楊　潮，葉　茂，陳　慧

(1.贛南師范學(xué)院 a.生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院;b.國(guó)家臍橙工程中心，江西 贛州　341000;2.湖南大學(xué) 生物學(xué)院，長(zhǎng)沙　410082)

?

表達(dá)人WDR70基因的質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定* 1

楊潮1a,1b，葉茂2，陳慧1a,1b

(1.贛南師范學(xué)院 a.生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院;b.國(guó)家臍橙工程中心，江西 贛州341000;2.湖南大學(xué) 生物學(xué)院，長(zhǎng)沙410082)

摘要：WD重復(fù)蛋白(WD repeat protein)家族是一類含有多個(gè)保守WD基序的蛋白.該家族蛋白廣泛存在于真核細(xì)胞中，參與細(xì)胞發(fā)育、增殖和凋亡等生理過(guò)程.WDR70隸屬于WD重復(fù)蛋白家族，其生物學(xué)功能目前仍不清楚.本文以人cDNA為模板擴(kuò)增WDR70基因；然后以pTag2b為載體，通過(guò)同源重組構(gòu)建重組質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序.同時(shí)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人肺癌細(xì)胞株A549中，進(jìn)行WDR70蛋白的表達(dá)分析.結(jié)果顯示該重組質(zhì)粒在A549細(xì)胞中能有效表達(dá).質(zhì)粒pTag2B-WDR70的成功構(gòu)建為進(jìn)一步研究WDR70相關(guān)生物學(xué)功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞：WDR70;WD重復(fù)蛋白;cDNA克隆

WD重復(fù)蛋白(WD repeat protein)家族是一類含有多個(gè)保守WD基序的蛋白.WD基序又被稱為Trp-ASP或WD40，每個(gè)WD基序由40個(gè)左右氨基酸殘基組成，具有保守的GH和WD序列，這些特殊的序列結(jié)構(gòu)可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)的相互作用[1-3].WD重復(fù)家族蛋白廣泛存在于真核細(xì)胞中，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞發(fā)育、增殖和凋亡等生理過(guò)程[4-5].目前已發(fā)現(xiàn)多種WD家族蛋白的突變能夠?qū)е氯祟惖亩喾N疾病產(chǎn)生，如癌癥的發(fā)生[6-7]、Allgrove綜合征發(fā)病[8]等.WDR70隸屬于WD重復(fù)蛋白家族，曾有研究通過(guò)原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)WDR70在8.5 d時(shí)期的小鼠胚胎中無(wú)表達(dá)，9.5 d和10.5 d時(shí)期的胚胎腦部有特異性表達(dá)，預(yù)示W(wǎng)DR70基因在胚胎時(shí)期對(duì)于腦部的發(fā)育有重要影響[9].目前，該基因的生物學(xué)功能尚不清楚.本文以人cDNA為模板擴(kuò)增WDR70基因；然后以pTag2b為載體，通過(guò)同源重組構(gòu)建重組質(zhì)粒，為開(kāi)展WDR70功能研究工作提供實(shí)驗(yàn)材料，同時(shí)為我們了解該基因在人的生理和病理過(guò)程中的功能作用奠定基礎(chǔ).

1實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

質(zhì)粒pTag2b和A549細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存.

HindIII限制性內(nèi)切酶(日本Takara)、T4 DNA連接酶(日本Takara)、KOD高保真聚合酶(日本Takara)、氨芐青霉素(北京鼎國(guó))、Escherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞(天根).QIAprep? Spin Miniprep Kit (250)試劑盒(德國(guó)Qiagen)、膠回收試劑盒(天根)、總RNA提取試劑盒(天根)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TOYOBO)、ClonExpress TM重組克隆試劑盒，(南京Vazyme).DMEM培養(yǎng)基(上海Gibco)、磷酸鹽緩沖液DPBS(美國(guó)INVIGEN)、0.25% Trypsin-EDTA胰酶細(xì)胞消化液(美國(guó)INVIGEN)、磷酸鹽緩沖液DPBS(不含鈣、鎂)(美國(guó)Hyclone).蛋白酶體抑制劑MG132(碧云天)、細(xì)胞蛋白裂解液M-PER(碧云天)、蛋白酶抑制劑HALT protease inhibitor cocktail(北京鼎國(guó))、麗春紅染色液(碧云天)、脫脂奶粉(Sigma)、NC膜(0.45 um)(碧云天)、Mini Trans-Blot Filter Paper(Bio-rad)、HRP goat-anti-mouse IgG(Santa CruZ)、HRP goat-anti-rabbit IgG(Santa CruZ)、Anti- WDR70 antibody(WB)(Abgent)、Anti-β-actin antibody(Abmart).

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1人cDNA的制備

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人源細(xì)胞293T樣本，使用Trizol提取總RNA 后依照TOYOBO公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作方法進(jìn)行相應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，獲得人源的cDNA.

1.2.2重組人WDR70基因的質(zhì)粒構(gòu)建

本文采用南京Vazyme公司的ClonExpressTM快速克隆技術(shù)，該技術(shù)是一種簡(jiǎn)單、快速并且高效的DNA定向克隆技術(shù)，可將插入片段PCR產(chǎn)物定向克隆至任意載體的任意位點(diǎn).我們針對(duì)WDR70的cDNA序列和質(zhì)粒pTag2b的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)合適的PCR引物序列并合成(見(jiàn)表1)，以人源的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠跑膠鑒定PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度.

表1　WDR70引物序列

以質(zhì)粒人cDNA為模板， 以表1中引物擴(kuò)增全長(zhǎng)人WDR70的cDNA序列， 將PCR片段經(jīng)酶切、純化后與質(zhì)粒pTag2b按照一定比例進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化和小提后進(jìn)行Hind III酶切鑒定，同時(shí)將重組后的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析(上海生工)證實(shí)其正確性.

圖1　pTag2B-WDR70質(zhì)粒圖譜

圖2　WDR70在染色體上的定位示意圖

圖3　WDR70蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖

圖4　WDR70基因PCR結(jié)果

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

A549細(xì)胞所用培養(yǎng)基為包含1%的青霉素和鏈霉素、10%胎牛血清的F-12K 細(xì)胞培養(yǎng)基，置于5% CO237 ℃條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞在培養(yǎng)皿中鋪滿率達(dá)80-90%進(jìn)行細(xì)胞傳代.當(dāng)細(xì)胞鋪滿率達(dá)70%后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，將質(zhì)粒pTag2b和人WDR70基因的重組質(zhì)粒pTag2b-WDR70分別與脂質(zhì)體孵育后，轉(zhuǎn)染進(jìn)A549細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h收集相應(yīng)的細(xì)胞樣本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.4蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

收集好的細(xì)胞樣本經(jīng)蛋白裂解液處理后獲得細(xì)胞蛋白樣本.將變性后的蛋白樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE跑膠、轉(zhuǎn)膜等步驟后，用5% 的牛奶對(duì)膜進(jìn)行封閉1 h，再使用特異性識(shí)別WDR70蛋白一抗與膜 4 ℃雜交過(guò)夜，然后用兔源二抗與膜室溫封閉1 h，最后用ECL發(fā)光液檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

2結(jié)果與分析

2.1WDR70基因PCR擴(kuò)增

人WDR70基因位于5號(hào)染色體短臂13.2區(qū)大約70 kb范圍內(nèi)(見(jiàn)圖2)，編碼區(qū)序列長(zhǎng)為1965 bp，WDR70編碼的蛋白質(zhì)含655個(gè)氨基酸，理論分子量為64×103u，含有起始密碼子ATG和終止密碼子TGA.

WDR70在真核生物中是一種非常保守的蛋白，WDR70的編碼區(qū)與小鼠同源基因的編碼區(qū)序列一致性為86%，氨基酸序列的一致性為89%.在Human Ptortein Reference Database網(wǎng)站對(duì)WDR70氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)WDR70蛋白中含有6個(gè)WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域(見(jiàn)圖3).

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合適的引物(見(jiàn)表1)，以人cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到目的基因的編碼區(qū)序列，再通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖4所示.從圖4能看出，3組PCR產(chǎn)物均在目標(biāo)位置出現(xiàn)特異性條帶，片段大小在2kb附近，與預(yù)期一致.

2.2重組質(zhì)粒pTag2b-WDR70的酶切鑒定

用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，與載體pTag2b在催化下同源重組得到pTag2b-WDR70重組載體，并轉(zhuǎn)化至DH5ɑ大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆菌落并搖菌，提取質(zhì)粒.對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行單酶切處理，然后跑膠鑒定酶切產(chǎn)物(圖5,WDR70基因條帶,空載體pTag2b，1-4號(hào)為重組載體pTag2b-WDR70).

由圖5可知pTag2B-WDR70經(jīng)過(guò)Hind III酶單酶切后，得到兩組條帶，上面的一組條帶來(lái)自pTag2B載體，下面一組為WDR70目的基因，片段大小為2.0 kb，而1號(hào)空載體作為陰性對(duì)照，其泳道內(nèi)2.0 kb處無(wú)條帶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相符.其中2、3、4、5號(hào)泳道出現(xiàn)3條條帶，可能是酶切不完全導(dǎo)致.重組質(zhì)粒pTag2B-WDR70進(jìn)行測(cè)序分析(上海生工)證實(shí)與WDR70 CDS序列一致.

2.3WDR70表達(dá)分析

圖5　WDR70重組載體的酶切鑒定

圖6　A549細(xì)胞后蛋白表達(dá)檢測(cè)

將重組載體質(zhì)粒pTag2b -WDR70與空載體質(zhì)粒pTag2b分別轉(zhuǎn)染進(jìn)A549細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞樣本.利用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)考察WDR70蛋白的表達(dá)情況(如圖6所示,蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)考察分別轉(zhuǎn)染了pTag2b空質(zhì)粒和pTag2b -WDR70質(zhì)粒的A549細(xì)胞中WDR70蛋白表達(dá)水平.)，與對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pTag2b質(zhì)粒的細(xì)胞樣本)相比轉(zhuǎn)染了pTag2b-WDR70質(zhì)粒的細(xì)胞樣本中WDR70蛋白表達(dá)量顯著升高，說(shuō)明重組載體質(zhì)粒pTag2B-WDR70在A549細(xì)胞中能有效表達(dá)WDR70蛋白，該重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.

3結(jié)論與討論

WD重復(fù)蛋白家族成員在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、mRNA前體加工、細(xì)胞骨架組裝及細(xì)胞周期調(diào)控等諸多生理過(guò)程中發(fā)揮功能[10-12].WD結(jié)構(gòu)域的共同功能是作為一個(gè)穩(wěn)定的螺旋槳狀的平臺(tái)，介導(dǎo)兩種或多種蛋白質(zhì)相互作用，使得WD重復(fù)蛋白形成的β-螺旋槳結(jié)構(gòu)能夠識(shí)別磷酸化肽[13].WDR70作為WD重復(fù)蛋白家族中的重要一員，在介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用扮演了重要的角色.關(guān)于人類癌癥等疾病的長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域的突變和缺失將導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生.WDR70基因克隆體系的成功建立，將會(huì)對(duì)該基因的深入研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).

參考文獻(xiàn)：

[1]Smith TF, Gaitatzes C, Saxena K, et al. The WD repeat: a common architecture for diverse functions[J].Trends Biochem Sci, 1999,24(5):181-185.

[2]Li D, Roberts R. WD-repeat proteins: structure characteristics, biological function, and their involvement in human diseases[J].Cell Mol Life Sci, 2001,58(14):2085-2097.

[3]Smith TF. Diversity of WD-repeat proteins[J].Subcell Biochem, 2008,48:20-30.

[4]Volk A, Crispino JD. The role of the chromatin assembly complex (CAF-1) and its p60 subunit (CHAF1b) in homeostasis and disease[J].Biochim Biophys Acta, 2015,1849(8):979-986.

[5]Grimmel M, Backhaus C, Proikas-Cezanne T. WIPI-Mediated Autophagy and Longevity[J].Cells, 2015,4(2):202-217.

[6]Mahmoudi S, Henriksson S, Farnebo L, et al. WRAP53 promotes cancer cell survival and is a potential target for cancer therapy[J].Cell Death Dis, 2011,2:e114.

[7]Sato N, Koinuma J, Fujita M, Hosokawa M, et al. Activation of WD repeat and high-mobility group box DNA binding protein 1 in pulmonary and esophageal carcinogenesis[J].Clin Cancer Res, 2010,16(1):226-239.

[8]Sandrini F, Farmakidis C, Kirschner LS, et al. Spectrum of mutations of the AAAS gene in Allgrove syndrome: lack of mutations in six kindreds with isolated resistance to corticotropin[J].J Clin Endocrinol Metab, 2001,86(11):5433-5437.

[9]單宏爽,郭麗麗,慈宏亮,等.人類新基因WDR70的克隆及初步研究[J].微生物學(xué)雜志,2005,(1):11-15.

[10]Wang L, Ye X, Liu Y, et al. Aberrant regulation of FBW7 in cancer[J].Oncotarget, 2014,5(8):2000-2015.

[11]Stopa N, Krebs JE, Shechter D. The PRMT5 arginine methyltransferase: many roles in development, cancer and beyond[J].Cell Mol Life Sci, 2015,72(11):2041-2059.

[12]Hwang J, Pallas DC. STRIPAK complexes: structure, biological function, and involvement in human diseases[J].Int J Biochem Cell Biol, 2014,47:118-148.

[13]Bakula D, Takacs Z, Proikas-Cezanne T. WIPI β-propellers in autophagy-related diseases and longevity[J].Biochem Soc Trans, 2013,41(4):962-967.

* 收稿日期：2016-03-26

DOI：10.13698/j.cnki.cn36-1037/c.2016.03.015

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81402304)；贛南師范學(xué)院招標(biāo)課題(15zb08)

作者簡(jiǎn)介：楊潮(1984-)，安徽巢湖人，贛南師范學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院講師、博士，研究方向：腫瘤病因?qū)W.

中圖分類號(hào)：R737.33

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-8332(2016)03-0058-03

Construction and Identification of Hunman WDR70-expressing Plasmid

YANG Chao1a,1b, YE Mao2, CHEN Hui1a,1b

(1a.SchoolofLifeandEnvironmentScience; 1b.NationalNoval-orangeEngineeringCenter,GannanNormalUniversity,Ganzhou341000,China; 2.SchoolofBiology,HunanUniversity,Changsha410082,China)

Abstract:WD repeat protein is a class of proteins containing several conservative WD motif. The family of WD protein extensively exists in eukaryocytes and involved in a variety of biological process, such as cell development, proliferation and apoptosis. WDR70 belongs to WD repeat protein family. At present, the function of WDR70 is not clear. In this experiment, PCR was performed on amplification of WDR70 gene. Then we constructed pCMV-Tag2B-WDR70 recombinant plasmid by homologous recombination. The recombinant plasmid was sequenced and transfected into A549 human lung cancer cells. Finally Western blot was performed to analysis the expression of WDR70 protein. The experimental results showed that WDR70 gene was successfully cloned, and pCMV-Tag2B-WDR70 recombinant plasmid was expressed efficiently in A549 cells. The construction of pCMV-Tag2B-WDR70 recombinant plasmid provides experiment materials for further reserch on WDR70-related biological functions.

Key words:WDR70; WD repeat protein; cDNA cloning

·園藝科學(xué)與生物技術(shù)·

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/36.1037.C.20160510.1226.044.html