沈 劍， 史玉倉， 吳志賢， 莫自增， 申福定， 梁 杰

?

腺病毒介導IL-24基因對瘢痕疙瘩表達PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的影響

沈 劍， 史玉倉， 吳志賢， 莫自增， 申福定， 梁 杰

目的 探討腺病毒介導白細胞介素-24基因對瘢痕疙瘩成纖維細胞中纖溶酶原激活物抑制劑-1和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA及蛋白水平表達的影響。方法 構建白細胞介素-24腺病毒載體，感染瘢痕疙瘩成纖維細胞，并設置陰性對照組和空白對照組。應用實時定量PCR檢測纖溶酶原激活物抑制劑-1及Ⅰ、Ⅲ膠原蛋白mRNA表達的變化，Western Blot檢測纖溶酶原激活物抑制劑-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白水平表達的變化。結果 白細胞介素-24腺病毒載體感染瘢痕疙瘩成纖維細胞后，與陰性對照組相比，感染組纖溶酶原激活物抑制劑-1和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA及蛋白表達量降低(P<0.05)?？瞻讓φ战M與陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 白細胞介素-24腺病毒載體可能通過調節(jié)纖溶酶原激活物抑制劑-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA及蛋白的表達，減少瘢痕疙瘩成纖維細胞膠原等細胞外基質的沉積。

白細胞介素-24基因； 瘢痕疙瘩； 纖溶酶原激活物抑制劑-1； Ⅰ型膠原蛋白； Ⅲ型膠原蛋白

白細胞介素24(interleukin-24, IL-24)基因是定位于1號染色體的1q32.2-1q41位點的一個單拷貝基因，有7個外顯子和6個內(nèi)含子，由7025個pb組成[1]，能選擇性地抑制腫瘤細胞的生物活性，且不影響正常細胞[2]。Liang等[3]發(fā)現(xiàn)，與正常皮膚成纖維細胞相比，IL-24在瘢痕疙瘩成纖維細胞中呈低表達或不表達狀態(tài)。提示IL-24可能參與了瘢痕疙瘩的形成，并通過IL-24腺病毒載體感染瘢痕疙瘩成纖維細胞，結果顯示IL-24腺病毒載體能夠抑制細胞增殖、促進細胞凋亡，但IL-24基因能否抑制細胞外基質的過度沉積尚不清楚。自2014年1月至2015年9月，廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院整形外科采用體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞(keloid fibroblasts, KF)，并用已構建好的IL-24腺病毒載體感染目的細胞，應用實時定量PCR和Western blot檢測纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA及蛋白表達的變化。

1 標本來源

瘢痕疙瘩標本取自廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院門診及住院手術患者15例。男性6例，女性9例；年齡15～39歲。所有患者均排除了其他器質性疾病，在手術切除前未接受其他任何治療。經(jīng)臨床及病理診斷后，均獲患者知情同意。

2 實驗材料

DMEM低糖培養(yǎng)基、10g/L牛血清白蛋白BSA、胰酶、雙抗(鏈霉素-青霉素)、TRIZOL (美國GIBCO公司)； Real-time PCR 試劑盒(日本同仁化學公司)；反轉錄試劑盒(美國PROMEGA公司)；潔凈工作臺(蘇凈安泰公司)；BCA試劑盒(上海碧云天公司)，PAI-1、COL Ⅰ、COL Ⅲ抗體(英國ABCAM公司)；含重組IL-24腺病毒載體的293A細胞由本課題組前期實驗構建保存。

3 實驗方法

3.1 重組腺病毒載體的純化及病毒滴度測定 取凍存的含重組腺病毒載體(Ad-IL-24)的293A細胞復蘇，以含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。采用氯化銫密度梯度離心法進行純化。將生長良好的293A細胞，經(jīng)0.5%胰酶消化后于顯微鏡下計數(shù)，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基稀釋至細胞終濃度為1×104/ml，按100 μl/孔接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h。采用逐孔稀釋法測定腺病毒滴度。

3.2 細胞培養(yǎng)和實驗分組 將切取的瘢痕疙瘩標本剪去表皮和皮下組織，切成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm～1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm的組織塊，在含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml 的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2，飽和濕度下，以組織貼壁法進行原代培養(yǎng)。選擇3～5代對數(shù)生長期細胞進行實驗，將細胞分為3組。AD-IL-24組(感染AD- IL-24-GFP腺病毒的細胞)，KF-NC組(陰性對照組即感染AD-GFP腺病毒的細胞)，KF-CON組(空白對照組即未感染腺病毒的細胞)。

3.3 腺病毒轉染及效率的測定 將100 μl含病毒液的無血清培養(yǎng)液加入KF中，腺病毒以感染復數(shù)為10感染KF，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)2 h，置于含15%胎牛血清培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。流式細胞儀計算感染效率。

3.4 引物設計與合成 檢索NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫,應用Primer premier 5.0設計出PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白基因以及內(nèi)參β-actin基因的上下游引物序列(表1)，由上海生工合成。3.5 實時定量PCR檢測PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達 棄培養(yǎng)液，PBS洗滌3遍，每孔加入200 μl Trizol,按照常規(guī)方法用氯仿和異丙醇提取KF的總RNA,M-MLV反轉錄酶逆轉錄成cDNA,實時定量PCR檢測PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA的表達。采用相對定量2-△△Ct法比較基因的表達差異。設定空白對照組目的基因mRNA的表達量為1。

△Ct值=目的基因組Ct值-β-actin組Ct值

△△Ct值=實驗組△Ct值-對照組△Ct值

表1 PCR的引物序列和產(chǎn)物的預期長度

3.6 Western Blot檢測PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達 抽提KF總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋白后電轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶TBST溶液封閉，分別按推薦稀釋比例加入相應的一抗，4℃搖床上過夜，次日洗膜3次，再分別加入相應的二抗，ECL法顯色后化學發(fā)光成像儀上顯影，并保存圖像。

3.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，組間比較采用q檢驗及方差分析，檢驗水準α=0.05。

4 結果

4.1 瘢痕疙瘩組織標本病理學診斷 對標本行病理切片檢測，結果顯示，鏡下均見粗大稠密的膠原纖維和大量包裹在一起的未成熟原纖維(圖1)。

4.2 腺病毒載體滴度測定 含Ad-IL-24的293A細胞復蘇培養(yǎng)24 h后，可在熒光顯微鏡下觀察到已表達的綠色熒光蛋白(圖2)，采用氯化銫密度梯度離心法純化，繼續(xù)培養(yǎng)，以GFP陽性計數(shù)法測得重組腺病毒Ad-IL-24滴度為102pfu/ml。

4.3 重組腺病毒的感染效率 腺病毒以感染復數(shù)為10感染KF細胞96 h后，流式細胞儀檢測表達綠色熒光蛋白細胞的比例，結果IL-24腺病毒載體感染KF達到80%以上，符合基因治療對載體的要求。

4.4 PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達 腺病毒以感染復數(shù)為10感染KF 96 h后，實時定量PCR檢測實驗各組PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA的表達情況，β-actin為內(nèi)參。KF-IL-24組細胞PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達量明顯下降，與KF-NC組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；KF-NC組與KF-CON組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

4.5PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白蛋白水平表達 腺病毒以感染復數(shù)為10感染KF96h后，Westernblot檢測實驗各組PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的蛋白水平表達情況，β-actin為內(nèi)參。KF-IL-24組細胞PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白蛋白表達量較KF-NC組明顯下降(P<0.05)，KF-NC組與KF-CON組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖4。

5 討論

病理性癱痕分為增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，瘢痕疙瘩是組織創(chuàng)傷后的異常修復[4]，組織學上表現(xiàn)為以成纖維細胞為主的細胞增殖、活性增強，以及以Ⅰ、Ⅲ 型膠原蛋白為主的細胞外基質沉積，真皮組織過度增生[5]。Ⅰ、Ⅲ 型膠原蛋白主要由成纖維細胞合成，是細胞外基質中最活躍的成分之一，是瘢痕形成的關鍵因素。范東良等[6]發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿作用于瘢痕疙瘩成纖維細胞時，能夠明顯抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA及蛋白水平的表達，從而抑制瘢痕疙瘩生長。Lin等[7]研究表明，Ⅰ型膠原蛋白在瘢痕疙瘩的表達量明顯高于正常皮膚，并隨著瘢痕疙瘩的生長不斷增加，Ⅲ型膠原蛋白在瘢痕疙瘩生長初期的表達量明顯增高，而在后期有所下降，主要分布在組織外周及靠近基底部。因此，在瘢痕疙瘩組織中粗大僵硬的Ⅰ型膠原比例增加，Ⅲ型膠原纖維(網(wǎng)狀纖維)的相對減少和分布的改變，使皮膚的正常結構遭到嚴重破壞，因而瘢痕疙瘩既保存了增生性瘢痕的性質又有其獨特的性質，即侵襲性及復發(fā)性。提示改變瘢痕疙瘩中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量和比例，有可能達到治療目的。

圖1 瘢痕疙瘩組織病理切片(HE染色) a.×10 b.×400 圖2 復蘇24 h后表達綠色熒光蛋白的293A細胞(×40) 圖3 IL-24腺病毒載體對KF細胞PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達的影響(注：*表示與陰性對照組相比，P<0.05) 圖4IL-24腺病毒載體對KF細胞PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響

Fig 1 Pathological slices of keloid tissue (HE). a.×10. b.×400. Fig 2 Expression of 293A cells with green fluorescent protein at 24 h after recovery (×40). Fig 3 Effect of IL-24 cells adenovirus vector on expression of PAI-1 and type I and Ⅲ collagen mRNA.Fig 4 Effect of IL-24 cells adenovirus vector on expression of PAI-1 and type I and Ⅲ collagen protein.

纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1， PAl-1)是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的一員，是最主要的纖溶酶源激活物抑制劑。研究表明，PAI-1在多種組織的纖維化過程中起著主要作用[8]，在培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞內(nèi)，其主要通過滅活尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)及組織型纖溶酶原激活物(tPA)，促進ECM沉積而參與瘢痕疙瘩的形成。通過沉默技術降低PAl-1在瘢痕疙瘩細胞中表達可以抑制細胞增殖及瘢痕疙瘩組織生長[9]。

IL-24基因在腫瘤基因治療方面的研究比較多，具有廣泛的抗腫瘤作用。研究表明,通過在神經(jīng)母細胞瘤[10-11]、黑色素瘤[12]等多種腫瘤細胞內(nèi)過表達IL-24水平均可以起到抗腫瘤作用。其作用主要是通過抑制腫瘤生長，促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤血管生成及腫瘤細胞轉移而實現(xiàn)的[13]。我們前期實驗通過對IL-24病毒載體感染瘢痕疙瘩成纖維細胞的觀察發(fā)現(xiàn),IL-24可抑制細胞的增殖，促進凋亡[14]。但其對細胞外基質過度沉積的作用尚不清楚，因此,我們用IL-24腺病毒載體感染瘢痕疙瘩成纖維細胞，探討IL-24腺病毒載體對PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響。實時定量PCR及Western blot結果顯示,IL-24腺病毒載體可抑制PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA和蛋白水平的表達，PAI-1基因的抑制，可使uPA及tPA活性增強，從而避免ECM過度沉積。Ⅰ、Ⅲ膠原蛋白mRNA和蛋白的表達均受到抑制，但Ⅰ型膠原蛋白的表達抑制更加明顯，與邢幫榮等[15]的實驗結果有相似之處，表明IL-24可以抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的產(chǎn)生，改善Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白比例失衡，從而抑制瘢痕疙瘩的生長發(fā)展。瘢痕疙瘩的形成過程中,不但細胞外基質過度沉積，而且還受到缺氧環(huán)境等復雜微環(huán)境的影響，因此，其與缺氧環(huán)境及其他細胞因子之間的相互作用還待進一步研究闡明。

[1] Wang M, Tan Z, Thomas EK, et al. Conservation of the genomic structure and receptor-mediated signaling between human and rat IL-24[J]. Genes Immun, 2004,5(5):363-370.

[2] Menezes ME, Bhatia S, Bhoopathi P, et al. MDA-7/IL-24: multifunctional cancer killing cytokine[J]. Adv Exp Med Biol, 2014,818:127-153.

[3] Liang J, Huang RL, Huang Q, et al. Adenovirus-mediated human interleukin 24(MDA-7/IL-24) selectively suppresses proliferation and induces apoptosis in keloid fibroblasts[J]. Ann Plast Surg, 2011,7(6):660-666.

[4] Ogawa R. The most current algorithms for the treatment and prevention of hypertrophic scars and keloids[J]. Plast Reconstr Surg, 2010,125(2):557-568.

[5] Sidgwick GP, Bayat A. Extracellular matrix molecules implicated in hypertrophic and keloid scarring[J]. J Eur Acad Dermatol Venereol, 2012,26(2):141-152.

[6] 范東良, 劉金超, 郭 澍, 等. 氧化苦參堿對瘢痕疙瘩成纖維細胞膠原合成的影響[J]. 中國美容整形外科雜志, 2012,23(4):252-254.

[7] Lin L, Wang Y, Liu W, et al. BAMBI inhibits skin fibrosis in keloid through suppressing TGF-β1-induced hypernomic fibroblast cell proliferation and excessive accumulation of collagen Ⅰ[J]. Int J Clin Exp Med, 2015,8(8):13227-13234.

[8] Ghosh AK, Vaughan DE. PAI-1 in tissue fibrosis[J]. Cell Physiol, 2012,227(2):493-507.

[9] Syed F, Bagabir RA, Paus R, et al. Ex vivo evaluation of antifibrotic compounds in skin scarring: EGCG and silencing of PAI-1 independently inhibit growth and induce keloid shrinkage[J]. Lab Invest, 2013,93(8):946-960.

[10] Zhuo B, Wang R, Zhang H, et al. Interleukin-24 inhibits cell migration and invasion in the neuroblastoma cell line SH-SY5Y[J]. Oncol Rep, 2013,30(6):2749-2754.

[11] Li Y, Zhang H, Zhu X, et al. Interleukin-24 induces neuroblastoma SH-SY5Y cell differentiation, growth inhibition, and apoptosis by promoting ROS production[J]. J Interferon Cytokine Res, 2013,33(11):709-714.

[12] Jiang G, Jiang AJ, Cheng Q, et al. A dual-regulated oncolytic adenovirus expressing interleukin-24 sensitizes melanoma cells to temozolomide via the induction of apoptosis[J]. Tumour Biol, 2013,34(2):1263-1271.

[13] Park MA, Hamed HA, Mitchell C, et al. A serotype 5/3 adenovirus expressing MDA-7/IL-24 infects renal carcinoma cells and promotes toxicity of agents that increase ROS and ceramide levels[J]. Mol Pharmacol, 2011,79(3):368-380.

[14] 吳志遠, 史玉倉, 梁 杰, 等. 慢病毒介導hIL-24基因對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、遷移及侵襲性的影響[J]. 中華整形外科雜志, 2014,30(5):359-364.

[15] 邢幫榮, 利天增, 謝舉臨, 等. α1(Ⅰ)型前膠原基因反義寡聚脫氧核苷酸對人增生性瘢痕成纖維細胞生物學特性的影響[J]. 中國美容整形外科雜志, 2013,24(3):152-156.

Effects of adenovirus mediated interleukin-24 gene on the expression of PAI-1, type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen of keloids

SHENJian,SHIYu-cang,WUZhi-xian,MOZi-zeng,SHENFu-ding,LIANGJie.

(DepartmentofPlasticSurgery,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524001,China)

LIANGJie,Email:liangjieplastic@163.com

Objective To investigate the effect of IL-24 gene on expression on mRNA and protein level of Plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1), type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen of human keloid fibroblasts (KFs). Methods Interleukin 24 (IL-24) gene was cloned into adenovirus vector, then the adenovirus particles expressing IL-24 were infected into keloid fibroblasts (KF cells), KF-IL-24; KF-NC and KF-CON were used as the control groups. Real time PCR and Western blot were performed to examine the expression of IL-24 in adenovirus infected cells. Results Compared with KF-CON group and KF-NC group, the expression levels of IL-24 mRNA and protein were both significantly upregulated in KF-IL-24 group after KF cells were infected (P>0.05).ThedifferencebetweentheKF-CONgroupandKF-NCgroupwasnotstatisticallysignificant(P>0.05). Conclusion Adenovirus-mediated IL-24 gene may inhibit deposition of extracellular matrix of KF through controlling the expressions of PAI-1, type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen mRNA and protein.

Interleukin-24 gene; Keloid; Plasminogen activator inhibitor-1; Type Ⅰ collagen; Type Ⅲ collagen

廣東省省級科技計劃項目(2013B021800063) 作者單位：524001 廣東 湛江，廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院 整形外科 第一作者：沈 劍(1989-)，男，河南信陽人，碩士研究生. 通信作者：梁 杰，524001，廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院 整形外科，電子信箱：liangjieplastic@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.03.019

R

A

1673-7040(2016)03-0177-04

2016-01-10)