李　喆，盧一郡，呂立文，盧國(guó)浩，李　衛(wèi)，俞　寧，盧俊宇

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院急診科，南寧 530021)

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丙泊酚預(yù)處理對(duì)大鼠肢體缺血再灌注損傷的影響

李喆，盧一郡，呂立文，盧國(guó)浩，李衛(wèi)，俞寧，盧俊宇

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院急診科，南寧 530021)

[摘要]目的觀察丙泊酚對(duì)大鼠肢體缺血再灌注損傷的影響。方法選擇健康成年雄性SD大鼠60只，分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、丙泊酚藥物組，每組20只，各組又根據(jù)再灌注時(shí)間分成4個(gè)亞組。復(fù)制大鼠經(jīng)典右下肢缺血再灌注模型，恢復(fù)血流灌注前5 min用丙泊酚注射液(50 mg/kg，腹腔注射)處理，分別于再灌注后3、6、9、12 h進(jìn)行取材，檢測(cè)血清樣本中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、核因子κB(NF-κB)水平、肌肉組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的水平，以及計(jì)算肌肉濕干質(zhì)量比值。結(jié)果恢復(fù)灌注后各時(shí)間段內(nèi)，相對(duì)于缺血再灌注組，丙泊酚處理后能降低TNF-α、NF-κB的表達(dá)水平(P<0.05)，抑制組織MDA水平增加(P<0.05)，抑制SOD水平的減少(P<0.05)，也明顯減輕肌肉組織的水腫(P<0.05)。結(jié)論丙泊酚預(yù)處理可通過(guò)遏制炎癥因子表達(dá)、減輕氧自由基損害從而對(duì)缺血再灌注肢體具有保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]丙泊酚；肢體；缺血再灌注損傷；炎癥因子；氧自由基

肢體缺血這一病理現(xiàn)象常見(jiàn)于肢體大血管損傷、血栓再通、斷肢再植、止血帶使用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等，恢復(fù)缺血肢體血流再灌注后，肢體的細(xì)胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞并未減輕反而加重，這種血液再灌注使缺血性損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象稱(chēng)為缺血/再灌注損傷[1](ischemia-reperfusion injury，IRI)，其發(fā)生、發(fā)展主要與炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)的損傷機(jī)制相關(guān)[2]。丙泊酚是臨床常用的靜脈麻醉藥，近年來(lái)研究表明其對(duì)有一定的保護(hù)作用[3-4]。本研究采用大鼠肢體缺血-再灌注(IR)模型，觀察丙泊酚對(duì)缺血肢體的保護(hù)作用，并從炎性因子、氧自由基等方面探討其作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料選擇健康成年雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～230 g。分為3組：假手術(shù)組(C組，20只)、缺血再灌注組(IR組，20只)、丙泊酚干預(yù)組(P組，20只)，每組20只，各組根據(jù)恢復(fù)組織再灌注時(shí)間不同分為3、6、9、12 h共4個(gè)亞組，每亞組5只。

1.2主要試劑與儀器大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(96T)、大鼠核因子κB(NF-κB)ELISA試劑盒(96T)均購(gòu)自美國(guó)R&D公司，進(jìn)口分裝。丙二醛(MDA)測(cè)試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒由南京建成生物工程研究所提供。丙泊酚由AstraZeneca公司提供。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物模型制備各組大鼠術(shù)前12 h禁食，自由飲水。予3%戊巴比妥鈉(首劑40 mg/kg，維持量20 mg/kg)腹腔注射，麻醉成功后行仰臥位固定。IR組：常規(guī)備皮后，于右腹股溝處沿血管走向縱行切開(kāi)皮膚、皮下組織，并鈍性分離縫匠肌后部，游離股動(dòng)靜脈和股神經(jīng)。用微血管夾分別將股動(dòng)靜脈夾閉，阻斷血流，并用張力帶于股鞘下環(huán)扎肢體，以阻斷側(cè)支循環(huán)。肢體缺血2 h后，在除去微血管夾及張力帶即恢復(fù)血流灌注前5 min，腹腔注射生理鹽水1 mL，隨即除去微血管夾及張力帶，恢復(fù)血流灌注。C組：游離出股動(dòng)靜脈后，不上微血管夾和張力帶，即不阻斷血流，余操作同IR組。P組：肢體缺血2 h后，在除去微血管夾及張力帶即恢復(fù)血流灌注前5 min，腹腔注射丙泊酚注射液(50 mg/kg)，余操作同IR組。

1.3.2動(dòng)物處理及采集標(biāo)本各組大鼠經(jīng)上述不同處理后，按所在亞組要求，分別在恢復(fù)血流再灌注3、6、9、12 h后再次行腹腔麻醉并固定，迅速開(kāi)腹分離出下腔靜脈后抽取血樣3 mL，注入抗凝管內(nèi)封存。所取血液靜置1 h后以3 000 r/min離心10 min，提取血清標(biāo)本，注入EP管后-70 ℃保存。游離右下肢腓腸肌上下兩端，組織剪斷離后，分成2段，其中1段置入甲醛溶液固定，備用于肌肉組織勻漿液的制備，另1段直接稱(chēng)取濕質(zhì)量，并記錄數(shù)值。

1.3.3血漿標(biāo)本檢測(cè)采用雙抗體夾心ELISA測(cè)定，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔吸光度(A)值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各血清樣本中TNF-α、NF-κB的水平。具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒(美國(guó)R&D公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.4肌肉標(biāo)本檢測(cè)稱(chēng)取100 mg肌肉組織，加入0.9 mL生理鹽水制成10%的組織勻漿，分別采用硫代巴比妥酸(TPA)法及黃嘌呤氧化酶法，檢測(cè)肌肉組織中MDA的水平，以及SOD的活性。嚴(yán)格按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.5組織濕/干質(zhì)量比各組大鼠右下肢肌肉取材并稱(chēng)取濕質(zhì)量后，分別記錄好數(shù)值。然后置于55 ℃恒溫箱中烤干至恒重，即為干質(zhì)量，分別記錄好干質(zhì)量數(shù)值。計(jì)算出濕質(zhì)量與干質(zhì)量的比值，以此反映肌肉組織的水腫程度。

2結(jié)果

2.1各組血清TNF-α、NF-κB的表達(dá)TNF-α組間比較：與C組相比，IR組水平在再灌注后6、9、12 h這3個(gè)時(shí)點(diǎn)均顯著升高(P<0.05)；P組水平在再灌注后6、12 h這兩個(gè)時(shí)點(diǎn)有升高(P<0.05)。與IR組相比，P組水平在4個(gè)時(shí)點(diǎn)的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。TNF-α組內(nèi)比較：C組各時(shí)點(diǎn)水平間無(wú)明顯差異；IR組水平自再灌注后3 h開(kāi)始升高，至9 h達(dá)高峰，12 h后有下降；P組水平則是再灌注后6 h及12 h偏高，變化無(wú)明顯規(guī)律，見(jiàn)表1。

NF-κB組間比較：與C組相比，IR組水平在再灌注后4個(gè)時(shí)點(diǎn)均顯著升高(P<0.05)。與IR組相比，P組水平在再灌注后9、12 h均顯著降低(P<0.05)。NF-κB組內(nèi)比較：C組水平再灌注后4個(gè)時(shí)點(diǎn)均無(wú)明顯差異；IR組水平自再灌注后3 h開(kāi)始升高，至12 h達(dá)高峰；P組水平再灌注后4個(gè)時(shí)點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表1各組大鼠血清中TNF-α水平變化

組別3h6h9h12hC組119.14±16.93123.07±17.70b121.48±15.99b127.13±17.46bIR組124.31±22.13213.21±49.49ac215.85±59.67ac192.00±34.69acP組115.15±29.71b156.92±17.31ab114.75±39.26b146.03±17.41ab

a：P<0．05,與C組比較;b：P<0．05,與IR組比較;c：P<0．05,與IR 3 h組比較。

表2各組大鼠血清中NF-κB水平變化

組別3h6h9h12hC組195.62±24.01207.23±17.68204.22±25.24213.10±31.54IR組319.53±37.98a365.56±54.43ac398.30±50.58ac544.41±62.51acdP組369.00±33.80348.43±45.63221.04±37.73b339.15±39.23b

a：P<0．05,與C組比較;b：P<0．05,與IR組比較;c：P<0．05,與IR 3 h組比較;d：P<0．05,與IR 9 h組比較。

2.2各組肌肉組織MDA、SOD表達(dá)變化各時(shí)間點(diǎn)IR組中MDA的水平均明顯高于C組及P組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而IR組SOD活性則顯著低于C組與P組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組內(nèi)不同時(shí)點(diǎn)MDA與SOD變化水平均無(wú)明顯規(guī)律，見(jiàn)表3、4。

表3　各組大鼠腓腸肌MDA水平變化

a：P<0．05,與IR組比較。

表4　各組大鼠腓腸肌SOD活性變化

a：P<0．05,與IR組比較。

2.3各組大鼠右下肢肌肉組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量同時(shí)點(diǎn)間比較，IR組各時(shí)段濕質(zhì)量/干質(zhì)量均顯著高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；P組則顯著低于IR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組組內(nèi)不同時(shí)點(diǎn)比較，濕質(zhì)量/干質(zhì)量隨時(shí)間變化有一定上升趨勢(shì)，見(jiàn)表5。

表5　各組大鼠腓腸肌濕質(zhì)量/干質(zhì)量比值

a：P<0．05,與C組比較；b：P<0.05,與IR組比較。

3討論

肢體缺血在臨床中十分常見(jiàn)，肢體IRI這一病理生理過(guò)程的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，目前認(rèn)為主要有炎癥因子反應(yīng)學(xué)說(shuō)及氧自由基損傷學(xué)說(shuō)兩種[5-6]。肢體IRI能夠引起NF-κB的活化，使NF-κB的表達(dá)量顯著增加[7]，NF-κB的激活可增強(qiáng)TNF-α基因轉(zhuǎn)錄，使其水平升高。TNF-α是機(jī)體重要的炎性因子[8]，廣泛參與應(yīng)激、感染及IRI等過(guò)程和調(diào)控，其水平異常升高可直接作用于細(xì)胞，使組織細(xì)胞溶解[9]，還可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的變化，使其功能受損，破壞凝血機(jī)制，形成血栓，從而進(jìn)一步加重遠(yuǎn)端骨骼肌的水腫。IRI時(shí)可通過(guò)線粒體、白細(xì)胞及花生四烯酸等產(chǎn)生大量氧自由基[10]，氧自由基能夠直接損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，而產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)破壞細(xì)胞[11]。MDA[12]是自由基連鎖反應(yīng)-脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，可間接反映機(jī)體組織受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度；SOD是生命體的活性物質(zhì)，能夠還原過(guò)氧化物，減少活性氧簇的產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞不受氧自由基損傷，反映了機(jī)體清除氧自由基的能力[13]。

本研究通過(guò)復(fù)制大鼠肢體IRI模型，通過(guò)觀察上述4個(gè)指標(biāo)在再灌注后多個(gè)時(shí)點(diǎn)的變化，結(jié)果證明，IR組各時(shí)段NF-κB的水平均高于C組，提示肢體在恢復(fù)血流灌注3 h內(nèi)，NF-κB已被激活，其升高促進(jìn)TNF-α的表達(dá)，后者在再灌注6 h左右開(kāi)始升高，并持續(xù)至恢復(fù)血流灌注12 h；而氧自由基爆發(fā)引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使得組織MDA水平在再灌注6 h左右開(kāi)始升高，到12 h也未下降。另一方面，骨骼肌的濕質(zhì)量/干質(zhì)量也客觀反映了肌肉的水腫程度，IR組各時(shí)段肌肉濕質(zhì)量/干質(zhì)量均高于C組。丙泊酚作為臨床常用麻醉藥物，眾多實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)肢體及多臟器的IRI具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中，P組大鼠血清NF-κB、TNF-α的表達(dá)，與IR組比較，在再灌注各時(shí)段均有不同程度的下降，提示藥物對(duì)炎性因子的釋放存在抑制作用；其次，與IR組相比，P組中MDA的水平較低，而SOD的表達(dá)則較IR組升高，提示丙泊酚能夠降低IRI后肌肉組織MDA水平，并增強(qiáng)SOD活性，表明丙泊酚可有效抑制IRI損傷所導(dǎo)致的氧自由基爆發(fā)效應(yīng)，清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)；此外，對(duì)比肌肉組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量，說(shuō)明丙泊酚組骨骼肌組織較IRI組水腫程度有所減輕。

綜上所述，丙泊酚對(duì)IRI損傷的肢體具有保護(hù)作用，與其能遏制炎癥因子表達(dá)、減輕氧自由基損害有關(guān)。但是，IRI損傷是一個(gè)多因素、多機(jī)制、多途徑綜合作用的結(jié)果，臨床治療應(yīng)更具針對(duì)性。本研究證實(shí)了丙泊酚對(duì)肢體IRI損傷防治的有效性，有關(guān)藥物的劑量及用藥的時(shí)間還需細(xì)化與更進(jìn)一步探討。

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Protective effect of propofol preconditioning on limb ischemia reperfusion injury in rats

Li Zhe,Lu Yijun,Lyu Liwen,Lu Guohao,Li Wei,Yu Ning,Lu Junyu

(DepartmentofEmergency,thePeople′sHospitalofGuangxiZhuangAutonomusRegion,Nanning,GuangxiZhuangAutonomusRegion530021,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of propofol on rat′s limb ischemia reperfusion injury.MethodsSixty healthy SD rats were randomly divided into sham operate group,ischemia-reperfusion group and propofol group (n=20),each group was divided into 4 subgroups according to the different reperfusion time.To copy the right lower limb ischemia reperfusion model,5 min before reperfusion,use propofol injection (50 mg/kg,intraperitoneal inject),various subjects in the corresponding time points (3,6,9,12 h) were sacrificed.TNF-α,NF-κB of blood and MDA,SOD of Skeletal muscle were measured,calculate muscle wet dry weight ratio.ResultsCompared with ischemia reperfusion group,propofol could significantly reduce expression of TNF-alpha,NF-κB levels in serum (P<0.05),inhibit the increase of the MDA level and decrease of the SOD level in muscle (P<0.05),also reduce the extent of skeletal muscle cell edema(P<0.05).ConclusionPropofol can attenuate limb ischemia reperfusion injury by inhibiting inflammation response and reducing the oxygen free radicals′ damage.

[Key words]propofol;limb;ischemia-reperfusion injury;inflammatory factor;oxygen free radicals

作者簡(jiǎn)介：李喆(1984-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事急危重癥醫(yī)學(xué)研究。

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.010

[中圖分類(lèi)號(hào)]R459.7

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)17-2337-03

(收稿日期：2015-12-23修回日期：2016-02-26)