金海祥，吳周浩

(浙江省海寧中醫(yī)院麻醉科　314400)

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腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在ATP活化BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中的作用

金海祥，吳周浩

(浙江省海寧中醫(yī)院麻醉科314400)

[摘要]目的探討腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)在腺苷三磷酸(ATP)激活BV2小膠質(zhì)細(xì)胞過程中的作用。方法以不同濃度ATP孵育BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后，采用Western blot法定量檢測細(xì)胞中CD11b、BDNF表達(dá)水平，ELISA測定上清液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)的分泌水平。再將BV2細(xì)胞用不同濃度BDNF清除劑原肌球蛋白相關(guān)激酶B(TrkB)/Fc預(yù)處理后給予ATP孵育，檢測細(xì)胞中CD11b、BDNF表達(dá)水平的變化及上清液中TNF-α的分泌水平。最后加入外源性重組BDNF，檢測細(xì)胞內(nèi)CD11b表達(dá)和上清液中TNF-α的水平變化。結(jié)果ATP孵育BV2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi) CD11b、BDNF及上清液中TNF-α水平在一定范圍內(nèi)呈劑量時(shí)間依賴性增加。加入TrkB/Fc后，BV2細(xì)胞中 CD11b、BDNF及上清液中TNF-α表達(dá)水平在一定范圍內(nèi)呈劑量和時(shí)間依賴性降低。加入外源性BDNF后，細(xì)胞內(nèi)CD11b及上清液中TNF-α水平又出現(xiàn)增加。結(jié)論BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化后細(xì)胞內(nèi)BDNF增多，外源性補(bǔ)充BDNF可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，BDNF在小膠質(zhì)細(xì)胞的活化過程中可能發(fā)揮了重要作用。

[關(guān)鍵詞]神經(jīng)病理性疼痛；BV2小膠質(zhì)細(xì)胞；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；腺苷三磷酸；原肌球蛋白相關(guān)激酶B

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)是創(chuàng)傷或者疾病直接累及軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)后導(dǎo)致的疼痛，它可以繼發(fā)于神經(jīng)損傷、惡性腫瘤、糖尿病及缺血性疾病等。指南推薦將三環(huán)類抗抑郁藥、加巴噴丁、普瑞巴林、血清去甲腎上腺素再攝取抑制劑作為一線用藥，阿片類藥物、曲馬多作為二線藥物治療NPP。一項(xiàng)隨機(jī)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，只有不到50%的患者疼痛控制滿意[1]。目前NPP的發(fā)生、發(fā)展及潛在調(diào)控的具體機(jī)制尚不明確。大量研究證實(shí)，NPP的與小膠質(zhì)細(xì)胞活化有密切關(guān)系[2-5]。Trang等[6]發(fā)現(xiàn)在離體培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞中腺苷三磷酸(ATP)可通過P2X4 受體激活小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)合成和釋放，并且 BDNF的合成和釋放是Ca2+和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)依賴的。Zhou等[7]向SD大鼠鞘內(nèi)注射BDNF可通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞引起長時(shí)程增強(qiáng)和機(jī)械高敏。所以，離體條件下，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可以釋放BDNF促進(jìn)NPP的產(chǎn)生，且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用BDNF同樣能促進(jìn)疼痛發(fā)生。體內(nèi)條件BDNF來源廣泛，神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均可合成分泌[8-9]。關(guān)于離體條件下BDNF直接作用于小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞自身發(fā)生何種變化仍然缺乏實(shí)驗(yàn)研究。本研究通過設(shè)計(jì)一系列離體實(shí)驗(yàn)，外源加入BDNF模擬小膠質(zhì)細(xì)胞分泌過程，探討在小膠質(zhì)細(xì)胞來源的BDNF和小膠質(zhì)細(xì)胞活化之間是否存在一定的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，從而促進(jìn)NPP的發(fā)生、發(fā)展。

1材料與方法

1.1主要材料與儀器BV2鼠源性小膠質(zhì)細(xì)胞株購自中科院細(xì)胞資源中心，原肌球蛋白相關(guān)激酶B Fc片段(tropomyosin-related kinase B/Fc，TrkB/Fc)購自美國安迪生科技公司， ATP購自美國Sigma公司；一抗:兔抗鼠BDNF 多克隆抗體、兔抗鼠CD11b多克隆抗體購自美國 Santa公司，抗α微管蛋白α-Tubulin、抗磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH購自美國Santa Cruz公司；二抗:辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、碳酸鹽緩沖液購自美國 Santa公司，胎牛血清、伊格爾培養(yǎng)基DMEM購自美國Gibco公司，十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、BCA 蛋白濃度檢測試劑盒購自南京碧云天公司，Tween 20、TBS購自Sigma公司，PVDF 膜購自美國Millipore 公司，脫脂奶粉購自上海光明乳業(yè)有限公司，免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑ECL購自美國 Santa Cruz 公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞復(fù)蘇從液氮罐中取出凍存BV2細(xì)胞的涼融管，直接放入37 ℃的水中水浴，快速解凍，當(dāng)細(xì)胞完全解凍時(shí)，將液體移入離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入新鮮培養(yǎng)液DMEM，重懸細(xì)胞，移入培養(yǎng)瓶中，37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)箱孵育。細(xì)胞傳代：吸棄培養(yǎng)瓶內(nèi)的DMEM，用PBS液清洗2次，然后加入1 mL 0.25%～0.02% EDTA-Trypsin，消化2～5 min，倒置顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，用吸管輕輕吹打細(xì)胞，加入離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入DMEM，用吸管吹打至細(xì)胞混勻，移入培養(yǎng)瓶中，通常按1∶4進(jìn)行傳代。

1.2.2檢測ATP對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響B(tài)V2細(xì)胞以相應(yīng)密度接種入6孔培養(yǎng)板，貼壁24 h后，進(jìn)行各種藥物處理。采用ATP(0、10、50、500、1 000 μmol/L)處理，用蛋白免疫印跡測量BV2細(xì)胞中的CD11b、BDNF水平，用ELISA測量上清液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。用500 μmol/L ATP 處理BV2細(xì)胞，于加入前及加入后15、60、120 min時(shí)用同樣方法測定上述參數(shù)。觀察不同劑量ATP對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響及最佳作用劑量，并觀察500 μmol/L ATP不同作用時(shí)間對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響。

1.2.3檢測TrkB/Fc對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響采用對(duì)照組、ATP組、TrkB/Fc、ATP+TrkB/Fc 1 μg、ATP+TrkB/Fc 5 μg、ATP+TrkB/Fc 10 μg處理60 min，其中ATP濃度為500 μmol/L，TrkB/Fc應(yīng)加入培養(yǎng)孔中預(yù)先孵育。測定BV2細(xì)胞中的CD11b、BDNF及上清液中TNF-α水平。用ATP+TrkB/Fc 10 μg處理BV2細(xì)胞，于加入前及加入后15、60、120 min時(shí)用同樣方法測定上述參數(shù)。觀察不同劑量TrkB/Fc對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響及最佳作用劑量，并觀察ATP+TrkB/Fc 10 μg不同作用時(shí)間對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響。

1.2.4檢測BDNF對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響采用空白對(duì)照組及BDNF 1、10、100 ng 3個(gè)劑量組。測定BV2細(xì)胞中的CD11b及上清液中TNF-α水平。用BDNF處理BV2細(xì)胞，于加入前及加入后15、60、120 min時(shí)用同樣方法測定上述參數(shù)。觀察不同劑量BDNF對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響及最佳作用劑量，并觀察BFNF 10 ng不同作用時(shí)間對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響。

1.2.5蛋白免疫印跡將上樣液于10 %SDS-PAGE上進(jìn)行電泳分離后，蛋白半干轉(zhuǎn)入PVDF硝酸纖維膜上，將PVDF膜浸入含5%的脫脂奶粉的TBST封閉液中，置于水平搖床上，室溫封閉2 h。用TBST配制一抗兔抗鼠BDNF單克隆抗體(工作濃度為1∶200)、CD11b單克隆抗體(工作濃度為1∶200)、抗α-Tubulin(工作濃度為1∶1 000)、抗GAPDH(工作濃度為1∶1 000)于4 ℃孵育18 h 后TBST清洗3次，每次5 min，再用TBST配制二抗辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(工作濃度為1∶5 000，)37 ℃孵育2 h。然后用TBST清洗3次，每次5 min。用ECL試劑盒的A液和B液各0.5 mL，混勻后與膜于室溫下作用60 s，置膜片于二層保鮮膜之間，將膜片吸附蛋白面朝上，置于X光片盒中，暗室曝光。蛋白表達(dá)水平以目的蛋白與內(nèi)參灰度比值表示。CD11b以為α-Tubulin內(nèi)參，BDNF以GAPDH內(nèi)參。

1.2.6ELISA將上清液加入酶標(biāo)包被板孔，分別設(shè)空白孔、待測樣品孔，在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL(樣品最終稀釋度為5倍)。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部時(shí)盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外。再次按上述方法溫浴，洗滌。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。以空白空調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(A值)。測定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行。

2結(jié)果

2.1ATP對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響ATP可以劑量和時(shí)間依賴性激活小膠質(zhì)細(xì)胞，與對(duì)照組比較，CD11b隨ATP劑量的增加而增加(P<0.01)，在500 μmol/L時(shí)CD11b分泌達(dá)高峰。用500 μmol/L等劑量的ATP孵育小膠質(zhì)細(xì)胞，隨時(shí)間的增加，CD11b表達(dá)逐漸增加(P<0.01)，在120 min時(shí)CD11b分泌達(dá)到高峰；與對(duì)照組比較，ATP增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α的釋放呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系(P<0.05)，見圖1。在ATP激活小膠質(zhì)細(xì)胞過程時(shí)BDNF水平增加，與對(duì)照組比較，BDNF隨ATP劑量的增加而合成增多(P<0.01)，在劑量為500 μmol/L時(shí)合成達(dá)高峰。用500 μmol/L等劑量的ATP孵育小膠質(zhì)細(xì)胞，隨時(shí)間的增加，BDNF表達(dá)逐漸增加(P<0.01)，在60 min時(shí)BDNF表達(dá)達(dá)到高峰，見圖2。

2.2TrkB/Fc對(duì)ATP與小膠質(zhì)細(xì)胞的影響B(tài)DNF抑制劑TrkB/Fc，可以抑制ATP對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化能力。CD11b隨ATP劑量的增加而減少(P<0.05)。用10 μg等劑量的TrkB/Fc孵育小膠質(zhì)細(xì)胞，隨時(shí)間的增加，CD11b表達(dá)逐漸減少(P<0.05)；BDNF隨TrkB/Fc劑量增加而合成減少(P<0.05)，在劑量為10 μmol/L時(shí)合成被抑制最強(qiáng)。用10 μmol/L的TrkB/Fc孵育小膠質(zhì)細(xì)胞，隨時(shí)間的增加，BDNF表達(dá)逐漸減少(P<0.05)；TrkB/Fc抑制小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α的釋放呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系(P<0.05)，見圖3。

2.3BDNF對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響加入外源性BDNF，同樣可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞，與對(duì)照組比較，CD11b隨BDNF劑量的增加而增加(P<0.01)，用100 ng等劑量的BDNF孵育小膠質(zhì)細(xì)胞，隨時(shí)間的增加，CD11b表達(dá)逐漸增加(P<0.01)；TrkB/Fc抑制小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α的釋放呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系(P<0.05)，見圖4。

1:對(duì)照組；2：ATP 10 μmol/L組；3：ATP 50 μmol/L組；4：ATP 100 μmol/L組；5：ATP 500 μmol/L組；6：ATP 1 000 μmol/L組；Ⅰ:ATP 15 min;Ⅱ:ATP 60 min;Ⅲ:ATP 120 min。A、B：BV2小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi) CD11b及內(nèi)參α-tubulin在不同劑量ATP下和不同作用時(shí)間的Western blot條帶；C、D：以CD11b和內(nèi)參α-tubulin的比值量化CD11b在不同劑量ATP下和不同作用時(shí)間表達(dá)的變化；E、F：TNF-α在不同ATP劑量下和不同作用時(shí)間分泌的變化；a：P<0.01，b：P<0.05，與對(duì)照組比較。

1:對(duì)照組；2：ATP 10 μmol/L組；3：ATP 50 μmol/L組；4：ATP 100 μmol/L組；5：ATP 500 μmol/L組；6：ATP 1 000 μmol/L組；Ⅰ:ATP 15 min;Ⅱ:ATP 60 min;Ⅲ:ATP 120 min。A、B：BV2小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)BDNF及內(nèi)參GAPDH在不同ATP劑量下和不同作用時(shí)間的蛋白印記條帶；C、D：以BDNF和內(nèi)參GAPDH的比值量化BDNF在不同ATP劑量下和不同作用時(shí)間表達(dá)的變化；a：P<0.01，與對(duì)照組比較。

1:對(duì)照組；2：ATP組；3：TrkB/FC組；4：ATP+TrkB/FC 1 μg組；5：ATP+TrkB/FC 5 μg組；6：ATP+TrkB/FC 10 μg組；Ⅰ:ATP+FC 15 min;Ⅱ:ATP+FC 60 min;Ⅲ:ATP+FC 120 min。A、B：BV2小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)CD11b及內(nèi)參α-tubulin在不同劑量Trkb/Fc下和不同作用時(shí)間的Western blot條帶；C、D： BV2小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)BDNF及內(nèi)參GAPDH在不同Trkb/Fc劑量下和不同作用時(shí)間的蛋白印記條帶；E、F：以CD11b和內(nèi)參α-tubulin的比值量化CD11b在不同劑量Trkb/Fc下和不同作用時(shí)間表達(dá)的變化；G、H：TNF-α在不同劑量TRkb/Fc下和不同作用時(shí)間分泌的變化；I、J：以BDNF和內(nèi)參GAPDH的比值量化BDNF在不同Trkb/Fc劑量下和不同作用時(shí)間分泌的變化；a：P<0.01，b：P<0.01，與對(duì)照組比較；c：P<0.05，與ATP組比較。

1:對(duì)照組；2：BDNF 1 ng組；3：BDNF 10 ng組；4：BDNF 100 ng組；Ⅰ:BDNF 15 min;Ⅱ:BDNF 60 min;Ⅲ:BDNF 120 min。A、B：BV2小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)CD11b及內(nèi)參α-tubulin在不同劑量BDNF下和不同作用時(shí)間的Western blot條帶；C、D：以CD11b和內(nèi)參α-tubulin的比值量化CD11b在不同劑量BDNF下和不同作用時(shí)間表達(dá)的變化；E、F：TNF-α在不同劑量BDNF下和不同作用時(shí)間分泌的變化；a：P<0.01，b：P<0.05，與對(duì)照組比較。

3討論

大量研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞在NPP的起始和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用[2-5]。小膠質(zhì)細(xì)胞激活后上調(diào)細(xì)胞表面受體分子、增強(qiáng)促炎細(xì)胞因子釋放等，如CD11b[10]、TNF-α[11-12]、前列腺素及白細(xì)胞介素等，從而調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)興奮性。研究發(fā)現(xiàn)許多炎癥因子有增強(qiáng)突觸間遞質(zhì)的信號(hào)傳遞，并促發(fā)突觸后神經(jīng)元的敏化的作用[13-14]。BDNF 是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的一員，它不僅促進(jìn)神經(jīng)元的生長和分化，還可以作為神經(jīng)調(diào)質(zhì)調(diào)控神經(jīng)元興奮性、突觸可塑性在NPP中發(fā)揮重要的作用[15-17]。Chen 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，BDNF能否增強(qiáng)初級(jí)傳入纖維末端NMDA受體作用，增強(qiáng)初級(jí)傳入纖維和脊髓神經(jīng)元之間的突觸傳遞。在一些病理過程中正反饋機(jī)制往往發(fā)揮重要作用，但是對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞合成的BDNF能否具有自分泌刺激因子功能的研究仍然缺乏。因此，本研究進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)來確認(rèn)小膠質(zhì)來源的BDNF是否能夠進(jìn)一步通過自分泌行為加強(qiáng)自身活化。通過實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)ATP可以激活BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞，使其表面標(biāo)志分子CD11b上調(diào)，TNF-α分泌增多，并且在活化時(shí)發(fā)現(xiàn)BDNF的合成增多。加入BDNF清除劑清除TrkB/Fc后，ATP對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化能力減弱，CD11b表達(dá)減少，合成BDNF減少， TNF-α分泌也減少。補(bǔ)充外源性BDNF，小膠質(zhì)細(xì)胞再次出現(xiàn)活化，CD11b合成增加，TNF-α的釋放增加。因此，本研究推測BDNF可能作為一種自分泌激活物在進(jìn)一步促進(jìn)在小膠質(zhì)細(xì)胞過程中扮演著重要作用。雖然它在NPP中的詳細(xì)作用機(jī)制仍需未來進(jìn)行更深入的研究，但是本研究推測在疼痛藥物開發(fā)中，將BDNF作為特定靶點(diǎn)可能有助于研發(fā)出止痛新藥。隨著對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞功能認(rèn)識(shí)的不斷深化，也必將為治療NPP這一困擾人類健康的難題提供更多的藥物靶點(diǎn)和干預(yù)措施。

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Effect of brain-derived neurotrophic factor on BV2 microglia activated by ATP

JinHaixiang,WuZhouhao

(DepartmentofAnesthesiology,HainingMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,Haining,Zhejiang314400,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in the process of adenosine triphosphate (ATP) activating BV2 microglia.MethodsBV2 microglia was cultured by adding different concentrations of ATP.Then the expression level of intracellular CD11b and BDNF and the secretion level of TNF-α in the supernatant were quantitatively determined by Western blot.BV2 microglia was treated by different concentrations of BDNF scavenger tyrosine kinase receptors B (TrkB)/Fc and incubated by ATP.The expression level of intracellular CD11b and BDNF and the secretion level of TNF-α in the supernatant were measured.Finally adding exogenous recombinant BDNF into cultured BV2 microglia,intracellular changes of CD11b and supernatant TNF-α levels were detected.ResultsAfter adding ATP for cultivating BV2 microglia,intracellular CD11b and BDNF expression levels and supernatant TNF-α level were increased with a dose- and time-dependent manner in some ranges.After adding TrkB/Fc,the levels of intracellular CD11b and BDNF expression and supernatant TNF-α level were decreased with a dose-and time-dependent manner in some range.CD11b and BDNF expression levels was decreased in a dose- and time-dependent manner.Adding exogenous BDNF,the levels of intracellular CD11b and BDNF expression and supernatant TNF-α level were increased again.ConclusionIntracellular BDNF expression is increased when BV2 microglia is activated and replenishing exogenous BDNF can activate microglia.Therefore BDNF may play an important role in the microglia activation process.

[Key words]neuropathic pain;BV2 microglia;brain-derived neurotrophic factor;adenosine triphosphate;tyrosine kinase receptor B

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.18.006

作者簡介：金海祥(1975-)，副主任醫(yī)師，本科，主要從事麻醉和疼痛的基礎(chǔ)與臨床研究。

[中圖分類號(hào)]R338.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)18-2467-04

(收稿日期：2015-12-05修回日期：2016-03-16)