李晴宇，葉曉莉，陳　玲，王彬輝，樓　江，王國偉，嚴　偉*

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姜黃素PLGA納米粒的制備及制劑學(xué)性質(zhì)分析

李晴宇1，葉曉莉1，陳玲1，王彬輝2，樓江1，王國偉3，嚴偉1*

1.杭州市第一人民醫(yī)院，杭州 310006；2.臺州市立醫(yī)院，臺州 318000；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310053

[摘要]目的制備姜黃素(Curcumin，Cur)聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)納米粒(Cur-PLGA-NPs)并對其理化性質(zhì)進行考察。方法采用改良的自乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒，通過正交設(shè)計，以粒徑、包封率和載藥量為評價指標(biāo)優(yōu)化處方工藝。結(jié)果制備Cur-PLGA-NPs的優(yōu)化條件為PLGA 100 mg，泊洛沙姆188濃度1.0%，丙酮與乙醇體積比3∶1，有機相體積15 mL。按優(yōu)化條件所制備的Cur-PLGA-NPs粒徑為(120.33±2.44)nm，多分散系數(shù)為0.10±0.02，包封率為84.50%±1.13%，載藥量為4.75%±0.22%。結(jié)論采用改良的自乳化溶劑揮發(fā)法成功制備了Cur-PLGA-NPs，為后續(xù)“納米粒-脂質(zhì)體系統(tǒng)”的研究奠定了基礎(chǔ)，有望實現(xiàn)藥物在肝臟的濃集。

[關(guān)鍵詞]姜黃素；納米粒；聚乳酸羥基乙酸共聚物；正交設(shè)計

0引言

姜黃素(Curcumin,下稱Cur)是從姜黃的根莖中提取出來的一種多酚類化合物[1]，素有“破血行氣，通經(jīng)止痛”之功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素還可通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、改變細胞受體連接和調(diào)控細胞凋亡信號來抑制肝腫瘤細胞的產(chǎn)生、增殖和轉(zhuǎn)移[2-3]，常用于肝癌等的治療。姜黃素以其價格低廉、對人體毒副作用小[4]被美國國立腫瘤研究所列為第3代抗癌化學(xué)預(yù)防藥[5]。但由于姜黃素水溶解度低，不易進入肝細胞，并且藥物在體內(nèi)代謝迅速，使腫瘤病灶區(qū)藥物濃度很快失去抗腫瘤活性，限制了其臨床發(fā)展[6]。研究表明，制備高效低毒制劑是提高姜黃素應(yīng)用價值的一種重要且方便的手段。

目前，具有“魔法子彈”之說的納米粒(Nanoparticles，NPs)已廣泛用于裝載抗腫瘤藥物，通過胞飲或吞噬作用進入細胞，繞過細胞膜上P-糖蛋白等外排泵對藥物的外排作用[7]。但由于納米粒易降解，研究表明，脂質(zhì)體包裹納米?？梢员Ｗo納米粒，提高其穩(wěn)定性，改善藥動學(xué)[8-9]。因此，本實驗以聚乳酸羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid) copolymer，PLGA]為載體材料，制備Cur-PLGA-NPs，并通過單因素和正交試驗來優(yōu)化工藝，為構(gòu)建脂質(zhì)體包裹姜黃素納米粒的載藥系統(tǒng)提供實驗基礎(chǔ)。

1儀器與試藥

LC-2010CHT高效液相色譜儀(日本島津公司)；Nano-ZS型粒徑分析儀(英國Malvern公司)；超速離心機(美國Beckman公司)；RE52CS-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。Cur原料藥(成都普思生物技術(shù)有限公司，純度>98%，批號：12041502)；Cur對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量98.8%，批號：110823-201004，含量測定用HPLC)；PLGA(山東省醫(yī)療器械研究所，Mw為20 000)；泊洛沙姆188(德國BASF公司，批號：WPWA544C)；乙腈為色譜醇；其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1姜黃素含量測定

2.1.1色譜條件色譜柱：Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鈉水溶液(60∶40，磷酸調(diào)pH值至3.0)；體積流量：1 mL/min；檢測波長：425 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL[10]。

2.1.2專屬性考察制備空白PLGA-NPs和Cur-PLGA-NPs混懸液。取Cur標(biāo)準(zhǔn)品溶液、空白PLGA-NPs和Cur-PLGA-NPs混懸液進行HPLC分析。結(jié)果見圖1。Cur色譜峰專一性良好，輔料和溶劑對其測定無干擾。

圖1　高效液相色譜圖

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立精密稱取Cur對照品適量，用甲醇定容，得到121.6 μg/mL的Cur對照品儲備液。分別用甲醇配制系列質(zhì)量濃度為5.06、10.14、20.26、30.41、40.56、50.71、60.80 μg/mL的溶液，按“2.1.1”項色譜條件測定，以峰面積(Y)對藥物濃度(X)進行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=192 788 X-3 172.6，r=0.999 9(n=7)。表明Cur在5.06～60.80 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4精密度與回收率試驗取Cur濃度分別為4.90、29.39、58.77 μg/mL的對照品溶液，于1 d內(nèi)測定6次，進行日內(nèi)精密度試驗，RSD值為0.17%。

精密稱取處方量80%、100%、120%減壓干燥至恒重的Cur標(biāo)準(zhǔn)品，分別加處方比例輔料，用甲醇定容為17.91、22.39、26.87 μg/mL的低、中、高濃度溶液，按“2.1.1”項色譜條件分析，計算回收率。結(jié)果見表1。

2.1.5重復(fù)性試驗取同批次制備的Cur-PLGA-NPs混懸液6份，制備供試品溶液，進樣測定峰面積，計算其RSD為0.21%。

表1　方法回收率(n=6)

2.2Cur-PLGA-NPs的制備取適量Cur和PLGA溶于一定比例的丙酮與乙醇混合溶劑中，構(gòu)成有機相；另取處方量的泊洛沙姆188水溶液，構(gòu)成水相。攪拌下將有機相恒速滴加到水相中。繼續(xù)攪拌10 min后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，得Cur-PLGA-NPs膠體溶液。

2.3指標(biāo)考察

2.3.1納米粒形態(tài)學(xué)考察取適量Cur-PLGA- NPs膠體溶液滴于銅網(wǎng)上，滴加2.0%磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上負染，透射電子顯微鏡觀察。

2.3.2納米粒粒徑測定用適量水稀釋Cur-PLGA-NPs混懸液，Nano-ZS型粒徑分析儀測定。

2.3.3納米粒包封率與載藥量測定取Cur-PLGA-NPs混懸液超速離心(40 000 r/min，4 ℃)30 min，取上清液1 mL置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液測定Cur含量，記作W1；取離心后沉淀物，蒸餾水洗滌3次，真空冷凍干燥后精密稱定總質(zhì)量，記作W。另取1 mL Cur-PLGA-NPs至10 mL量瓶中，加甲醇超聲定容，按同法測定NPs中Cur的總含量，記作W0，分別計算包封率和載藥量。包封率=(W0-W1)/W0，載藥量=(W0-W1)/W。

2.4單因素考察

2.4.1載體材料分子量選擇PLGA載體材料分子量為5 000、20 000、30 000 Da，按“2.2”項方法制備Cur-PLGA-NPs。結(jié)果表明，當(dāng)PLGA的分子量不斷增大時，NPs粒徑和多分散系數(shù)(Polydispersity index，PDI)都呈增加趨勢，可能是由于PLGA鏈段的長度隨著PLGA分子量增大而增長，導(dǎo)致分子鏈間的作用增強，有機相黏度變大，粒子較難擴散，故所得的粒徑較大。同時大分子量PLGA降解時間延長，小分子量PLGA會導(dǎo)致成球性越差。綜合考慮，本實驗選擇20 000 Da的PLGA作為NPs的載體材料。

2.4.2攪拌條件固定其他實驗條件不變，選擇攪拌速度分別為200、500、800 r/min，攪拌時間分別為5、10、15 min，進行考察。結(jié)果表明，攪拌過慢則體系分散性較差；過快易產(chǎn)生較多泡沫。而攪拌時間對NPs粒徑和PDI的影響均不顯著，故本試驗選擇攪拌速度為500 r/min，攪拌時間為10 min。

2.4.3Cur用量選擇投藥量分別為2、5、10 mg，結(jié)果表明，隨著藥量增大，粒徑和PDI呈增大趨勢。但當(dāng)投藥量增至10 mg時，溶液已達到飽和狀態(tài)，出現(xiàn)絮狀沉淀，靜置后分層，故本實驗選擇Cur的用量為5 mg。

2.5Cur-PLGA-NPs最佳處方工藝本實驗根據(jù)單因素考察結(jié)果，選擇PLGA用量(A)、泊洛沙姆188質(zhì)量分數(shù)(B)、丙酮與乙醇的體積比(C)、有機相體積(D)為考察因素，每個因素選取3水平，按L9(34)進行正交試驗。以納米粒粒徑、包封率和載藥量綜合加權(quán)評分值為指標(biāo)，篩選最佳處方。

3結(jié)果

3.1正交試驗以綜合加權(quán)評分法對正交結(jié)果進行綜合分析，粒徑(y1)、包封率(y2)和載藥量(y3)分別按35%、30%、35%的系數(shù)計分，綜合評分值(y)=35×(1-y1/209.5)+30×y2/86.41+35×y3/6.05。結(jié)果見表2～表4。極差分析結(jié)果可知，各因素對納米粒粒徑、包封率和載藥量綜合評分值的影響程度依次為：A>B>D>C。由表5可知，影響因素A、B、D對粒徑、包封率和載藥量影響顯著(P<0.05)，而C對三者影響不顯著。綜合極差分析和方差分析確定Cur-PLGA-NPs的最佳制備工藝為A1B1C1D2，即PLGA用量為100 mg，泊洛沙姆188質(zhì)量分數(shù)為1.0%，丙酮與乙醇體積比為3∶1，有機相體積為15 mL。

表2　正交試驗因素水平表

表3　正交試驗設(shè)計和結(jié)果

表4　方差分析

3.2最佳工藝驗證按“3.1”項下Cur-PLGA-NPs優(yōu)化的處方工藝制備3批納米粒混懸液，分別測定粒徑、多分散系數(shù)、包封率和載藥量，結(jié)果見表5。粒徑、多分散系數(shù)、包封率和載藥量分別為(120.33±2.44)nm、0.10±0.02、84.50%±1.13%、4.75%±0.22%(n=3)。納米粒呈類圓形，大小及分布均勻，粒子間未見黏連和聚集現(xiàn)象，結(jié)果見圖2。取適量NPs混懸液，蒸餾水稀釋后粒徑分析儀測定平均粒徑，結(jié)果見圖3。

表5　驗證試驗結(jié)果

圖2　Cur-PLGA-NPs透射電鏡照片(×50 000)

圖3　Cur-PLGA-NPs粒徑分布

4討論

本實驗通過改良的自乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒，采用丙酮和乙醇對藥物、聚合物和分散劑三者不同的溶解度，以溶劑自發(fā)擴散的形式來制備Cur-PLGA-NPs。制備實驗過程中，分別采用注射器、滴液漏斗和直接加入3種方式滴加有機相，結(jié)果表明，使用針頭和滴液漏斗能得到較小粒徑且分布均勻的納米粒?？赡苁怯捎谥苯蛹尤胗袡C相的方式往往較難控制滴速，使有機相在水相中分布不均勻而分層，不利于納米粒的包裹。而滴液漏斗和針頭則以恒定的速度勻速滴加至水相，充分在水相中完全分布，有利于納米粒的成型和粒徑分布，通過實驗發(fā)現(xiàn)滴液漏斗滴加制備得到的納米粒粒徑比注射器滴加更小，更均勻。故本實驗選擇滴液漏斗滴加的方式加入有機相。

正交試驗結(jié)果表明，有機相體積和泊洛沙姆188濃度對NPs的粒徑、包封率和載藥量均具有顯著影響。固定水相的體積，隨著有機相體積增加(5～15 mL)，NPs的粒徑和PDI逐漸減小。因為在PLGA用量固定的情況下，PLGA的濃度隨著有機相體積的增大而逐漸降低，黏度降低，納米粒更易分散。但是隨著有機相體積增加(15～35 mL)，NPs的粒徑和PDI則逐漸增大，可能是由于有機相的體積不能超過水相，否則會造成納米粒不易分散，甚至乳滴間團聚[11]。制備穩(wěn)定的納米粒，表面活性劑的選用也很重要。本實驗使用的表面活性劑泊洛沙姆188不僅具有空間位阻效應(yīng)，抑制納米粒聚集，增加溶液的穩(wěn)定性；還可避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬和抑制多藥耐藥相關(guān)蛋白的外排[12]。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)泊洛沙姆188在一定用量范圍內(nèi)，表面張力隨著濃度增加而降低，使有機相在水相中分散，且在NPs表面形成一層親水性膜，故NPs團聚的機會減少，粒徑減小。但隨著表面活性劑濃度進一步增大(>1.0%，w/v)，其不能起到乳化作用，還會造成外水相過于黏稠，使NPs聚集，粒徑增大，甚至出現(xiàn)嚴重的“突釋”現(xiàn)象[13]。

納米靶向治療是以納米粒為運輸載體，將藥物定向作用于靶器官，從而達到增效減毒的作用。研究表明，血管內(nèi)給藥，粒徑100～200 nm的微粒系統(tǒng)能快速被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中的巨噬細胞從血液中清除，最終達到肝枯否細胞溶酶體中。本實驗制備的納米粒粒徑為120 nm，滿足肝靶向的粒徑要求，同時也為進一步研究“納米粒-脂質(zhì)體系統(tǒng)”肝癌靶向治療的體內(nèi)行為、細胞行為和肝靶向機制奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Preparation of curcumin-loaded poly (lactic-co-glycolic acid) nanoparticles and analysis of its nature

LI Qing-yu1,YE Xiao-li1,CHEN Ling1,WANG Bin-hui2,LOU Jiang1,WANG Guo-wei3,YAN Wei1*

(1.Hangzhou First People′s Hospital,Hangzhou 310006,China;2.Taizhou Municipal Hospital,Taizhou 318000,China;3.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China)

[Abstract]ObjectiveTo prepare the curcumin poly (lactic-co-glycolic acid) copolymer (PLGA) nanoparticles (Cur-PLGA-NPs)and to investigate its nature.MethodsThe Cur-PLGA-NPs were prepared with modified solvent evaporation method and were optimized through orthogonal test according to particle size,entrapment efficiency and drug loading of Cur-PLGA-NPs.ResultsThe optimal conditions for preparation of Cur-PLGA-NPs included 100 mg PLGA,1.0% poloxamer 188 (m/V),acetone/ethanol 3∶1 (V/V) and 15 mL organic phase.The mean particle size of the resulted Cur-PLGA-NPs was (120.33±2.44) nm and the polydispersity index (PDI) was 0.10±0.02,and the average entrapment efficiency and drug-loading was 84.50%±1.13% and 4.75%±0.22%,respectively.ConclusionAn optimized nanoparticles drug delivery system is obtained by modified solvent evaporation method,which provides foundation for the further research of lipid-coated nanoparticles.

Key words：Curcumin;Nanoparticles;Poly (lactic-co-glycolic acid) copolymer;Orthogonal design

收稿日期：2015-10-10

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201606027