì)金耳發(fā)酵液揮發(fā)性組分敏感的TGS系列氣敏傳感器。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)、模糊C均值聚類分析(fuzzy c-means method，F(xiàn)CM)和K最近鄰分析(K-nearest neighbors analysis，KNN)，通過(guò)主成分分析和模糊C均值聚類分析可以準(zhǔn)確區(qū)分金耳的3個(gè)生長(zhǎng)階段。KNN模型在預(yù)測(cè)集和驗(yàn)證集中均對(duì)發(fā)酵階段取得了較為理想的識(shí)別結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電子鼻技術(shù)可以有效監(jiān)測(cè)金耳深層發(fā)酵過(guò)程狀態(tài)。

關(guān)鍵詞電子鼻；金耳；發(fā)酵監(jiān)控；尾氣

金耳是中國(guó)特有的稀有菌種，主要分布于西藏、云南等地，在我國(guó)擁有悠久的食用藥用歷史，古籍記載金耳可用于肺熱、痰多、咳嗽等癥的治療[1]。從20世紀(jì)后期開始，研究人員對(duì)金耳的培育、液體深層發(fā)酵、代謝產(chǎn)物進(jìn)行了大量的研究，深入了解了金耳多糖的化學(xué)組分與功效[2]。近年來(lái)，液體深層發(fā)酵技術(shù)在金耳多糖的提取上有了眾多成功的應(yīng)用[3]。但發(fā)酵過(guò)程異常復(fù)雜，依靠現(xiàn)有技術(shù)難以充分保障發(fā)酵過(guò)程安全。尾氣作為菌體代謝產(chǎn)物，可以全面表征微生物在發(fā)酵罐內(nèi)的生理狀態(tài)變化，選擇合適的技術(shù)手段監(jiān)測(cè)尾氣變化就具有十分重要的意義。

電子鼻是近些年發(fā)展起來(lái)的一種仿生嗅覺(jué)技術(shù)，與傳統(tǒng)的分析檢測(cè)儀器不同，其檢測(cè)結(jié)果為揮發(fā)性組分的整體信息[4]，需要對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)處理，通過(guò)各種化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行模式識(shí)別分析。近年來(lái)，研究人員將電子鼻應(yīng)用于發(fā)酵監(jiān)控領(lǐng)域，NABARUM[5]等利用電子鼻技術(shù)在線監(jiān)控黑茶發(fā)酵確定了黑茶發(fā)酵的最佳時(shí)間，江輝[6]等人采用電子鼻技術(shù)較好識(shí)別了固態(tài)發(fā)酵的不同狀態(tài)。目前國(guó)內(nèi)外利用電子鼻監(jiān)控液體發(fā)酵過(guò)程的文獻(xiàn)較為少見，因此電子鼻技術(shù)應(yīng)用于液體發(fā)酵過(guò)程監(jiān)測(cè)具有重要的理論和應(yīng)用意義。本研究利用自行搭建的電子鼻系統(tǒng)監(jiān)測(cè)金耳發(fā)酵過(guò)程尾氣的變化，嘗試探索針對(duì)金耳發(fā)酵在線監(jiān)測(cè)的新技術(shù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

菌種：金耳(Tremellaaurantialba)，由江蘇大學(xué)應(yīng)用微生物研究所提供；斜面培養(yǎng)基：PDA固體培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基：PDA液體培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖720 g,玉米粉270 g,麩皮360 g，蛋白胨72 g，KH2PO420 g，MgSO412 g，豆油70 mL。2 L雙閥鋁箔氣體采樣袋，大連德霖氣體包裝有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

電子鼻系統(tǒng)，由江蘇大學(xué)食品/農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)無(wú)損檢測(cè)技術(shù)研究中心自主研制。20 L自動(dòng)機(jī)械攪拌發(fā)酵系統(tǒng)，鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司；發(fā)酵控制參數(shù)：裝液量70%，攪拌速度90 r/min, 罐壓0.05 MPa，罐內(nèi)溫度28 ℃。

1.3樣本處理

金耳接種培養(yǎng)后，每隔24 h采集尾氣樣本10個(gè)，同時(shí)提取適當(dāng)發(fā)酵液用于分析菌體干重。整個(gè)金耳發(fā)酵階段共取尾氣樣本70個(gè)。共進(jìn)行2個(gè)批次的金耳發(fā)酵試驗(yàn)，第2批次樣本用于模型驗(yàn)證。

1.4測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1菌體干重(dry cell weight,DCW)

取出發(fā)酵液后適當(dāng)靜置，用40目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾金耳發(fā)酵液，去除發(fā)酵液中的麩皮。然后使用高速冷凍離心機(jī)9 000 r/min離心10 min,蒸餾水洗滌2次，收集沉淀物，60 ℃烘干至恒重即為菌體干重。

1.4.2電子鼻檢測(cè)

電子鼻的工作流程為：抽氣泵先將尾氣吸入傳感器陣列反應(yīng)室，然后由數(shù)據(jù)采集模塊得到傳感器陣列的響應(yīng)數(shù)據(jù)，最后通過(guò)模式識(shí)別算法得到分析結(jié)果。電子鼻系統(tǒng)檢測(cè)尾氣樣本的具體參數(shù)設(shè)置如下。

表1　電子鼻檢測(cè)參數(shù)

1.5數(shù)據(jù)處理

提取電子鼻響應(yīng)的穩(wěn)定值作為特征數(shù)據(jù)。主要分析方法：主成分分析(principal component analysis，PCA)、K鄰分類算法(K-nearest neighbors，KNN)[7]、模糊C均值聚類方法(fuzzy c-means，F(xiàn)CM)[8]。本研究數(shù)據(jù)分析在Matlab 2012a(Mathworks，USA)平臺(tái)上完成。

2結(jié)果與分析

2.1電子鼻傳感器優(yōu)選

2.1.1傳感器初選

已有科研人員分析了金耳發(fā)酵液揮發(fā)性組分[9]，其中主要包括醇類、烴類、酯類和倍半萜類芳香化合物。日本費(fèi)加羅公司生產(chǎn)的TGS系列傳感器性能較為穩(wěn)定，壽命長(zhǎng)，具有極高的靈敏性，對(duì)多種氣體組分具有一定的廣譜響應(yīng)特性。初步篩選12根TGS系列的氣敏傳感器用于金耳發(fā)酵尾氣監(jiān)控，型號(hào)分別為TGS825、TGS832、TGS831、TGS822、TGS813、TGS816、TGS880、TGS826、TGS2610、TGS2611、TGS2600、TGS2620。然而由于氣體組分十分復(fù)雜，傳感器響應(yīng)信息中包含大量冗余，因而需要進(jìn)一步優(yōu)選傳感器。

2.1.2相對(duì)變化值分析

計(jì)算12根傳感器在整個(gè)發(fā)酵階段響應(yīng)的相對(duì)變化均值，傳感器TGS831的相對(duì)變化值均值小于100，可認(rèn)為該傳感器對(duì)發(fā)酵階段尾氣不敏感，故剔除此傳感器。

2.1.3相關(guān)性分析和變異系數(shù)分析

相關(guān)性分析用來(lái)表征不同傳感器的相關(guān)程度，若兩個(gè)傳感器之間相關(guān)性分析結(jié)果較大，則說(shuō)明傳感器響應(yīng)存在重復(fù)，進(jìn)而可以選擇合適的參數(shù)比較方法去除一個(gè)傳感器消除部分冗余信息，簡(jiǎn)化氣敏傳感器陣列的構(gòu)成。變異系數(shù)(Coefficient of Variation,CV)反映了傳感器的穩(wěn)定性，變異系數(shù)值越大，說(shuō)明傳感器檢測(cè)結(jié)果的離散程度越大，其可靠性越差，予以剔除。

表2　傳感器響應(yīng)相對(duì)變化均值

通過(guò)對(duì)余下的11根傳感器進(jìn)行相關(guān)性分析，在置信度為95%的基礎(chǔ)上，傳感器TGS832、TGS822、TGS813任意兩根傳感器之間的相關(guān)性在0.95以上，TGS816、TGS880、TGS2600任意兩根傳感器之間的相關(guān)性也在0.95以上，可以認(rèn)為以上兩組傳感器分別對(duì)尾氣具有相似的敏感性。然后，分別對(duì)以上兩組相關(guān)性較強(qiáng)的傳感器進(jìn)行變異系數(shù)分析， TGS832和TGS2600的變異系數(shù)明顯低于其他傳感器，詳見表3，可以認(rèn)為這兩根傳感器相較其他幾根具有更好的穩(wěn)定性。

表3　傳感器變異系數(shù)分析

綜合以上傳感器優(yōu)選方法，選出如下7根氣敏傳感器構(gòu)成電子鼻傳感器陣列，分別為：TGS825、TGS832、TGS826、TGS2610、TGS2611、TGS2600、TGS2620。

2.2菌體干重變化分析

菌體干重常用于衡量發(fā)酵液中的生物量，該指標(biāo)和菌體生長(zhǎng)有重要關(guān)系。由圖1知，可根據(jù)菌體生長(zhǎng)情況將金耳液體發(fā)酵分為3個(gè)階段，第1天為第1階段，發(fā)酵液中菌體質(zhì)量增加并不明顯。第2～4天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體質(zhì)量呈指數(shù)增加。從第5天開始，金耳菌絲體質(zhì)量趨于穩(wěn)定，這是由于菌體的繁殖數(shù)量和死亡數(shù)量大致平衡。一般選擇穩(wěn)定期為收獲期，故而選擇在第7天下罐結(jié)束發(fā)酵。

圖1　菌體干重變化Fig.1　The change of DCW

2.3電子鼻檢測(cè)

2.3.1主成分分析

前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到94.66%，代表了大部分的電子鼻特征信息。圖2 為前3個(gè)主成分的得分圖，表現(xiàn)為樣本點(diǎn)在三維平面上的投影。第1天的尾氣樣本較為分散，因?yàn)榻臃N后的第1天金耳菌絲體未完全適應(yīng)新環(huán)境，生長(zhǎng)緩慢，尾氣中也無(wú)明顯芳香氣味。第2～4天的樣本聚類趨勢(shì)明顯，這一階段中金耳菌體生長(zhǎng)速度明顯加快，相互纏繞形成球狀菌團(tuán)，且隨著發(fā)酵進(jìn)程推進(jìn)菌團(tuán)體積逐漸增大，發(fā)酵液顏色不斷加深，尾氣中的芳香氣味也越來(lái)越濃郁。第5～7天的樣本在圖中位置較為接近，這是因?yàn)楫?dāng)發(fā)酵進(jìn)行到第5天時(shí)，金耳菌絲體生長(zhǎng)速度放緩，球狀菌團(tuán)的體積無(wú)顯著變化，尾氣中揮發(fā)性組分相對(duì)恒定，其濃郁程度已接近最高。第6、第7兩天的樣本重疊現(xiàn)象嚴(yán)重，這是因?yàn)榈搅俗詈髢商炀w生長(zhǎng)增殖趨于停滯，其代謝產(chǎn)物相對(duì)恒定。通過(guò)主成分分析，了解了金耳發(fā)酵不同發(fā)酵階段尾氣成分的變化特征，可以明顯的將金耳生長(zhǎng)分為3個(gè)階段，該結(jié)果不僅與菌體量變化趨勢(shì)相吻合，也符合人工生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)。

圖2　主成分分析Fig.2　Principal component analysis

2.3.2FCM分析

對(duì)所有的尾氣樣本進(jìn)行標(biāo)號(hào)，例如第1天的第1個(gè)樣本記為1-1，依次類推。FCM分析時(shí)，設(shè)置冪指數(shù)為3，最大迭代次數(shù)為200，目標(biāo)函數(shù)的終止容限為1×10-6。結(jié)果如表4所示，F(xiàn)CM算法共將金耳發(fā)酵分為3個(gè)階段，接種的第1天為第1階段，第2～4天為第2階段，第5～7天為第3階段。該分類結(jié)果與PCA分類結(jié)果一致。

表4　FCM分類結(jié)果

2.3.3KNN分析

在主成分分析的基礎(chǔ)上，利用KNN進(jìn)行分析。首先將尾氣樣本分為7類，同一天的樣本作為一類，隨機(jī)選擇49個(gè)樣本作為訓(xùn)練集的樣本，余下的21個(gè)為測(cè)試集的樣本。KNN模型的輸入量為主成分得分，輸出量為不同發(fā)酵階段。不同的k值和不同的主成分?jǐn)?shù)會(huì)對(duì)模型的識(shí)別結(jié)果造成較大影響，需要對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，利用模型預(yù)測(cè)結(jié)果的識(shí)別率來(lái)衡量模型的性能。當(dāng)K=5，主成分?jǐn)?shù)為7時(shí)，模型達(dá)到最優(yōu)，圖3表明此時(shí)預(yù)測(cè)集識(shí)別準(zhǔn)確率達(dá)到94.95%。如果將樣本分為3類，即對(duì)應(yīng)金耳發(fā)酵的3個(gè)階段，當(dāng)K=2，主成分?jǐn)?shù)為3時(shí)，模型最優(yōu)，該模型的識(shí)別準(zhǔn)確率達(dá)到100%，詳見圖4。

圖3　分為7類的預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3　The prediction result of seven categories

圖4　分為3類的預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4　The prediction result of three categories

第1批金耳發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行了第2批次的金耳發(fā)酵試驗(yàn)，條件與第1批次保持一致。利用基于第1批數(shù)據(jù)建立的預(yù)測(cè)模型對(duì)第2批次發(fā)酵進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。與第1批次相同，也按2種方法對(duì)發(fā)酵階段進(jìn)行分類，第1種是將發(fā)酵的每一天當(dāng)成1個(gè)階段，共分為7個(gè)階段，第2種分類方法是將金耳發(fā)酵階段分為第1天、第2～4天和第5～7天共3個(gè)階段。表5表明，當(dāng)分為3個(gè)階段時(shí)，識(shí)別準(zhǔn)確率達(dá)到80%。當(dāng)分為7個(gè)階段時(shí)，其識(shí)別準(zhǔn)確率較低為64.29%，由于發(fā)酵過(guò)程的復(fù)雜性，該識(shí)別結(jié)果亦可以接受。

表5　第2批發(fā)酵預(yù)測(cè)結(jié)果

3結(jié)論

本研究利用電子鼻監(jiān)控了金耳發(fā)酵過(guò)程尾氣變化。首先優(yōu)選出7根對(duì)金耳發(fā)酵液揮發(fā)性組分較為敏感的TGS系列傳感器。采用PCA、KNN和FCM等模式識(shí)別算法分析電子鼻數(shù)據(jù)，通過(guò)PCA和FCM可以準(zhǔn)確區(qū)分金耳菌絲體的3個(gè)生長(zhǎng)代謝階段。在預(yù)測(cè)集中，KNN對(duì)不同發(fā)酵階段達(dá)到較高的識(shí)別準(zhǔn)確率。在驗(yàn)證集中，當(dāng)發(fā)酵分為3個(gè)階段時(shí)，模型達(dá)到了80%的識(shí)別準(zhǔn)確率，當(dāng)模型分為7個(gè)階段時(shí)，識(shí)別準(zhǔn)確率略低。電子鼻技術(shù)在識(shí)別金耳深層發(fā)酵過(guò)程狀態(tài)方面取得了較為理想的結(jié)果，結(jié)果表明，該技術(shù)在發(fā)酵過(guò)程監(jiān)測(cè)方面擁有一定的應(yīng)用前景。本研究為以后研發(fā)專用于金耳發(fā)酵過(guò)程監(jiān)測(cè)的便攜式電子鼻系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。

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Monitoring ofTremellaaurantialbasubmerged fermentation using electronic nose

HUANG Xing-yi，CHEN Mao-qing，ZHANG Zhi-cai，WANG Shun，PAN Si-hui

(School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Jiangsu Zhenjiang 212013，China)

ABSTRACTElectronic nose was used for monitoring the off-gas change of Tremella aurantialba broth to monitor the fermentation. And seven TGS gas sensors for volatile components were selected. The data was analyzed by principal component analysis(PCA)，fuzzy c-means method(FCM) and K-nearest neighbors analysis(KNN). The three stages of the growth of the Tremella aurantialba fermentation could be accurately distinguished by PCA and FCM. Good recognition results had been achieved in the prediction and validation set using KNN algorithm. The experimental results showed that the electronic nose system could effectively monitor the state of the liquid fermentation process.

Key wordse-nose; Tremella aurantialba; monitoring of fermentation; off-gas

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606018

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201003008)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071549)；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目資助。

收稿日期：2015-10-28，改回日期：2016-02-19

第一作者：教授(本文通訊作者，E-mail：h_xingyi@163.com)。