薛　冰，梁琳瑯，宋　威，孫連慶

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人參皂苷Rb1抑制間歇性高糖誘導(dǎo)的雪旺細(xì)胞凋亡

薛冰1，梁琳瑯1，宋威1，孫連慶2*

1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽 110016；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，西安 710061

[摘要]目的探討人參皂苷Rb1對間歇性高糖培養(yǎng)條件下雪旺細(xì)胞凋亡的影響。方法無菌剝?nèi)⌒律鶶prague-Dawley乳鼠坐骨神經(jīng)，體外制備雪旺細(xì)胞，分為對照組(培養(yǎng)液葡萄糖濃度為5.6 mmol/L，Con組)、間歇性高糖組(培養(yǎng)液葡萄糖濃度為5.6 mmol/L和50 mmol/L,每8小時交替，IHG組)、干預(yù)組(在間歇性高糖基礎(chǔ)上加入100 μmol/L人參皂苷Rb1，IHG+Rb1組)分別培養(yǎng)48 h。采用AnnexinV/PI雙染色、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，ELISA法檢測8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)水平，實(shí)時熒光定量PCR法檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)，蛋白印跡法檢測Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)。結(jié)果與對照組相比，間歇性高糖促進(jìn)了雪旺細(xì)胞凋亡(P<0.05)，增加了8-OHdG的生成(P<0.01)，IHG組細(xì)胞凋亡率和8-OHdG水平分別是Con組的7.69倍、3.24倍；間歇性高糖上調(diào)了Bax的mRNA和蛋白表達(dá)，下調(diào)了Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)。與IHG組相比，人參皂苷Rb1抑制了IHG導(dǎo)致的雪旺細(xì)胞凋亡和8-OHdG生成，IHG+Rb1組細(xì)胞凋亡率和8-OHdG水平較IHG組分別下降了54.1%和32.7%(P<0.05)；同時下調(diào)了Bax的mRNA和蛋白表達(dá)，上調(diào)了Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論間歇性高糖可促進(jìn)雪旺細(xì)胞凋亡，人參皂苷Rb1能夠減輕間歇性高糖造成的凋亡，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]人參皂苷Rb1;雪旺細(xì)胞;凋亡

0引言

糖尿病周圍神經(jīng)病變(Diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病患者最常見的慢性并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和壽命[1]。DPN的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其主要病理基礎(chǔ)是高血糖，但連接這一代謝紊亂和各種病理生理改變的確切機(jī)制尚不完全清楚。已有研究顯示，高糖狀態(tài)，尤其是間歇性高糖(Intermittent high glucose，IHG)，通過誘發(fā)線粒體產(chǎn)生過度氧化應(yīng)激、促發(fā)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，造成神經(jīng)損傷[2]。雪旺細(xì)胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)特有的功能細(xì)胞，但是目前關(guān)于雪旺細(xì)胞在間歇性高糖條件下的功能變化及機(jī)制研究并不多見。本研究通過體外培養(yǎng)雪旺細(xì)胞，觀察間歇性高糖條件下以及給予人參皂苷Rb1干預(yù)后凋亡相關(guān)指標(biāo)的變化，探討人參皂苷Rb1改善神經(jīng)細(xì)胞損傷的可能機(jī)制。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動物出生3 d的Sprague-Dawley乳鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司)，合格證號[SCXK(京)2007-0001]。

1.2主要儀器與試劑HERAcell細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)，DU640型分光光度計(美國Backman公司)，F(xiàn)ACSAsia流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)，SLAN熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(上海宏石醫(yī)療科技公司)。胎牛血清及胰蛋白酶(美國Hyclone公司)，葡萄糖、G-418、DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，人參皂苷Rb1(上海欣博盛生物科技公司)，兔抗鼠S-100多克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒和HRP標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋公司)，DNA提取試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(北京嘉美生物公司)，大鼠8-OHdG ELISA檢測試劑盒(加拿大StressMarq生物科學(xué)公司)，cDNA合成試劑盒和SYBR預(yù)混試劑盒(美國Invitrogen公司)，兔抗鼠Bcl-2、Bax、β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)。

2方法

2.1雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)、純化和鑒定脫頸處死Sprague-Dawley乳鼠，無菌分離并切取雙側(cè)坐骨神經(jīng)，仔細(xì)剝離神經(jīng)外膜，盡量去除束膜，用D-Hank′s液漂洗后，將神經(jīng)組織剪碎至0.5～1 mm2，均勻接種于T25培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，采用差速貼壁法、低濃度胰酶消化(0.05%胰蛋白酶及0.02%EDTA)加100 μg/mL G418純化并傳代培養(yǎng)。選取第3代生長良好的細(xì)胞，消化制成單細(xì)胞懸液，按1×105/孔的密度接種到預(yù)置有蓋玻片的6孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長成單層時，取出蓋玻片，進(jìn)行S-100蛋白免疫組化鑒定。

2.2實(shí)驗(yàn)分組結(jié)合本課題組的前期工作基礎(chǔ)，分別以5.6 mmol/L、50 mmol/L為正常葡萄糖、高葡萄糖濃度，以100 μmol/L人參皂苷Rb1進(jìn)行藥物干預(yù)。將生長良好的雪旺細(xì)胞按照1×106/mL密度接種于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞均勻鋪滿瓶底后，按以下條件分組繼續(xù)培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)分組如下：①對照組(Con組)：DMEM培養(yǎng)基+20%大鼠血清+5.6 mmol/L葡萄糖；②間歇性高糖組(IHG組)：DMEM培養(yǎng)基+20%大鼠血清+5.6 mmol/L或50 mmol/L葡萄糖，每8小時交替換液1次；③干預(yù)組(IHG+Rb1組)：在IHG培養(yǎng)基礎(chǔ)上加入終濃度100 μmol/L人參皂苷Rb1。

2.3雪旺細(xì)胞凋亡的檢測分組收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入400 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞。加入Annexin V/FITC和PI各5 μL后混勻，室溫下避光反應(yīng)10 min，采用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度，每組計數(shù)1×104個細(xì)胞，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。

2.4雪旺細(xì)胞8-OHdG水平的檢測分別提取細(xì)胞總DNA，采用分光光度計檢測定量，參照試劑盒操作說明檢測DNA樣本中8-OHdG水平。具體如下：用50 μL含有100 mmol/L乙酸鈉和5 mmol/L氯化鎂的反應(yīng)混合液重懸200 μg DNA樣本，加入1 μL DNase室溫下消化10 min。取含有8-OHdG的微量滴定板,每孔加入50 μL的樣本或?qū)φ掌?，隨即每孔加入50 μL一抗，37 ℃孵育1 h。棄去孔中液體,振蕩洗滌30 s×3次，每孔加入100 μL二抗，搖晃混勻，37 ℃孵育30 min。棄去孔中液體,振蕩洗滌30 s×3次，每孔加入100 μL著色劑，混勻后避光、室溫下放置15 min。最后加入100 μL終止液，室溫放置2 min。應(yīng)用酶標(biāo)儀測定光密度值(波長450 nm)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各樣本中的8-OHdG含量。

2.5雪旺細(xì)胞Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)的檢測采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，電泳鑒定并定量，按照cDNA合成試劑盒操作說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)目的基因及擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增。Bax (209 bp)：上游引物5′-GGCGAATTGGAGATGAACTG-3′，下游引物5′-GATCAGCTCGGGCACTTTAG-3′；Bcl-2 (225 bp)：上游引物5′-GCGTCAACAGGGAGATGTCA-3′，下游引物5′-GGTATGCACCCAGAGTGATG-3′；GAPDH (256 bp)：上游引物5′-TGTCTCCTGCGACTTCAACAG- 3′，下游引物5′-GAGGCCATGTAGGCCATGAG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃25 s，共40個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計算各組目的基因和GAPDH Ct值的差值(ΔCt)，以2-ΔΔCt表示目的基因與內(nèi)參基因GAPDH的相對表達(dá)量。

2.6雪旺細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的檢測提取細(xì)胞總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法定量并調(diào)整蛋白濃度。每孔加入50 μg蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，0.5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入兔抗鼠Bax、Bcl-2、β-actin抗體(1∶200稀釋)4 ℃過夜，TBST洗滌，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育90 min，ECL顯色，X線曝光顯影。Image Tool軟件測定光度值。

3結(jié)果

3.1雪旺細(xì)胞的形態(tài)及鑒定剪碎的神經(jīng)組織貼壁后第2天即可觀察到有細(xì)胞從組織塊浮出。多數(shù)細(xì)胞呈梭形生長，細(xì)胞核為卵圓形，胞體較小且飽滿，有細(xì)長突起，呈雙極或多極，純化培養(yǎng)后細(xì)胞生長良好，聚集成網(wǎng)格狀或漩渦狀。S-100抗體免疫組化染色后雪旺細(xì)胞純度達(dá)95%以上。

3.2各組雪旺細(xì)胞凋亡率的比較與Con組相比，IHG組細(xì)胞凋亡率明顯增加，是Con組的7.69倍(P<0.01)。人參皂苷Rb1減輕了間歇性高糖引起的雪旺細(xì)胞凋亡，與IHG組相比，IHG+Rb1組細(xì)胞凋亡率明顯下降，較IHG組下降了54.1%(P<0.05)，結(jié)果見圖1。

圖1　各組雪旺細(xì)胞凋亡率的比較

3.3各組雪旺細(xì)胞8-OHdG水平的比較與Con組相比，IHG組雪旺細(xì)胞的8-OHdG水平明顯增加，是Con組的3.24倍(P<0.01)。人參皂苷Rb1抑制了間歇性高糖引起的雪旺細(xì)胞8-OHdG增高，同IHG組相比，IHG+Rb1組雪旺細(xì)胞的8-OHdG水平明顯減少，較IHG組減少了32.7%(P<0.05)，結(jié)果見圖2。

3.4各組雪旺細(xì)胞Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平的比較與Con組相比，IHG組Bax mRNA表達(dá)水平明顯增高，是Con組的2.42倍(P<0.05)；Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯降低，是Con組的46.2%(P<0.05)。人參皂苷干預(yù)拮抗了間歇性高糖對Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平的影響，同IHG組相比，IHG+Rb1組Bax mRNA表達(dá)水平下降為IHG組的73.2%(P<0.05)，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平升高為IHG組的1.78倍(P<0.05)，結(jié)果見圖3。

圖2　各組雪旺細(xì)胞8-OHdG水平的比較

圖3　各組雪旺細(xì)胞Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平的比較

3.5各組雪旺細(xì)胞Bax 和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的比較與Con組相比，IHG組Bax 蛋白表達(dá)水平明顯增高，是Con組的2.81倍(P<0.05)；Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低，是Con組的36.7%(P<0.05)。人參皂苷干預(yù)逆轉(zhuǎn)了間歇性高糖對Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響，同IHG組相比，IHG+Rb1組Bax 蛋白表達(dá)水平下降為IHG組的49.1%(P<0.05)，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平升高為IHG組的2.08倍(P<0.05)，結(jié)果見圖4。

4討論

糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，可能與多種因素有關(guān)，包括：糖脂代謝紊亂、神經(jīng)缺血缺氧、多元醇通路異常、蛋白激酶C激活、非酶糖基化終產(chǎn)物形成、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏、氧化應(yīng)激、炎癥、免疫機(jī)制異常等。其中，Brownlee[3]提出的糖尿病血管并發(fā)癥統(tǒng)一機(jī)制——氧化應(yīng)激學(xué)說近年來備受關(guān)注：高糖引起組織細(xì)胞的線粒體超氧化物產(chǎn)生過多、促發(fā)氧化應(yīng)激，并激活炎癥、凋亡等其他代謝途徑，是糖尿病慢性并發(fā)癥的共同發(fā)病機(jī)制。

圖4　各組雪旺細(xì)胞Bax和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平的比較

雪旺細(xì)胞是周圍神經(jīng)特有的髓鞘形成細(xì)胞，是DPN的主要靶細(xì)胞，在維持神經(jīng)結(jié)構(gòu)、功能以及修復(fù)神經(jīng)損傷過程中起重要作用[4]。雪旺細(xì)胞內(nèi)線粒體豐富，能量代謝旺盛，因而對高糖引起的氧化應(yīng)激高度敏感。高糖可引起線粒體電子傳遞鏈超負(fù)荷、分裂形成片段，誘發(fā)ROS產(chǎn)生過量?；A(chǔ)和臨床研究表明，血糖過度波動對糖尿病血管并發(fā)癥的危害可能超過血糖絕對水平的作用，間歇性高糖比穩(wěn)定性高糖更容易激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，加劇包括DPN在內(nèi)的糖尿病慢性血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[5-6]。

氧化應(yīng)激反應(yīng)可通過堿基修飾、直接斷裂及改變核酸構(gòu)象等方式造成DNA損傷，其中最主要的致突變性損傷反應(yīng)是C-8上鳥嘌呤和胸腺嘧啶堿基的顛換突變，生成8-OHdG。8-OHdG是DNA氧化損傷主要的特異性的代謝終產(chǎn)物，只能通過DNA氧化損傷途徑形成，且可以在體內(nèi)穩(wěn)定存在，因此被公認(rèn)為內(nèi)源性及外源性因素造成DNA氧化損傷的標(biāo)志物[7]。本研究將雪旺細(xì)胞在間歇性高糖條件下體外培養(yǎng)48 h，發(fā)現(xiàn)間歇性高糖可以明顯增加8-OHdG生成，促進(jìn)了雪旺細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激。

氧化應(yīng)激增加可以直接或間接損傷雪旺細(xì)胞線粒體膜的通透性，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放，線粒體跨膜電位下降，線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素酶C、凋亡誘導(dǎo)因子等致凋亡物質(zhì)從線粒體膜間腔釋放，通過Caspase或非Caspase信號途徑引起細(xì)胞凋亡。Bcl-2蛋白可以調(diào)節(jié)線粒體膜通透性、減少促凋亡物質(zhì)釋放，抑制凋亡發(fā)生。而在凋亡信號刺激下，胞漿中的Bax蛋白可以轉(zhuǎn)移至線粒體膜并與膜上的Bcl-2形成異源二聚體，改變Bcl-2構(gòu)象并抑制其表達(dá)，從而促進(jìn)凋亡發(fā)生。本研究顯示，間歇性高糖也影響了凋亡相關(guān)信號通路的調(diào)控，上調(diào)促凋亡因子Bax的mRNA和蛋白表達(dá)，下調(diào)凋亡抑制因子Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)，雪旺細(xì)胞凋亡率明顯增加。

人參皂苷Rb1是傳統(tǒng)中藥人參的主要活性組分之一，具有抗氧化、抗凋亡、降糖、降脂等多種藥理作用。Wu等[8]發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1可以減輕糖尿病大鼠的心肌缺血/再灌注損傷，其心血管保護(hù)效應(yīng)至少部分與激活PI3K/Akt信號通路有關(guān)。Tsai等[9]發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1具有促進(jìn)受損的周圍神經(jīng)再生修復(fù)的作用。Huang等[10]研究顯示，人參皂苷Rb1可以減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷，抑制神經(jīng)元凋亡。本研究在間歇性高糖條件下給予人參皂苷Rb1(根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇100 μmol/L最佳濃度)進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)其可以抑制8-OHdG生成，降低雪旺細(xì)胞DNA氧化損傷，逆轉(zhuǎn)間歇性高糖引起的Bax mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)、Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，雪旺細(xì)胞凋亡率明顯減低。這說明人參皂苷Rb1對于間歇性高糖誘導(dǎo)的雪旺細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)效應(yīng)。

綜上所述，本研究初步顯示，間歇性高糖可以誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的DNA氧化損傷，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示合理控制血糖、避免血糖過度波動在DPN治療中的重要性。此外，對神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡相關(guān)通路的干預(yù)是糖尿病周圍神經(jīng)病變防治的重要策略，人參皂苷Rb1可通過減輕雪旺細(xì)胞的DNA氧化損傷、減少凋亡而有助于DPN的防治。

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Ginsenoside Rb1 inhibits apoptosis in Schwann cells induced by intermittent high glucose

XUE Bing1,LIANG Lin-lang1,SONG Wei1,SUN Lian-qing2*

(1.Department of Endocrinology,General Hospital of Shenyang Military Command，Shenyang 110016，China；2.Department of Traditional Chinese Medicine,the First Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University,Xi′an 710061,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of ginsenoside Rb1 on the apoptosis in Schwann cells induced by intermittent high glucose (IHG).MethodsSchwann cells were obtained and primarily cultured from the sciatic nerves of neonatal Sprague-Dawley rats.The cultured cells were treated for 48 h with 5.6 mmol/L glucose as control (Con group),or with 5.6 mmol/L and 50 mmol/L glucose alternating every 8 h to mimic IHG (IHG group),or with IHG plus 100 μmol/L ginsenoside Rb1 (IHG+Rb1 group).Apoptosis was detected by flow cytometry.Level of 8-hydroxy-2-deoxy guanosine (8-OHdG) was detected by enzyme linked immunosorbent assay.The mRNA expression of Bax and Bcl-2 was detected by quantitative real-time reverse transcription PCR.The protien expression of Bax and Bcl-2 was detected by Western blot.ResultsAs compared with Con group,the percentage of apoptotic cells and the level of 8-OHdG in IHG group were both increased (7.69 and 3.24 folds of control respectively，P<0.01).The mRNA and protein expression of Bax were up-regulated,while those of Bcl-2 were down-regulated in IHG group.Rb1 treatment inhibited the above effects induced by IHG.The percentage of apoptotic cells and the level of 8-OHdG in IHG+Rb1 group were decreased by 54.1% and 32.7 % respectively as compared with IHG group(P<0.05).The down-regulated mRNA and protein expression of Bax,and the up-regulated mRNA and protein expression of Bcl-2 were antagonized in IHG+Rb1 group as compared with IHG group.ConclusionGinsenoside Rb1 inhibits IHG-induced apoptosis in Schwann cells with certain neuroprotective effect

Key words：Ginsenoside Rb1;Schwann cell;Apoptosis

收稿日期：2016-02-10

基金項(xiàng)目：陜西省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(13-LC088);陜西省自然科學(xué)基金(2014JM4118)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201606003