趙麗娟,鮑　斌

(合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥　230009)

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線蟲(chóng)脂肪沉積中組織蛋白酶B的表達(dá)及功能研究

趙麗娟,鮑斌

(合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥230009)

摘要:文章利用高糖/高膽固醇飲食誘導(dǎo)了線蟲(chóng),油紅O染色結(jié)果表明線蟲(chóng)脂肪沉積顯著增加。為了研究組織蛋白酶B在誘導(dǎo)線蟲(chóng)過(guò)程中的作用,利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)研究了組織蛋白酶B同源基因的表達(dá)。選取其中的關(guān)鍵基因利用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù),研究其在線蟲(chóng)脂肪沉積中的作用。結(jié)果表明:在線蟲(chóng)脂肪沉積改變后,組織蛋白酶B同源基因表達(dá)隨之改變;而利用RNA干擾組織蛋白酶B關(guān)鍵基因cpr-3的表達(dá),線蟲(chóng)的脂肪沉積未受影響。因此,組織蛋白酶B同源基因可能參與線蟲(chóng)脂肪沉積改變后的生理變化,而未直接參與線蟲(chóng)脂肪沉積的調(diào)控。

關(guān)鍵詞:組織蛋白酶B;線蟲(chóng);脂肪沉積;基因表達(dá)

全球肥胖人群的比例正在迅速擴(kuò)大,作為代謝疾病,肥胖與多種疾病相關(guān),其中包括脂肪肝、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化甚至癌癥等,正在嚴(yán)重威脅著人類健康[1-3]。秀麗線蟲(chóng)作為一種新興的肥胖研究模型,越來(lái)越多地被運(yùn)用到肥胖相關(guān)研究中[4]。作為肥胖研究模式生物,線蟲(chóng)研究基礎(chǔ)成熟,具有生長(zhǎng)周期短、個(gè)體較小、易于觀察及遺傳操作方便等優(yōu)點(diǎn)[4]。哺乳動(dòng)物中的多數(shù)基因在線蟲(chóng)中存在同源基因,哺乳動(dòng)物中調(diào)控脂肪沉積以及相關(guān)代謝疾病的調(diào)節(jié)因子和代謝通路,在線蟲(chóng)中也得到了一定的證實(shí)[5]。由于遺傳操作簡(jiǎn)單,線蟲(chóng)中已經(jīng)構(gòu)建了眾多改變脂肪沉積的突變體,如tph-1、dhs-28、daf-2、rict-1[4,6]。突變的基因可能位于代謝通路的重要位置,如daf-2編碼在哺乳動(dòng)物中同源的胰島素受體,在胰島素通路中起重要作用[7]。

在肥胖發(fā)生過(guò)程中,脂肪沉積的增加與多個(gè)生理過(guò)程相互作用,受一系列代謝通路以及相關(guān)酶類的調(diào)節(jié),脂肪沉積機(jī)理的研究一直是肥胖相關(guān)疾病研究的核心問(wèn)題,減少脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)積累是一種重要的抵抗肥胖的手段[8]。組織蛋白酶是一類裂解肽鍵的蛋白水解酶,根據(jù)其催化中心不同可分為不同類型,包括組織蛋白酶B(cathepsin B)、組織蛋白酶D(cathepsin D)和組織蛋白酶L(cathepsin L)等[9]。研究表明,組織蛋白酶參與了肥胖及相關(guān)代謝疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程[10-13],比如降低組織蛋白酶L的表達(dá)可以有效抑制脂肪沉積的增加[9]。組織蛋白酶B是溶酶體內(nèi)半胱氨酸內(nèi)切蛋白水解酶,其作用非常廣泛,參與機(jī)體多種生理、病理過(guò)程[14-15]。當(dāng)前,對(duì)于組織蛋白酶B的研究主要是關(guān)于炎性、癌癥[14],組織蛋白酶B在脂肪沉積中的作用還不清楚。

在線蟲(chóng)中存在多個(gè)與哺乳動(dòng)物組織蛋白酶B同源的基因,包括cpr-1、cpr-2、cpr-3、cpr-4、cpr-5和cpr-6[16-19]。本文擬以秀麗線蟲(chóng)為研究對(duì)象,分析脂肪沉積改變過(guò)程中,組織蛋白酶B同源基因的表達(dá)變化及其在脂肪沉積中的可能作用。

1材料與方法

1.1材料

秀麗線蟲(chóng)購(gòu)自國(guó)際線蟲(chóng)中心CGC;油紅O購(gòu)自Sigma公司;RNAiso Plus 試劑、Oligo d(T)18、dNTP、SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑購(gòu)自TaKaRa公司；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；氯化鈉、蛋白胨、瓊脂粉、硫酸鎂、氯化鈣、葡萄糖等均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1線蟲(chóng)培養(yǎng)基的配制

線蟲(chóng)生物培養(yǎng)基(nematode growth medium,NGM)的配制如下:1 L培養(yǎng)基中NaCl 3 g,蛋蛋白胨2.5 g,瓊脂粉17 g,蒸餾水975 mL,121 ℃滅菌30 min后冷卻至50～60 ℃,加過(guò)濾滅菌的1 mol/L MgSO4、CaCl2各1 mL、5 mg/mL 膽固醇1 mL、30 mg/mL鏈霉素1 mL以及25 mL K2HPO4/KH2PO4緩沖液。

高糖培養(yǎng)基5 mmol/L,每升培養(yǎng)基加5 mL葡糖糖(1 mol/L),高膽固醇培養(yǎng)基加3倍的膽固醇。RNA干擾(RNA interference,RNAi)培養(yǎng)基在加抗生素上有區(qū)別,分別為100 mg/mL氨芐青霉素、15 mg/mL四環(huán)素、0.4 mol/L誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)各1 mL。

1.2.2線蟲(chóng)的培養(yǎng)

NGM培養(yǎng)基上加濃縮OP50菌液,37 ℃培養(yǎng)12 h,再將同步化后線蟲(chóng)接于培養(yǎng)基上20 ℃培養(yǎng),顯微鏡下觀察線蟲(chóng)的生長(zhǎng)狀況,線蟲(chóng)生長(zhǎng)至成蟲(chóng),即同步化后52 h后收取備用。

1.2.3線蟲(chóng)的 RNA干擾

溶菌肉湯(lysogeny broth,LB)液體培養(yǎng)基中加氨芐青霉素和四環(huán)素,然后接種含有L4440空載體以及含有能夠合成cpr-3 dsRNA的HT115細(xì)菌,搖床上搖動(dòng)12 h后再進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)。進(jìn)行RNAi培養(yǎng)時(shí),在RNAi NGM培養(yǎng)板上分別接種L4440菌與cpr-3干擾菌,37 ℃培養(yǎng)12 h。將同步化后線蟲(chóng)接于培養(yǎng)基上20 ℃培養(yǎng),其余步驟與普通培養(yǎng)時(shí)相同。

1.2.4油紅染色

培養(yǎng)至成蟲(chóng)的線蟲(chóng),用M9洗下收集于EP管中,用M9洗2遍,冰上孵育10 min,10%的甲醛固定,-80 ℃保存?zhèn)溆谩某蜏乇淙〕鼍€蟲(chóng)反復(fù)凍融3次,最后一次于冰上融化。M9洗2遍,再用100%的1,2-丙二醇潤(rùn)洗2 min,加入0.5%油紅染色于搖床上以200 r/min搖12 h,染色結(jié)束后吸出染液,加入85%的1,2-丙二醇。85%丙二醇于脫色搖床上搖晃5 min 3次,離心后移去,加入M9制片,于倒置顯微鏡下觀察線蟲(chóng)脂肪沉積情況并拍照。拍照完成后吸凈M9,加入200 μL無(wú)水乙醇,于脫色搖床搖晃15 min,使油紅溶出。每管吸出150 μL至96孔板中,檢測(cè)OD510[20]。

1.2.5類組織蛋白酶基因表達(dá)的檢測(cè)

收集各組處理過(guò)的線蟲(chóng),每組3 000條,用RNAiso Plus 試劑提取總RNA,取2 μg總RNA利用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,并用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)方法檢測(cè)類組織蛋白酶相關(guān)基因的mRNA表達(dá),各基因引物見(jiàn)表1所列。

以act-1作為內(nèi)參照,分別計(jì)算各組2-ΔΔCt,用以表示各基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件為退火溫度60 ℃,重復(fù)40個(gè)循環(huán)。

表1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示(重復(fù)試驗(yàn)3次,每次試驗(yàn)每組2板線蟲(chóng))。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,進(jìn)行不同組之間的t檢驗(yàn),雙側(cè)P<0.05 為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著差異。**表示0.01

2結(jié)果分析

2.1類組織蛋白酶B基因mRNA的表達(dá)

在高糖/高膽固醇飲食誘導(dǎo)下,高濃度葡萄糖和膽固醇誘導(dǎo)對(duì)線蟲(chóng)脂肪沉積影響如圖1所示。

ND—普通飲食　HGD—高葡萄糖飲食　HCD—高膽固醇飲食

由圖1可看出,隨著葡萄糖和膽固醇量的增加,線蟲(chóng)脂肪沉積顯著增加。在脂肪沉積增加后線蟲(chóng)組織蛋白酶B基因mRNA的表達(dá)量也發(fā)生了變化,如圖2所示。

基因

圖2不同飲食N2線蟲(chóng)中類組織蛋白酶B相關(guān)基因的表達(dá)

由圖1、圖2可知,在高葡萄糖/高膽固醇飲食誘導(dǎo)下線蟲(chóng)脂肪沉積發(fā)生了顯著變化,但是cpr-1、cpr-4以及cpr-6的表達(dá)量改變不明顯;cpr-2在高膽固醇誘導(dǎo)下表達(dá)量顯著升高,但在高糖誘導(dǎo)下表達(dá)沒(méi)有顯著改變;cpr-5的表達(dá)量在高糖誘導(dǎo)下顯著升高,但不受高膽固醇誘導(dǎo)的影響;cpr-3在高糖和高膽固醇的誘導(dǎo)下表達(dá)量均顯著升高。

由以上分析可知,本文利用高葡萄糖/高膽固醇飲食誘導(dǎo)脂肪沉積增加的模型,分析了組織蛋白酶B同源基因的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)只有cpr-3的表達(dá)在2種飲食誘導(dǎo)的脂肪沉積增加過(guò)程中顯著上升。

線蟲(chóng)中存在特定的突變體,其遺傳背景改變后脂肪沉積增加,tph-1、dhs-28、daf-2以及rict-1突變體較野生型N2線蟲(chóng)脂肪沉積增加。本文利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)這幾種突變體的組織蛋白酶B同源基因的表達(dá),如圖3所示。

由圖3可知,cpr-1在突變體dhs-28中表達(dá)量顯著增加,但在突變體rict-1中表達(dá)量顯著減少,在其他2個(gè)突變體中,較野生型表達(dá)量無(wú)變化;4種突變體中cpr-2的表達(dá),除在tph-1突變體中無(wú)變化,其他3個(gè)突變體中均顯著升高;與飲食誘導(dǎo)時(shí)相似,在檢測(cè)的突變體中cpr-4的表達(dá)量均無(wú)顯著變化;cpr-5的表達(dá)量雖然在突變體tph-1中顯著上升,但在突變體daf-2中顯著下降,其他2個(gè)突變體中的表達(dá)無(wú)顯著變化;cpr-6在突變體dhs-28中表達(dá)量顯著上升,突變體rict-1中表達(dá)顯著降低,其他2個(gè)突變體中的表達(dá)無(wú)顯著變化;cpr-3的表達(dá)量在4種突變體中均顯著升高。因此,只有cpr-3的表達(dá)量在所有檢測(cè)的脂肪沉積增加的突變體中,均顯著升高。

圖3　突變體線蟲(chóng)中類組織蛋白酶B相關(guān)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量

2.2RNAi對(duì)線蟲(chóng)脂肪沉積的影響

鑒于cpr-3的表達(dá)在所有脂肪沉積增加的模型中均顯著增加,本文利用RNAi技術(shù)降低了cpr-3的表達(dá),并研究其在脂肪沉積中的作用。對(duì)照組的RNAi飼喂L4440菌,即在HT115中轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒的大腸桿菌,其相對(duì)表達(dá)量結(jié)果如圖4a所示,實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果表明,在RNA干擾后，cpr-3表達(dá)量顯著下降,說(shuō)明RNA干擾成功。

在cpr-3表達(dá)量下降后,本文利用油紅O染色的方法檢測(cè)了線蟲(chóng)的脂肪沉積情況,然而RNA干擾cpr-3后,線蟲(chóng)脂肪沉積與對(duì)照比較幾乎無(wú)變化,如圖4b、圖4c所示。由圖4b、圖4c可看出,降低cpr-3表達(dá)量不能使脂肪沉積減少。因此,cpr-3表達(dá)的改變可能是線蟲(chóng)脂肪沉積改變的結(jié)果,而不是引起線蟲(chóng)脂肪沉積改變的原因。

圖4　cpr-3表達(dá)量降低對(duì)線蟲(chóng)脂肪沉積的影響

3討論

超重和肥胖是引起死亡的重要風(fēng)險(xiǎn),肥胖的本質(zhì)是脂質(zhì)在脂肪細(xì)胞中過(guò)度積累,減少脂質(zhì)積累可有效預(yù)防和治療肥胖及其相關(guān)威脅機(jī)體健康的疾病[21]。對(duì)于肥胖及其相關(guān)疾病問(wèn)題的研究,可以從個(gè)體、組織、細(xì)胞及分子等各個(gè)水平進(jìn)行研究,但歸根結(jié)底肥胖發(fā)生的分子機(jī)制研究是解決肥胖及相關(guān)疾病的根本。當(dāng)前的研究發(fā)現(xiàn),脂肪沉積過(guò)程伴隨著一系列分子水平的改變,而且這些分子也可能反過(guò)來(lái)調(diào)節(jié)脂肪沉積。研究這些分子有利于預(yù)防和治療肥胖及其相關(guān)疾病。

近年來(lái)研究表明,組織蛋白酶被認(rèn)為是在癌癥、免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病中起作用的一類關(guān)鍵酶[22],組織蛋白酶類與肥胖及其相關(guān)疾病具有密切關(guān)系[5]。本實(shí)驗(yàn)以秀麗線蟲(chóng)為研究對(duì)象,研究組織蛋白酶B與線蟲(chóng)脂肪沉積的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在高糖誘導(dǎo)線蟲(chóng)脂肪沉積增加時(shí),cpr-3、cpr-5的表達(dá)量上升;高膽固醇誘導(dǎo)線蟲(chóng)脂肪沉積增加時(shí),cpr-2、cpr-3的表達(dá)量升高;在飲食誘導(dǎo)線蟲(chóng)脂肪沉積試驗(yàn)中,其他基因的表達(dá)量與對(duì)照相比均無(wú)顯著變化。在daf-2突變體中cpr-2、cpr-3表達(dá)量升高,cpr-5表達(dá)量下降;在dhs-28突變體中cpr-1、cpr-2、cpr-3、cpr-5表達(dá)量上升;在rict-1突變體中cpr-2、cpr-3表達(dá)量升高,cpr-1、cpr-6表達(dá)量下降;在tph-1突變體中cpr-2、cpr-3表達(dá)量升高,cpr-3、cpr-5表達(dá)量下降。cpr-3表達(dá)量在飲食誘導(dǎo)以及突變體線蟲(chóng)中均有顯著的增加,可能是由于cpr-3是線蟲(chóng)中與脂肪沉積密切相關(guān)的關(guān)鍵組織蛋白酶B基因的存在。然而利用RNAi技術(shù)降低cpr-3的表達(dá)后,線蟲(chóng)脂肪沉積沒(méi)有發(fā)生改變,這說(shuō)明cpr-3表達(dá)的改變是線蟲(chóng)脂肪沉積變化的結(jié)果。

4結(jié)束語(yǔ)

本研究表明線蟲(chóng)脂肪沉積增加可以改變類組織蛋白酶B相關(guān)基因的表達(dá),特別是cpr-3的表達(dá)顯著升高,而RNAi降低cpr-3表達(dá)不能改變線蟲(chóng)的脂肪沉積。因此cpr-3表達(dá)的改變可能是線蟲(chóng)脂肪沉積改變的結(jié)果,而不是引起線蟲(chóng)脂肪沉積改變的原因。

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(責(zé)任編輯閆杏麗)

Study of expression and function of Cathepsin B in the process of fat storage in Caenorhabditis elegans

ZHAO Li-juan,BAO Bin

(School of Biotechnology and Food Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China)

Abstract:In this paper,Caenorhabditis elegans(C.elegans)were fed with high concentration glucose and cholesterol diet,and it was demonstrated that the fat storage increased dramatically by oil red O staining. In order to study the role of Cathepsin B Protease homologous genes in the fat storage process of C.elegans,their expression was investigated by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).The cpr-3 was proposed as a critical gene homologous to Cathepsin B Protease,and then the effect of selected critical genes on the fat storage in C.elegans was studied by RNAi technology. The results show that the altered expression of Cathepsin B Protease homologous genes maybe a result of the changed fat storage in C.elegans. However,there is no change of fat storage when cpr-3 is knocked down by RNAi. In consequence,homologous genes of Cathepsin B Protease do not directly regulate the fat storage,but may participate in the physiological and pathological processes after the increase of fat storage.

Key words:Cathepsin B Protease;Caenorhabditis elegans(C.elegans);fat storage;gene expression

收稿日期：2015-02-11；修回日期：2015-04-10

基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(1408085QC48)

作者簡(jiǎn)介：趙麗娟(1990-),女,安徽宿州人,合肥工業(yè)大學(xué)碩士生;

doi:10.3969/j.issn.1003-5060.2016.06.026

中圖分類號(hào):Q493.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1003-5060(2016)06-0849-05

鮑斌(1983-),男,河北石家莊人,博士,合肥工業(yè)大學(xué)講師,碩士生導(dǎo)師.