白　冰，葛龍菲，田晨光△

(1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，鄭州 450000；2.鄭州市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，鄭州 450000)

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胰島素抵抗和單硝酸異山梨酯對SHR心肌細(xì)胞凋亡的影響

白冰1，葛龍菲2，田晨光1△

(1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，鄭州 450000；2.鄭州市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，鄭州 450000)

[摘要]目的觀察胰島素抵抗(IR)和單硝酸異山梨酯(ISMN)對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)心肌細(xì)胞凋亡的影響。方法14周齡雄性Wistar大鼠(W)和SHR(S)各40只，分別或聯(lián)合喂飼普通飼料(普)、高脂高糖(HFHG)飼料及生理鹽水(NS)和ISMN灌胃。將其分為普+NS組(W 普和S普)，HFHG +NS組(W高和S高)，普+ISMN組(W單和S單)，HFHG+ISMN組(W高單和S高單)，每組各10只。喂養(yǎng)12周，取頸動脈血檢測血糖及血清胰島素水平并計(jì)算IR指數(shù)(HOMA-IR)；取心肌組織4份，分別觀察光鏡下形態(tài)、組織中一氧化氮(NO)水平，bcl-2、bax基因及其蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果心肌NO水平、bax基因 mRNA及相關(guān)蛋白表達(dá)水平，在給予HFHG和ISMN干預(yù)的各組均高于普通組，bcl-2基因mRNA及相關(guān)蛋白表達(dá)反之；S組大鼠心肌組織NO水平、bax基因 mRNA及相關(guān)蛋白表達(dá)均較相應(yīng)的W組增多，bcl-2基因mRNA及相關(guān)蛋白表達(dá)反之；W高組大鼠心肌組織NO水平與HOMA-IR呈顯著正相關(guān)，W單組大鼠HOMA-IR與心肌組織NO水平與呈正相關(guān)。結(jié)論SHR心肌細(xì)胞凋亡較Wistar大鼠增多，ISMN、IR均能加重SHR心肌細(xì)胞凋亡，且ISMN與IR互相誘導(dǎo)、互為因果。

[關(guān)鍵詞]大鼠，近郊SHR；胰島素抵抗；單硝酸異山梨酯；細(xì)胞凋亡

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)是多種代謝異常發(fā)生在同一個(gè)體的臨床狀態(tài)，以胰島素抵抗胰島素抵抗(insulin Resistance，IR)為基礎(chǔ)及中心環(huán)節(jié)[1]，以高血壓、糖尿病、脂代謝紊亂等為組分，這些組分之間互有協(xié)同作用，可直接促進(jìn)動脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerosis cardiovascular disease，ASCVD)的發(fā)生和發(fā)展，如心肌缺血、心肌細(xì)胞凋亡等。但具體作用機(jī)制，如IR是否可直接導(dǎo)致和(或)加重由高血壓直接引起的心肌凋亡等，尚未完全明確。目前ASCVD的治療多依賴藥物，其中常用藥物為硝酸酯類如單硝酸異山梨酯(isosorbide mononitrate，ISMN)，后者通過提供外源性一氧化氮(NO)發(fā)揮作用。但有研究發(fā)現(xiàn)，NO有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，而ISMN會否通過提供NO加劇高血壓大鼠心肌細(xì)胞凋亡，目前研究較少。本文分別通過誘導(dǎo)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)IR狀態(tài)和飼喂ISMN，來探究IR、ISMN對SHR心肌細(xì)胞凋亡的影響，以期從IR的角度解釋高血壓心肌細(xì)胞凋亡，并質(zhì)疑高血壓患者長期應(yīng)用ISMN的安全性。

1材料與方法

1.1材料動物：選擇14周齡雄性Wistar大鼠(河南省實(shí)驗(yàn)動物中心)和SHR(北京聯(lián)合利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司)各40只，體質(zhì)量(393.75±11.09)g；普通飼料配方為：蛋白質(zhì)：脂肪：碳水化合物比值為：9∶2∶24，購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心；高脂高糖(HFHG)配方為：普通飼料79%，蔗糖10%，豬油5%，膽固醇5%，石膽酸1%。ISMN片，購自魯南貝特制藥有限公司，規(guī)格為：片劑 20 mg×48片。

1.2方法

1.2.1動物分組及干預(yù)措施將80只大鼠隨機(jī)分為W普、W高、W單、W高單組和S普、S高、S單、S高單組，每組10只。W普和S普組飼喂普通飼料和NS，W高和S高組飼喂HFHG和NS，W單和S單組飼喂普通飼料和ISMN，W高單和S高單組飼喂HFHG和ISMN。其中，ISMN按4.20 mg/kg劑量灌胃。

1.2.2動脈血葡萄糖、胰島素水平測定及IR指數(shù)(HOMA-IR)的計(jì)算上述方法喂養(yǎng)12周。禁食不禁水12 h后麻醉大鼠，取頸動脈血1 mL，離心后取上層血清，置于-20 ℃冰箱，用于檢測空腹血糖(FBP，葡萄糖氧化酶法)及空腹胰島素(FINS，放射免疫法)水平。取自然對數(shù)表示，使其成正態(tài)分布，其中FBG的單位是mmol/L，F(xiàn)INS的單位是mIU/L。HOMA-IR的計(jì)算公式如下：

HOMA-IR=FBG×FINS/22.5

1.2.3測定心肌組織中NO水平和bcl-2、bax基因及蛋白表達(dá)取血結(jié)束后，在冰面工作臺上處死大鼠，開胸取出心臟，冰水沖洗后在心底部各取約100 mg全層心肌組織共4份。其中，1份放入4%甲醛溶液中，原位缺口末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)觀察心肌形態(tài)，另外3份均迅速放入液氮冷凍，置于-80 ℃冰箱中保存，分別各自采用硝酸還原酶法測定NO，RT-PCR法測定bcl-2與bax mRNA表達(dá)水平，Western blot法測定bcl-2與bax蛋白表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1各組大鼠HOMA-IR比較W高、W單、W高單組HOMA-IR均較W普組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。S高、S單、S高單組HOMA-IR均較S普組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。S組大鼠HOMA-IR高于相應(yīng)W組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1　　各組大鼠HOMA-IR比較

a：P<0.05，與同種大鼠普組比較；b：P<0.05，與相應(yīng)W組比較。

2.2各組大鼠心肌組織中NO水平比較W高、W單、W高單組大鼠較W普組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。S高、S單、S高單組大鼠較S普組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。S組大鼠心肌組織NO水平均高于相應(yīng)W組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。S高單組大鼠心肌組織NO水平高于S高、S單組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2　　各組大鼠心肌組織中NO水平比較

a：P<0.05，與同種大鼠普組比較；b：P<0.05，與相應(yīng)W組比較。

2.3W高、W單組大鼠HOMA-IR與心肌組織NO水平的相關(guān)性分析W高、W單組心肌組織NO水平與HOMA-IR呈正相關(guān)(r=0.90、P<0.01，r=0.74，P<0.05)，見圖1。

圖1　W高、W單組大鼠HOMA-IR與心肌組織NO水平的相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

圖2　各組大鼠凋亡心肌細(xì)胞TUNEL 染色切片光鏡下圖像(×400)

2.4各組大鼠心肌形態(tài)學(xué)觀察W高、W單、W高單組大鼠每高倍視野心肌細(xì)胞凋亡多于W普組大鼠(P<0.05)。S高、S單、S高單組大鼠每高倍視野心肌細(xì)胞凋亡多于S普組大鼠(P<0.05)。S組大鼠每高倍視野心肌細(xì)胞凋亡多于相應(yīng)W組大鼠(P<0.05)，見表3。各組大鼠TUNEL 染色切片在光鏡下可以觀察到凋亡心肌細(xì)胞的細(xì)胞核被染成棕黃色，正常細(xì)胞核不染色。各組大鼠心肌組織中均存在一定數(shù)量的凋亡細(xì)胞(箭頭所示)。經(jīng)HFHG飲食和(或)ISMN藥物干預(yù)的大鼠凋亡增多，SHR凋亡總體多于Wistar大鼠，見圖2。

表3　　各組大鼠心肌凋亡細(xì)胞數(shù)比較±s，每高倍視野)

a：P<0.05，與同種大鼠普組比較；b：P<0.05，與相應(yīng)W組比較。

2.5各組大鼠心肌組織bcl-2與bax mRNA表達(dá)比較心肌組織bcl-2 mRNA表達(dá)水平，W高、W單、W高單組大鼠均低于W普組(P<0.05)；S高、S單、S高單組大鼠均低于S普組(P<0.05)；S組大鼠心肌組織bcl-2 mRNA表達(dá)水平均低于相應(yīng)W組大鼠(P<0.05)。心肌組織bax mRNA表達(dá)水平，W高、W單、W高單組大鼠均較W普組高(P<0.05)；S高、S單、S高單組大鼠均較S普組高(P<0.05)。S組大鼠心肌組織bcl-2 mRNA表達(dá)水平均高于相應(yīng)W組大鼠(P<0.05)，見表4及圖3。

表4　　各組大鼠心肌組織中bcl-2與bax mRNA表達(dá)水平比較

a：P<0.05，與同種大鼠普組比較；b：P<0.05，與相應(yīng)W組比較，P<0.05。

圖3　各組大鼠bcl-2、bax基因PCR分析結(jié)果

2.6各組大鼠心肌組織bcl-2與bax蛋白表達(dá)水平心肌組織bcl-2蛋白表達(dá)水平，W高、W單、W高單組大鼠均低于W普組(P<0.05)；S高、S單、S高單組大鼠均低于S普組(P<0.05)。S組大鼠心肌組織bcl-2蛋白表達(dá)水平均低于相應(yīng)W組大鼠(P<0.05)。大鼠心肌組織bax蛋白表達(dá)水平，W高、W單、W高單組大鼠均較W普組高(P<0.05)；S高、S單、S高單組大鼠均較S普組高(P<0.05)。S組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白表達(dá)水平均高于相應(yīng)W組大鼠(P<0.05)，見表5及圖4。

表5　　各組大鼠心肌組織中bcl-2與bax蛋白表達(dá)水平比較

a：P<0.05，與同種大鼠普組比較；b：P<0.05，與相應(yīng)W組比較。

圖4　　各組大鼠bcl-2、bax蛋白表達(dá)

3討論

NO是近年來的研究熱點(diǎn)之一，它在舒張血管、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要作用。在本研究中，SHR心肌組織中NO水平高于普通大鼠，這與目前所認(rèn)為的高血壓時(shí)血液中NO減少的結(jié)果不一致，或許是機(jī)體為保持血壓處于較低水平而做出的代償反應(yīng)[2]。為拮抗高血壓狀態(tài)，SHR體內(nèi)蛋白偶聯(lián)亞硝鐵復(fù)合物(DNIC)合成會增多，其或許可通過與非血紅素鐵反應(yīng)，來提高血中NO水平[3]。另外，也有研究觀察到SHR心臟內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮合酶(NOS)Ⅲ作用增強(qiáng)[4]，及主動脈中NOS Ⅱ的基礎(chǔ)表達(dá)增多[5-6]。

本研究數(shù)據(jù)顯示，應(yīng)用ISMN后，SHR心肌細(xì)胞凋亡增多?？赡艿脑蚴牵?1)飼喂12周后，SHR大鼠合成NO能力或許尚能代償，但釋放NO入血液的能力減弱，從而使較多的NO積聚于組織細(xì)胞中；(2)長期應(yīng)用ISMN可增加氧自由基生成[7]，后者造成心肌細(xì)胞損傷；(3)體內(nèi)過多的NO通過環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)通路介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)可與超氧陰離子反應(yīng)生成過氧亞硝基，造成心肌損害[8-9]。

作為MS的基礎(chǔ)，IR可直接促進(jìn)動脈粥樣硬化，但其是否可直接引起心肌細(xì)胞凋亡尚未知。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)HFHG干預(yù)的Wistar大鼠和SHR心肌細(xì)胞凋亡分別多于普通飲食的同種大鼠，且心肌凋亡明顯增多的飲食和(或)藥物干預(yù)組大鼠均伴有較嚴(yán)重的IR，這說明IR或許是引起細(xì)胞凋亡的因素之一。有研究發(fā)現(xiàn)，IR引起的氧化應(yīng)激、炎癥、內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、代謝失衡、離子內(nèi)環(huán)境異常和間質(zhì)纖維化等可直接導(dǎo)致心肌損傷，如梗死、凋亡等[10-13]。而在損害血管方面，IR狀態(tài)下許多炎性因子如C反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)等增多，同時(shí)，IR及其伴隨的高胰島素血癥促進(jìn)動脈壁脂質(zhì)攝取，防止膽固醇清除，以上因素均可促進(jìn)動脈壁平滑肌細(xì)胞增殖，誘發(fā)并加劇動脈粥樣硬化，從而導(dǎo)致心肌缺血、凋亡。另外，IR可直接引起高血壓，從而加劇IR大鼠心肌細(xì)胞凋亡。但目前尚無IR導(dǎo)致高血壓的具體解釋，多數(shù)認(rèn)為IR繼發(fā)性高胰島素血癥能使腎臟水鈉重吸收增強(qiáng)，交感神經(jīng)系統(tǒng)活性亢進(jìn)，動脈彈性減退，從而使血壓升高。

在MS患者，IR與高血壓常合并存在，二者具有協(xié)同作用。如本研究所見，MS患者常用藥物ISMN可引起IR，如ISMN灌胃的W單組大鼠，其HOMA-IR與心肌組織NO水平呈正相關(guān)。也有研究證實(shí)，胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)與骨骼肌中誘導(dǎo)型NOS(iNOS)表達(dá)增多有關(guān)[14-15]。以上均提示，體內(nèi)NO的增多會誘導(dǎo)IR的發(fā)生。另外，應(yīng)用HFHG干預(yù)的W高組大鼠心肌組織中NO與其HOMA-IR呈顯著正相關(guān)，說明IR狀態(tài)下，大鼠心肌組織內(nèi)NO增多。這或許與IR繼發(fā)的高胰島素血癥有關(guān)，因?yàn)橐葝u素在糖代謝失調(diào)時(shí)，可反應(yīng)性增加內(nèi)源性NO的生成。以上發(fā)現(xiàn)均提示NO增多與IR之間存在關(guān)聯(lián)，二者互相誘導(dǎo)、互為因果。

總之，IR、NO均可導(dǎo)致并加重雄性SHR心肌細(xì)胞凋亡，且IR、NO之間互相誘導(dǎo)。值得注意的是，本次實(shí)驗(yàn)對象全部采用雄性大鼠，其所得數(shù)據(jù)不能代表整體大鼠。另外有研究認(rèn)為，患者長期應(yīng)用ISMN后，血管內(nèi)皮功能將受到損害[16]，但本實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)時(shí)間較短(僅12周)，未能反映ISMN對心肌的長期作用。SHR心肌細(xì)胞凋亡較普通大鼠增多。短期飼喂ISMN可加重SHR心肌細(xì)胞凋亡，且IR亦加重其凋亡。IR與心肌組織中NO互相誘導(dǎo)，原因未明。

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Influenc of insulin resistance and isosorbide mononitrate on myocardial cellular apoptosis in spontaneously hypertensive rats

BaiBing1,GeLongfei2,TianChenguang1△

(1.DepartmentofEndocrinology,SecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450000,China;2.DepartmentofEndocrinology,ZhengzhouMunicipalFirstPeople′sHospital,Zhengzhou,Henan450000,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the influence of insulin resistance(IR) and isosorbide mononitrate(ISMN) on myocardial cellular apoptosis in spontaneously hypertensive rats(SHR).MethodsForty male 14-week old Wistar(W) rats and SHR(S) each were respectively or jointly fed with normal diet (ND),high fat and high glucose(HFHG) diet,normal saline(NS)and ISMN by gavage.Then they were randomly divided into the normal and NS group(normal W and normal S),HFHG and NS group(HFHG W and HFHG S),normal and ISMN group(ISMN W and ISMN S),HFHG and ISMN group(HI W and HI S),with 10 rats in each group.After 12-week feeding,carotid arterial blood was collected for detecting blood glucose concentration and insulin level and calculating insulin resistance index (HOMA-IR);4 myocardial tissue samples were taken for respectively observing the morphology under microscope,and detecting the NO level,myocardial Bcl-2,Bax gene and their protein expression levels in myocardial tissue.ResultsMyocardial NO level,Bax gene mRNA and related protein levels in the HFHG and ISMN intervention groups were higher than those in the normal group,while the bcl-2 gene mRNA and related protein expression were on the contrary;myocardial tissue NO level,Bax gene mRNA and related protein expression in the S groups were increased compared with the corresponding W groups,while the bcl-2 gene mRNA and related protein expression were on the contrary;in the HFHG W group,the myocardial tissue NO level had significantly positive correlation with HOMA-IR,and in the ISMN W group,HOMA-IR was positively correlated with the NO level in the myocardial tissue.ConclusionMyocardial cellular apoptosis of SHR is increased compared with Wistar rats;both IR and ISMN can aggravate the apoptosis of SHR myocardial cells,moreover IR has a mutual induction and reciprocal causation with ISMN.

[Key words]rats,suburbs SHR；insulin resistance;isosorbide mononitrate;apoptosis

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.18.009

作者簡介：白冰(1990-)，碩士研究生，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的診治研究?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail：tcg90123@163.com。

[中圖分類號]R587.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)18-2478-04

(收稿日期：2015-11-15修回日期：2016-03-10)