鐘　機(jī)， 金　紅， 孫　鶴， 李惠芳， 陳麗嬌

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

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響應(yīng)面法優(yōu)化魷魚皮酶解工藝研究

鐘機(jī)， 金紅， 孫鶴， 李惠芳， 陳麗嬌

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

摘要：為研究木瓜蛋白酶酶解魷魚皮的最佳酶解條件，通過單因素試驗(yàn)研究了酶添加量、酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)魷魚皮水解度的影響。結(jié)果顯示，3個(gè)因素對(duì)魷魚皮水解度均有不同程度的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以水解度為響應(yīng)值，酶添加量、酶解時(shí)間和酶解溫度為自變量，采用Box-Benhnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)3因素3水平優(yōu)化試驗(yàn)，通過響應(yīng)面分析，建立了二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得木瓜蛋白酶酶解魷魚皮的最佳條件：酶添加量4 560 U/g，酶解時(shí)間3.2 h和酶解溫度50 ℃。在該條件下木瓜蛋白酶酶解魷魚皮的水解度可達(dá)15.53%，與模型預(yù)測值基本一致。研究表明，通過響應(yīng)面法獲得的數(shù)學(xué)預(yù)測模型能較好地預(yù)測木瓜蛋白酶酶解魷魚皮的效果，試驗(yàn)結(jié)果為魷魚加工副產(chǎn)物高值化利用提供了參考。

關(guān)鍵詞：魷魚皮；水解度；酶解；響應(yīng)面

魷魚(squid)是柔魚、槍烏賊的俗稱，屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)、頭足綱(Cephalopo-da)[1]。隨著遠(yuǎn)洋捕撈技術(shù)的發(fā)展，近年來魷魚產(chǎn)量取得了巨大的增長。魷魚在加工過程中會(huì)產(chǎn)生大約35%的廢棄物，包括頭、內(nèi)臟、皮、鰭、墨汁等，其中魷魚皮占了約8%～13%[2]。魷魚皮雖然作為加工廢棄物，但卻有極大的營養(yǎng)價(jià)值。據(jù)報(bào)道，魷魚皮中含有豐富的氨基酸、脂肪酸和礦物元素等，其中必需氨基酸占總氨基酸的30.97%，二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)占全部脂肪酸的50.44%[3]；魷魚皮魚油中DHA占35.93%，EPA占14.93%，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值[4]。

酶工程技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，為魷魚皮等廢棄物的綜合利用提供了新的加工途徑。目前在水解動(dòng)物蛋白研究中常用的商業(yè)蛋白酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等。相關(guān)研究成果包括：采用醋酸和胃蛋白酶相結(jié)合的方式提取秘魯魷魚皮中的膠原蛋白[5]；采用胃蛋白酶制備魷魚皮明膠[6]；采用中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對(duì)魷魚皮酶解[7]；采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步水解魷魚皮制備膠原蛋白肽[8]；魷魚皮明膠水解物對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的抑制活性及其降血壓作用[9]；選擇堿性蛋白酶作為水解用酶制備魷魚皮明膠肽[10]。可見魷魚皮蛋白酶解產(chǎn)物中具有特定的生理功能特性，具有廣闊的應(yīng)用前景。

在酶解過程中，蛋白酶的選擇對(duì)酶解液的質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用。木瓜蛋白酶因具有原料豐富、價(jià)格低廉、熱穩(wěn)定性好等特點(diǎn)而具有較高的性價(jià)比，更加適合用于規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。因此，為了研究木瓜蛋白酶酶解魷魚皮的最佳條件，本文以水解度為指標(biāo)，通過響應(yīng)面法對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，進(jìn)而獲得最佳酶解條件，為水產(chǎn)品加工企業(yè)提高資源的綜合利用率提供理論參考。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器設(shè)備

魷魚皮(近海魷魚，捕撈于福建閩東漁場)由福建坤興海洋生物有限公司提供；木瓜蛋白酶購于Solarbio公司；甲醛、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸等試劑均為分析純。

儀器設(shè)備：K9840自動(dòng)凱氏定氮儀(濟(jì)南海能儀器股份有限公司)；Anke GL-20G-Ⅱ離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；DK-S24電熱恒溫水浴鍋(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；BS 224S型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；PB-10型pH計(jì)(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；SZF-06G 粗脂肪測定儀(上海新家儀器有限公司)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1魷魚皮基本成分測定

將魷魚皮清洗去雜后剪碎(約1×1 cm)，再采用組織搗碎機(jī)處理2 min。魷魚皮中粗蛋白、粗脂肪、水分和灰分均采用常規(guī)方法測定[11]。

1.2.2魷魚皮酶解單因素試驗(yàn)

以水解度為指標(biāo)，在其他因素固定不變的前提下，分別考察酶添加量(3 000、3 500、4 000、4 500、5 000 U/g)、酶解時(shí)間(1.5、2、2.5、3、3.5 h)和酶解溫度(35、40、45、50、55 ℃)對(duì)魷魚皮水解度的影響。酶解結(jié)束后于95 ℃水浴鍋中滅酶10 min，冷卻至室溫后離心(5 000 r/min)20 min，取上清液測水解度。進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果取其平均值。

1.2.3響應(yīng)面法優(yōu)化魷魚皮酶解工藝條件

為得到木瓜蛋白酶酶解魷魚皮的最佳酶解條件，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以水解度為響應(yīng)值，以酶添加量、酶解時(shí)間和酶解溫度為自變量，采用Design-Expert 8.0軟件對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。試驗(yàn)因素水平編碼如表1所示。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.2.4水解度測定

水解度(DH)測定公式：

式中：C1—未水解時(shí)原料中的氨基態(tài)氮含量，g/100 mL；C2—酶解上清液氨基態(tài)氮含量，g/100 mL；C3—魷魚皮中總氮含量，g/100 g。氨氮含量參考文獻(xiàn)[12]的測定方法，總氮含量采用凱氏定氮法測定。

2結(jié)果與分析

2.1魷魚皮基本組成

通過對(duì)魷魚皮基本組成成分的測定可知，粗蛋白含量為13.58%±0.03%，粗脂肪含量僅為1.56%±0.11%。林燕等[13]測得阿根廷魷魚皮的粗蛋白含量為14.54%±0.02%，粗脂肪含量為2.90%±0.17%；管嬌雪等[3]測得秘魯魷魚皮的粗蛋白含量為11.52%±0.35%，粗脂肪含量為0.73%±0.03%。魷魚品種及捕撈海域的不同是造成魷魚皮基本營養(yǎng)成分差異的主要原因。從整體上可以看出，魷魚皮是一種高蛋白低脂肪的加工副產(chǎn)物，具有極廣的利用前景。

2.2單因素試驗(yàn)

2.2.1酶添加量對(duì)水解度的影響

在料液比為1∶3、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間3 h和自然pH條件下，考察酶添加量對(duì)水解度的影響，結(jié)果如圖1所示。酶添加量對(duì)水解度的影響極顯著(P<0.01)。當(dāng)酶添加量為4 500 U/g時(shí)，水解度基本達(dá)到最大值，繼續(xù)增加酶量對(duì)水解度的影響不顯著(P>0.05)。這可能是當(dāng)酶量添加到一定程度時(shí)，一方面底物已經(jīng)基本被酶解完畢，另一方面酶濃度過高會(huì)使蛋白酶產(chǎn)生相互抑制作用，從而使酶解效率下降[14-15]。相關(guān)研究表明，當(dāng)水解度達(dá)到一定程度時(shí)，并不會(huì)因?yàn)槊柑砑恿康睦^續(xù)增加而出現(xiàn)顯著變化[16]。對(duì)復(fù)合蛋白酶酶解魷魚皮條件優(yōu)化表明，在一定條件下，當(dāng)酶添加量為14 000 U/g時(shí),水解度達(dá)20.7%，雖水解度較高，但其酶用量較多，不利于成本控制[13]。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇4 500 U/g為最適酶添加量。

2.2.2酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

在料液比為1∶3，酶解溫度45 ℃，酶添加量為4 500 U/g，自然pH條件下，研究酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響，結(jié)果如圖2所示。酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響極顯著(P<0.01)，酶解至3 h時(shí)水解度達(dá)最大的13.8%。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是在酶解3 h后，蛋白酶作用已經(jīng)基本完全發(fā)揮，并且在酶解過程中產(chǎn)生的多肽也會(huì)作為底物參與酶解反應(yīng)[17-18]，進(jìn)而降低酶解效率。劉振峰等[8]在一定條件下先用0.3%堿性蛋白酶酶解4 h，接著再用0.2%木瓜蛋白酶酶解2 h，最終使得魷魚皮膠原蛋白肽水解度達(dá)24.32%。不同的蛋白酶切位點(diǎn)不同，將多種蛋白酶配合使用，能起到較好的酶解效果，但該方法酶解時(shí)間較長，分步酶解也增加了實(shí)際操作過程中的不穩(wěn)定性。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇3 h為最適酶解時(shí)間。

圖1　酶添加量對(duì)水解度的影響Fig.1　Effect of enzyme additive amount ondegree of hydrolysis

圖2　酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.2　Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis

2.2.3酶解溫度對(duì)水解度的影響

在料液比為1∶3、酶添加量為4 500 U/g、酶解時(shí)間3 h和自然pH條件下，研究酶解溫度對(duì)水解度的影響，結(jié)果如圖3所示。酶解溫度對(duì)水解度的影響極顯著(P<0.01)，呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí)水解度達(dá)14.5%，繼續(xù)升高溫度，水解度呈下降趨勢。原因可能是隨著溫度的升高，酶的活性逐漸升高，從而水解度升高；當(dāng)溫度過高時(shí)，蛋白酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使酶解效率下降[19-20]。因此，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇50 ℃為最適酶解溫度。

圖3　酶解溫度對(duì)水解度的影響Fig.3　Effect of hydrolysis temperature ondegree of hydrolysis

2.3響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。利用Design-Expert8.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到以水解度為響應(yīng)值的回歸方程：

Y=15.50+0.95A+0.84B+0.21C-0.22AB-0.53AC-0.15BC-3.35A2-1.37B2-1.38C2

經(jīng)分析，由該回歸方程得到木瓜蛋白酶酶魷魚皮的最佳酶解條件為：酶添加量4 564.37 U/g，酶解時(shí)間3.15 h，酶解溫度50.18 ℃，水解度預(yù)測值為15.687 5%。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

回歸模型方差分析結(jié)果見表3。由表3可知，該回歸模型極顯著(P< 0.000 1)；失擬項(xiàng)P=0.065 3>0.05，相關(guān)系數(shù)R2=0.993 8，說明該模型相關(guān)性較好，對(duì)實(shí)驗(yàn)的擬合度較高，表明可用該模型對(duì)水解度進(jìn)行預(yù)測和分析。

由顯著性分析可知，酶添加量和酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響極顯著，酶解溫度對(duì)水解度的影響不顯著；通過各因素間的交互作用可知，酶添加量和酶解溫度的交互作用對(duì)水解度的影響極顯著，其余交互作用不顯著；各因素的二次項(xiàng)對(duì)水解度的影響均為極顯著。再由表中F值可以看出，各因素對(duì)水解度影響的主次順序?yàn)锳>B>C，即酶添加量>酶解時(shí)間>酶解溫度。

表3　回歸模型方差分析表

注：*表示差異極顯著(P<0.01)。

2.3.2響應(yīng)面分析

圖4為各因素交互作用對(duì)水解度影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖。圖中響應(yīng)曲面越陡，說明該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著；由等高線圖可知兩因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響程度[21]。對(duì)比圖4a～圖4c各曲面的陡峭程度可知，酶添加量對(duì)水解度的影響最大，其次是酶解時(shí)間，酶解溫度的影響最小。再由等高線圖可知，圖4b的等高線呈橢圓形，即酶添加量和酶解溫度的交互作用對(duì)水解度的影響顯著；圖4a和圖4c的等高線呈圓形，即交互作用對(duì)水解度的影響不顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證該模型回歸方程的可靠性，對(duì)該模型預(yù)測得到的最佳酶解條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)?？紤]實(shí)際可操作性，對(duì)最優(yōu)酶解條件進(jìn)行略微調(diào)整：酶添加量4 560 U/g，酶解時(shí)間3.2 h，酶解溫度50 ℃，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果取其平均值，最終測得水解度為15.53%，與模型預(yù)測水解度誤差為1.0%，與預(yù)測值基本一致，說明該模型能較好地預(yù)測水解度。

3結(jié)論

試驗(yàn)以魷魚皮為研究對(duì)象，木瓜蛋白酶為試驗(yàn)用酶，通過單因素試驗(yàn)研究了酶添加量、酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)水解度的影響；在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken 響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜蛋白酶酶解魷魚皮的工藝參數(shù)，建立了關(guān)于水解度的預(yù)測模型。結(jié)果表明，各因素對(duì)水解度的影響依次為：酶添加量>酶解時(shí)間>酶解溫度；酶添加量和酶解溫度的交互作用對(duì)水解度有顯著影響；木瓜蛋白酶酶解魷魚皮的最佳酶解工藝為：酶添加量4 560 U/g，酶解時(shí)間3.2 h，酶解溫度50 ℃，在該條件下測得水解度為15.53%，與模型預(yù)測值基本一致。

a 酶添加量與酶解時(shí)間的交互作用

b 酶添加量與酶解溫度的交互作用

c 酶解時(shí)間與酶解溫度的交互作用圖4　各因素相互作用響應(yīng)面與等高線圖Fig.4　Response surface and contour plots showing the interactive effects of various factors on DH

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參考文獻(xiàn)

[1]宋偉華,馬永鈞,姚平.世界魷魚產(chǎn)品市場貿(mào)易簡況[J].海洋漁業(yè), 2003, 25(3)：161-162.

[2]秦玉青,劉承初,王慥.魷魚皮膠原蛋白的測定與回收[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 11(2)：138-144.

[3]管雪嬌,鄧尚貴.魷魚皮營養(yǎng)成分分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013(27)：11135-11137.

[4]馮大偉,李八方,趙雪,等.鯉魚、魷魚和鱈魚皮中脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)分析與比較[J].水利漁業(yè), 2006, 26(5)：21-23.

[5]茅宇虹,劉俊豪,楊文鴿,等.魷魚皮膠原蛋白的提取條件優(yōu)化及其特性分析[J].核農(nóng)學(xué)報(bào), 2014, 28(3)：459-466.

[6]ABDELMALEK B E, GMEZ-ESTACA J, SILA A,etal. Characteristics and functional properties of gelatin extracted from squid (Loligovulgaris) skin[J]. Teor.verojatnost.i Primenen, 2015：766-768.

[7]YANG N, WANG H, LIN Y,etal. Studies on anti-microbial activity and ACE inhibitory activity of squid skin hydrolysates[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science & Technology, 2015, 15(1)：92-98.

[8]劉振鋒,戴圣佳,呂衛(wèi)金,等.雙酶分步水解制備魷魚皮膠原蛋白肽的工藝條件優(yōu)化[J].食品科技, 2015(3)：148-153.

[9]林琳,李八方,呂順,等.魷魚皮明膠水解物降血壓活性研究[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2010, 40(4)：43-46.

[10]茅宇虹,楊文鴿,徐大倫,等.秘魯魷魚皮明膠抗氧化肽的制備及其分子質(zhì)量分布[J].中國食品學(xué)報(bào), 2014, 14(9)：48-55.

[11]張水華.食品分析[M].北京：中國輕工業(yè)出版社, 2004：87-103

[12]操龍飛.羅非魚魚排蛋白酶解和Maillard反應(yīng)生香工藝的研究[D].廈門：集美大學(xué), 2012.

[13]林燕,王鴻飛,李和生,等.酶法水解魷魚皮制備多肽工藝的研究[J].食品工業(yè)科技, 2011(3)：204-207.

[14]唐文婷.木瓜蛋白酶提取魷魚皮膠原蛋白的工藝研究[J].四川食品與發(fā)酵, 2008, 44(5)：32-34.

[15]陳銀霞.影響酶促反應(yīng)速度的外因研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2008, 15(18)：238-239.

[16]趙建明,黃艷青,高露姣,等.魷魚頭蛋白酶解工藝的研究[J].食品工業(yè)科技, 2013, 34(13)：218-222.

[18]林偉鋒.可控酶解從海洋魚蛋白中制備生物活性肽的研究[D].廣州：華南理工大學(xué), 2003.

[19]厲望,靳挺,武玉學(xué).帶魚蛋白酶解條件優(yōu)化及酶解物抗氧化性能[J].食品科學(xué), 2013, 34(9)：234-239.

[20]NILSANG S, LERTSIRI S, SUPHANTHARIKA M,etal. Optimization of enzymatic hydrolysis of fish soluble concentrate by commercial proteases[J]. Journal of Food Engineering, 2005, 70(4)：571-578.

[21]劉淑集,蔡云輝,林嬌芬,等.響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取牡蠣糖原工藝條件研究[J].漁業(yè)現(xiàn)代化, 2015, 42(6)：43-48.

Optimization of hydrolysis conditions of squid skin by response surface methodology

ZHONG Ji， JIN Hong， SUN He， LI Huifang， CHEN Lijiao

(CollegeofFoodScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,FujianFuzhou350002,China)

Abstract：To optimize the hydrolysis conditions of squid skin by papain, the effects of the papain dosage, hydrolysis time and hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis (DH) were studied by single factor experiment. The results showed that all the three factors exerted certain influences on the DH. Then the Box-Benhnken response surface methods were performed, taking the dosage of protease, contact time and hydrolysis temperature as independent variables to the DH for its optimal response value. Through the response surface analysis, a quadratic polynomial mathematical model was established to optimize the hydrolysis conditions, and the optimal hydrolysis conditions were obtained as follows：dosage of protease should be 4560 U/g, hydrolysis time 3.2 h and hydrolysis temperature 50 ℃. Under these optimal conditions, the DH could reach up to 15.53%, which was basically consist with the predicted value by the model. The research shows that, the mathematical model obtained through response surface method can rather precisely predict the hydrolysis effect of papain for squid skin, and the research results provide reference for improving the utilization rate of by-products from squid processing.

Key words：squid skin; degree of hydrolysis; hydrolysis; response surface method

DOI：10.3969/j.issn.1007-9580.2016.03.010

收稿日期：2016-03-24修回日期：2016-05-19

基金項(xiàng)目：福建省福建農(nóng)林大學(xué)高水平大學(xué)建設(shè)項(xiàng)目“海洋動(dòng)物蛋白的深加工(61201404320)”

作者簡介：鐘機(jī)(1990—)，男，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)。E-mail：zhongjilb@163.com 通信作者：陳麗嬌(1962—)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：水產(chǎn)品精深加工及綜合利用。E-mail：chenlijao@126.com

中圖分類號(hào)：TS254.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-9580(2016)03-049-06