吳旭錦，朱小甫

(咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，動物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室，陜西咸陽 712000)

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豬偽狂犬病病毒套式PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

吳旭錦，朱小甫*

(咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，動物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室，陜西咸陽 712000)

摘要：對偽狂犬病病毒(PRV)國標(biāo)PCR方法進(jìn)行優(yōu)化，建立一種高靈敏度的套式PCR方法。根據(jù)偽狂犬病病毒gD基因序列，設(shè)計(jì)并合成了2對引物，通過反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化建立套式PCR方法。通過靈敏性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)、病料檢測對比試驗(yàn)等驗(yàn)證建立方法的適用性。結(jié)果表明，建立的方法檢測偽狂犬病病毒DNA的極限為2.6×10-7ng/mL，靈敏度比國家標(biāo)準(zhǔn)方法提高了1 000倍,從疑似PRV感染組織病料中能大幅度提高陽性檢出率。本研究成功建立了一種靈敏度高、特異性好的快速檢測豬偽狂犬病病毒的套式PCR檢測方法。

關(guān)鍵詞：偽狂犬病病毒；套式PCR；診斷；應(yīng)用

豬偽狂犬病(Porcine pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一種以感染豬發(fā)熱、腦脊髓炎為特征的傳染病，PRV感染懷孕母豬引起流產(chǎn)、死胎，初生仔豬感染病死率高，成年豬多呈隱性感染，是PRV傳播的危險(xiǎn)傳染源[1]。PR在我國豬群中流行范圍很廣，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。20世紀(jì)70年代以來，偽狂犬病弱毒疫苗以及基因缺失苗的廣泛應(yīng)用，一度使我國偽狂犬病得到了有效控制。但近幾年來，豬偽狂犬病發(fā)病報(bào)道激增，呈現(xiàn)卷土重來之勢，給養(yǎng)豬業(yè)造成沉重打擊[4-6]。為防控PR，特異靈敏的診斷手段是必不可少的。我國國家標(biāo)準(zhǔn)《偽狂犬病診斷技術(shù)(GB/T 18641-2002)》中提出的診斷技術(shù)手段包括病毒分離鑒定、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、家兔接種試驗(yàn)、血清中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和乳膠凝集試驗(yàn)[7]，其中PCR是最為靈敏、快速的診斷方法[8-9]。但是，在臨床實(shí)際應(yīng)用國標(biāo)PCR方法進(jìn)行臨床疑似PR病例診斷時(shí)發(fā)現(xiàn)，直接用采集的鼻棉拭子、肺臟或扁桃體等樣品處理后提取DNA，多數(shù)樣本進(jìn)行PCR得到的是陰性結(jié)果，但通過Vero細(xì)胞接種傳代后，用細(xì)胞培養(yǎng)物提取DNA進(jìn)行PCR得到的是陽性結(jié)果，推測可能是國標(biāo)方法的靈敏度不夠，樣品中病毒含量較低時(shí)可能無法有效擴(kuò)增。研究發(fā)現(xiàn)，套式PCR能夠大幅度提高基因擴(kuò)增的靈敏度，即使在模板濃度較低的情況下也能高效擴(kuò)增目的基因[10]。為此，本研究旨在利用套式PCR技術(shù)對國標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，提高檢測靈敏度，以期在臨床從組織病料中能夠直接、有效地?cái)U(kuò)增目的片段，以達(dá)到快速、準(zhǔn)確的診斷目的。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒PRV SXHX株為分離自戶縣某豬場野毒株；豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)SXXY13株分離自旬邑縣某豬場；豬細(xì)小病毒(PPV)SXHZ株分離自漢中市某豬場；豬流行性腹瀉病毒(PEDV)YLCH株分離自榆林某豬場；以上分離毒株均由咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室保存。豬瘟病毒(CSFV)和豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV)均為普萊柯生物工程股份有限公司生產(chǎn)的疫苗毒株。

1.1.2病料采集或豬場送檢的疑似PR病料(包括肺臟、腦組織和扁桃體)以及病豬血清，分別來自咸陽、寶雞、渭南和西安地區(qū)豬場，共計(jì)8份，將病料研磨處理，12 000 r/min離心10 min，收集上清液置-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3細(xì)胞和試劑Vero細(xì)胞系為動物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室保存；Trizol Reagent、DNAzol Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品；AMV反轉(zhuǎn)錄酶(10 U/μL)、RNA酶抑制劑(40 U/μL)、DEPC處理水、rTaq酶(5 U/μL)、dNTPs(各成分均為10 mmol/L)、2×GC buffer等均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.4引物設(shè)計(jì)與合成參考國標(biāo)GB/T 18641-2002，根據(jù)GenBank上公布的PRV gD基因序列(登錄號AY196984、AY217094)，設(shè)計(jì)并合成了2對引物，PRVgD-1F：5′- GCGGTCCCACGTTCGCATTCA -3′；PRVgD -1R：5′- CCCGGTCACGATTCGCAGCA-3；PRVgD-2F：5′-CACGGAGGACG- AGCTGGGGCT-3′ ；PRVgD-2R：5′- GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT -3′。采用套式聚合酶鏈反應(yīng)(nPCR)方法，預(yù)期擴(kuò)增片段217bp，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，用DEPC處理水稀釋到20 μmol/L。

1.2方法

1.2.1病毒DNA的提取取PRV SXHX株細(xì)胞培養(yǎng)物200 μL置于無菌EP管，加入DNAzol Reagent 1 000 μL，上下顛倒混勻，室溫靜置裂解10 min，4℃、12 000 r/min離心5 min，吸取600 μL上清液轉(zhuǎn)移至另一無菌EP管，加入等體積冰冷無水乙醇沉淀10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入1 mL冰冷的700 mL/L乙醇清洗2次，倒置干燥，用40 μL 8 mmol/L NaOH充分吹打溶解，置沸水浴中10 min，取出后冰浴3 min，在核酸蛋白測定儀上測定DNA的含量。

1.2.2PRV套式PCR(nPCR)方法的建立取已知濃度的DNA溶液作為模板，摸索擴(kuò)增條件。第1次擴(kuò)增反應(yīng)體系中DNA 2.0 μL，2×GC buffer 12.5 μL，dNTPs 1.0 μL，PRVgD-1F、PRVgD -1R各0.5 μL，改變r(jià)TaqDNA聚合酶用量(0.25 μL～1.0 μL)，用超純水補(bǔ)足總體積25.0 μL。條件設(shè)定為：95℃ 5 min；94℃ 1 min，退火溫度由60℃～65℃按1℃遞增設(shè)定退火1 min，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。第2次擴(kuò)增時(shí)取2.0 μL第1次擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，其他成分同第1次擴(kuò)增進(jìn)行設(shè)定摸索，只是引物更換為PRVgD -2F、PRVgD -2R。條件設(shè)定為：95℃ 5 min； 94℃ 1 min，退火溫度由60℃～65℃按1℃遞增設(shè)定退火1 min，72℃ 延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。確定反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的最佳組合。

1.2.3PRV國標(biāo)PCR方法與建立的nPCR方法靈敏性試驗(yàn)比較將DNA溶液做10倍梯度稀釋至10-10倍，分別以各稀釋后DNA溶液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。國標(biāo)法按照標(biāo)準(zhǔn)的操作要求進(jìn)行。

建立的nPCR方法第1次擴(kuò)增按照以下反應(yīng)體系進(jìn)行：DNA 2.0 μL，超純水8.0 μL，2×GC buffer 12.5 μL，dNTP 1.0 μL，NPRVgD-1F、PRVgD -1R各0.5 μL，rTaq酶0.5 μL，總體積25.0 μL。PCR條件為：95℃ 5 min；94℃ 1 min，62℃ 1 min，72℃ 1 min，35個循環(huán)；最后72℃ 10 min。取第1次擴(kuò)增產(chǎn)物2.0 μL作為模板進(jìn)行第2次擴(kuò)增，體系同第1次擴(kuò)增，引物為PRVgD-2F/PRVgD-2R。PCR條件為95℃ 5 min；94℃ 1 min，65℃ 1 min，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增完畢后取5.0 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，15 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)中觀察照相。

1.2.4PRV nPCR方法特異性試驗(yàn)提取CSFV、PRRSV和PEDV等RNA病毒的核酸并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；按照DNAzol Reagent試劑說明提取PRV SXHX株、PCV-2 SXXY13株以及PPV SXHZ株等DNA病毒DNA模板，用建立的nPCR方法檢測，PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，成像系統(tǒng)中觀察照相。

1.2.5病料中PRV的檢測對比用以上建立的檢測方法和國標(biāo)方法對收集的8份病料進(jìn)行檢測。

1.2.6病料中PRV的分離與檢測分別取8份病料上清液200 μL，接種于Vero細(xì)胞盲傳3代，出現(xiàn)細(xì)胞病變后反復(fù)凍融收集細(xì)胞液備用。提取8份盲傳3代的Vero細(xì)胞液DNA，用國標(biāo)PCR方法進(jìn)行檢測。

2結(jié)果

2.1PRV nPCR方法的建立

通過改變反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，最終確定最優(yōu)體系和條件為：第1次擴(kuò)增DNA 2.0 μL，2×GC buffer 12.5 μL，超純水8.0 μL，dNTP 1.0 μL，PRVgD-1F、PRVgD -1R各0.5 μL，rTaqDNA聚合酶0.5 μL，總體積25.0 μL。PCR條件為：95℃ 5 min；94℃ 1 min，62℃ 1 min，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。第2次擴(kuò)增反應(yīng)體系：取2.0 μL第1次擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，體系其余組分同第1次擴(kuò)增，引物為PRVgD-2F/PRVgD -2R。PCR條件為：95℃ 5 min；94℃ 1 min，65℃ 1 min，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

2.2PRV國標(biāo)PCR方法與建立的nPCR方法靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過測定，PRV SXHX株細(xì)胞培養(yǎng)液DNA含量為260 ng/mL，將其按照10倍梯度進(jìn)行稀釋，分別進(jìn)行PCR。從圖1可知，國標(biāo)法能夠檢測的極限為10-5倍稀釋，即2.6×10-3ng/mL。所建立的nPCR方法能夠擴(kuò)增出10-8倍稀釋的DNA(圖2)，即檢測的極限為2.6×10-7ng/mL。表明建立的nPCR方法靈敏度提高了1 000倍。

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～8. 依次為DNA濃度260×10-1ng/mL ～260×10-8ng/mL 10倍梯度稀釋

M. DNA Marker DL 2 000; 1-8. 260×10-1ng/mL -260×10-8ng/mL of PRV DNA

圖1PRV 國標(biāo)PCR檢測方法靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

Fig.1The results of sensitivity test for PRV by PCR

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～10.依次為DNA濃度 260×10-1ng/mL～260×10-10ng/mL 10倍梯度稀釋

M. DNA Marker DL 2 000; 1-10. 260×10-1ng/mL -260×10-10ng/mL of PRV DNA

圖2PRV nPCR檢測方法靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

Fig.2The results of sensitivity test for PRV by nPCR

2.3PRV nPCR檢測方法特異性試驗(yàn)結(jié)果

用所建立的方法對CSFV、PRRSV、PRV SXHX株、PEDV、PCV-2 SXXY13株以及PPV SXHZ株cDNA/DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅有PRV SXHX株擴(kuò)增出了217 bp的預(yù)期目的條帶，其他5種病毒均為陰性，提示所建立的方法特異性好(圖3)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.CSFV；2.PRRSV； 3.PRV； 4.PEDV；

5.PCV-2；6.PPV

M.DNA Marker DL 2 000; 1.CSFV；2.PRRSV； 3.PRV； 4.PEDV；

5.PCV-2；6.PPV

圖3PRV nPCR檢測方法特異性試驗(yàn)結(jié)果

Fig.3The result of specificity test for PRV by nPCR

2.4病料中PRV的檢測結(jié)果對比

提取收集的8份疑似感染PRV的組織病料總DNA，分別用國標(biāo)法和建立的nPCR方法進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示國標(biāo)PCR方法對8份病料的擴(kuò)增僅有2份出現(xiàn)目的條帶，陽性率為25%；建立的nPCR方法在8份病料中5份擴(kuò)增出了目的條帶，陽性率為62.5%。結(jié)果顯示，與國標(biāo)法相比，優(yōu)化后的檢測方法能夠更有效地從病料中擴(kuò)增目的條帶，大幅度提高了檢出率。

2.5病料中PRV的分離與國標(biāo)方法檢測

經(jīng)過Vero細(xì)胞3代盲傳，采用國標(biāo)方法從8份病料傳代培養(yǎng)物中檢測出了5份陽性結(jié)果，結(jié)果與改進(jìn)后的nPCR方法完全一致。

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000； 1～8.病料檢測

3討論

豬偽狂犬病近年來在我國流行呈上升趨勢，快速準(zhǔn)確的診斷有助于對該病的有效防控。現(xiàn)在常規(guī)的診斷方法中，家兔接種試驗(yàn)耗時(shí)過長，常需要數(shù)天時(shí)間；病毒分離鑒定的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)果確實(shí)可靠，能獲取毒株資源，但缺點(diǎn)是需要細(xì)胞培養(yǎng)，條件要求高，分離時(shí)間長；血清中和試驗(yàn)同樣需要細(xì)胞培養(yǎng)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)是檢測時(shí)間短，靈敏度高，但不足是只能反映抗體情況，不能確定病毒在機(jī)體內(nèi)復(fù)制與分布情況。PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，不需要細(xì)胞培養(yǎng)，所需時(shí)間短，能快速診斷，且診斷材料來源寬泛。國標(biāo)中提供了檢測PRV的PCR方法，但在實(shí)際應(yīng)用中，筆者發(fā)現(xiàn)對于PR臨床疑似病例國標(biāo)方法一些檢測陰性材料通過細(xì)胞接種后檢測呈陽性，提示國標(biāo)方法靈敏度較低，存在漏檢情況。本研究根據(jù)套式PCR原理，在國標(biāo)gD基因引物擴(kuò)增片段之外再設(shè)計(jì)一對引物，建立了檢測PRV的套式PCR方法。

引物的設(shè)計(jì)是PCR檢測技術(shù)的關(guān)鍵，引物決定了檢測的靈敏度和特異性[11-12]。本研究采用設(shè)計(jì)的外擴(kuò)引物建立的nPCR方法，經(jīng)過對CSFV、PRRSV、PEDV、PCV-2以及PPV cDNA/DNA擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性，僅能從PRV參考毒株中獲得陽性結(jié)果，證實(shí)設(shè)計(jì)的引物是特異、可靠的。PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化是獲得良好結(jié)果的保證，由于PRV DNA G+C含量高達(dá)73%，變性時(shí)解鏈難度大，因此，在提取DNA后先沸水浴10 min，然后迅速置于冰水中冷卻，目的就是獲得盡量多的單鏈DNA。在反應(yīng)體系中，筆者在試驗(yàn)中參考文獻(xiàn)曾嘗試了DMSO、甘油等成分[13]，均未取得理想結(jié)果，推測可能與引物設(shè)計(jì)不同有關(guān)，但使用2×GC buffer后能穩(wěn)定獲得目的條帶，是成功擴(kuò)增PRV基因的關(guān)鍵成分。靈敏度試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，建立的nPCR方法能夠檢測的極限為2.6×10-7ng/mL，比國標(biāo)方法靈敏度提高了1 000倍，對臨床病毒含量低的病料檢測有重要意義，通過對8份疑似病料的檢測也證實(shí)了該方法確能大幅度的提高檢出率，為臨床檢測提供了一種可靠的檢測手段。

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Establishment and Application of nPCR for Detecting Porcine Pseudorabies Virus

WU Xu-jin ,ZHU Xiao-fu

(AnimalEpidemicDiseaseDiagnosticLaboratoryofMolecularBiology,InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,XianyangVocationalTechnicalCollege,Xianyang,Shaanxi,712000,China)

Abstract:To establish a highly sensitive nested PCR methods for detecting porcine pseudorabies virus,according to published gene sequences of PRV gD, two pairs of primers were designed and synthesized, the nested PCR method was established by optimizing the reaction system and conditions. The method applicability was verified by sensitivity test, specificity test, sample comparison tests. The results showed that the detection limit of the method established is 2.6 × 10-7ng/mL, the sensitivity is 1 000 times higher than that of national standard method, and the objective band was only amplified from the pseudorabies virus reference strain, and could greatly improve the positive detection rate from suspected samples. The nested PCR detection mehod with high sensitivity and good specificity for rapid PRV detection was successfully established.

Key words:Pseudorabies virus; nested PCR; diagnosis; application

收稿日期：2015-12-15

基金項(xiàng)目：咸陽市科學(xué)技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2015k03-21)

作者簡介：吳旭錦(1979-)，女，博士，副教授，主要從事動物疫病分子病原學(xué)與納米藥物學(xué)研究。*通訊作者

中圖分類號:S852.65

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)06-0018-04