劉青青，任劍波，沈才洪，王松濤，喻學(xué)淳，曹振華，敖宗華（.四川理工學(xué)院，四川自貢64000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000；.瀘州老窖養(yǎng)生酒業(yè)有限責(zé)任公司，四川瀘州646000；4.國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州646000）

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濃香型大曲中一株產(chǎn)Monacolin K紅曲菌株篩選及鑒定

劉青青1，任劍波2，4，沈才洪2，4，王松濤3，4，喻學(xué)淳3，曹振華1，敖宗華2，4
（1.四川理工學(xué)院，四川自貢643000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000；3.瀘州老窖養(yǎng)生酒業(yè)有限責(zé)任公司，四川瀘州646000；4.國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州646000）

摘要：為獲得產(chǎn)Monacolin K紅曲菌株，對(duì)10個(gè)不同來源的濃香型大曲樣品進(jìn)行分離純化，共收集到18株紅曲菌株。通過薄層層析法初篩及高效液相色譜法復(fù)篩，得到1株產(chǎn)Monacolin K菌株MY1，通過對(duì)其形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，判斷MY1為紫色紅曲菌（Monascus purpureus）。

關(guān)鍵詞：微生物；紅曲菌；Monacolin K；篩選；鑒定

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-03-04；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160304.1439.007.html。

紅曲菌（Monascus），在生物學(xué)的分類上屬真菌界，子囊菌門，真子囊菌綱，散子囊菌目，紅曲菌科，紅曲菌屬。紅曲泛指紅曲菌在蒸煮的米飯上發(fā)酵而成的紫紅色產(chǎn)品。在我國(guó)自宋朝以來都有廣泛應(yīng)用，宋初《清異錄》中即有“以紅曲煮肉”的記載［1］?！侗静菥V目》中則記載紅曲能“消食活血，健脾燥胃、治赤白痢下水谷。釀酒，破血行藥勢(shì)”［2］。

紅曲中富含生物活性成分，其中以天然色素和降血脂成分Monacolin K應(yīng)用最廣泛［3］。自1976年日本學(xué)者遠(yuǎn)藤章從紅色紅曲霉發(fā)酵液中首次分離出高活性HM g-CoA還原酶抑制劑Monacolin K，發(fā)現(xiàn)其不但可作為降脂藥物，還具有抑制腫瘤的功效以來，國(guó)內(nèi)外科研工作者對(duì)紅曲藥用價(jià)值進(jìn)行了大量研究［4］。目前，在歐美Lovastatin（即Monacolin K）已成為治療高血脂癥的首選藥物之一。我國(guó)北大維信的血脂康膠囊和成都地奧的脂必妥片都是以功能性紅曲（產(chǎn)品中Monacolin K超過0.4%的紅曲）為原料制成的膠囊和片劑，目前功能性紅曲在市場(chǎng)降血脂產(chǎn)品中有37.2%的占有率［5］。

據(jù)報(bào)道，瀘州老窖國(guó)窖大曲曲坯各層中均勻分布著紅曲霉［6］。為篩選得到產(chǎn)Monacolin K的紅曲菌株，進(jìn)一步開發(fā)利用濃香型大曲中有利資源，本次實(shí)驗(yàn)以瀘州老窖濃香型大曲為樣品，通過選擇培養(yǎng)基分離、純化，薄層層析法初篩和高效液相色譜法復(fù)篩，得到1株產(chǎn)Monacolin K的紅曲菌株MY1。通過對(duì)其個(gè)體形態(tài)及菌落形態(tài)進(jìn)行描述和鑒定，并提取其總DNA，利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行輔助鑒定，判定MY1為紫色紅曲菌。以期為濃香型大曲中有益微生物的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種篩選樣品

本次實(shí)驗(yàn)樣品主要選取瀘州老窖制曲車間堆積發(fā)酵過程中出現(xiàn)明顯紅色部位的大曲，共10個(gè)不同樣品。

1.1.2試劑及儀器設(shè)備

主要試劑：麥芽浸粉、葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、土豆、硫酸鎂、硫酸鋅、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀、鏈霉素、過氧膽酸鈉、乳酸、無水乙醇、瓊脂粉、氯仿、環(huán)己烷、異丙醇、甲醇、磷酸等，其中，除甲醇為色譜純外其余均為分析純；蛋白胨、麥芽浸粉為生化試劑；Lovastatin標(biāo)準(zhǔn)品（瑞士Sigma公司）；真菌試劑盒（Omega）；PCR產(chǎn)物純化試劑盒（杰瑞生物工程（上海）有限公司）等。

主要儀器：分析天平、立式高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、烘干箱、離心機(jī)、凝膠成像儀、紫外分光光度計(jì)、高效液相色譜儀等。

1.1.3培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽浸粉130 g（加水至1000 mL煮沸）、瓊脂粉18 g，乳酸調(diào)pH6.0，滅菌備用。

PDA培養(yǎng)基：200 g土豆洗凈去皮，切成小塊，加水1000 mL，煮至爛熟，8層紗布過濾，濾液定容至1000 mL，加入葡萄糖20 g，乳酸調(diào)pH6.0，滅菌備用。

察氏培養(yǎng)基：蔗糖20 g，NaNO33 g、MgSO40.5 g、KCl 0.5 g、FeSO40.01 g、K2HPO41 g、瓊脂18 g，加水至1000 mL，乳酸調(diào)pH 6.0，滅菌備用。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖60 g、蛋白胨25 g、MgSO41 g、NaNO32g、K2HPO41g、麥芽浸粉10g，加水至1000mL，乳酸調(diào)pH6.0，滅菌備用。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖60 g、秈米米粉20 g、Na-NO34 g、KH2PO43 g、MgSO41 g，加水至1000 mL，乳酸調(diào)pH 6.0，滅菌備用。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1紅曲菌菌株篩選及純化

將中高溫大曲曲心處有粉紅色菌落的部位分別粉碎，各加入稍淹沒曲粉的無菌水，于30℃條件下恒溫培養(yǎng)1 h，即成菌懸液。用無菌水將各菌懸液依次稀釋至10-1～10-7共7個(gè)梯度，分別涂布在改良麥芽汁培養(yǎng)基平板上［7-8］。30℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，挑取具有紅曲菌基本形態(tài)特征菌落，轉(zhuǎn)接到改良麥芽汁培養(yǎng)基斜面相同培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)，采用繼代分離純化法進(jìn)行純化培養(yǎng)［9］。

1.2.2產(chǎn)Monacolin K菌株的篩選

發(fā)酵液的制備：將分離純化培養(yǎng)得到的菌株，轉(zhuǎn)接至麥芽汁培養(yǎng)基斜面30℃培養(yǎng)5 d，取菌體制成孢子懸液，按6%接種量接種至液體種子培養(yǎng)基中，以200 r/min、30℃培養(yǎng)48～72 h，至種子液出現(xiàn)微紅色即可。按5%接種量將種子液接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中（裝液量70 mL/ 250 mL），30℃、150 r/min條件下培養(yǎng)12 d。

發(fā)酵液前處理：取發(fā)酵液1 mL，加5 mL乙酸乙酯，30℃、150 r/min條件下振蕩3 h，離心收集上清液，沉淀以5 mL乙酸乙酯抽提2次，合并上清液，蒸干；以少許苯溶解干燥物，待苯揮發(fā)干后，加入0.2 mL甲醇溶解，即完成發(fā)酵液前處理。

薄層層析法初篩：以硅膠為吸附劑，以環(huán)己烷∶氯仿∶異丙醇（V∶V∶V）=6∶3∶1為展開劑，取發(fā)酵液和Lovastatin標(biāo)準(zhǔn)品（Lovastatin標(biāo)準(zhǔn)品4 mg，0.2 mol/L NaOH溶液定容至100 mL，50℃超聲轉(zhuǎn)化1 h，室溫放置1 h）各10 μL，以10%磷鉬酸為顯色劑，計(jì)算Rf值［10］。

高效液相色譜（HPLC）法復(fù)篩：色譜柱，20 RBA× SB C18，5 μm×150 mm×4.6 mm；柱溫，28℃；紫外檢測(cè)器238 nm檢測(cè)波長(zhǎng)；流動(dòng)相，乙腈∶水=55∶45，磷酸調(diào)pH2.5；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL［11］。

1.2.3菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

個(gè)體形態(tài)鑒定：對(duì)菌株進(jìn)行電鏡掃描，對(duì)比模式菌株電鏡掃描圖像對(duì)篩選菌株進(jìn)行分析。

菌落形態(tài)鑒定：采用點(diǎn)植法分別接種于麥芽汁培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察并記錄各單菌落形態(tài)特征。

1.2.4菌株的分子生物學(xué)鑒定

DNA提取：在無菌條件下，取一定量菌絲加入液氮研磨成粉末后，按真菌試劑盒（Omega）的提取方法提取總DNA。

PCR擴(kuò)增：采用ITS1/ITS4作為真菌引物（ITS1：5'-TCCgTAggTgAACCTgC gg-3'，ITS4：5'-TCCTCCgCTTATTgATATgC-3'），對(duì)分離的菌種的ITS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；95℃變性4 s，53℃退火50 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn)，電壓為12 V/cm，電泳時(shí)間25 min。采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收純化，純化后的PCR產(chǎn)物送至上海生工有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交NCBI進(jìn)行序列比對(duì)，并建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2結(jié)果與分析

2.1紅曲菌篩選結(jié)果

紅曲菌為腐生菌，耐乙醇，嗜酸，極喜乳酸，能在pH值為3.5～6.0范圍生長(zhǎng)，最低能耐pH2.5［12］。相對(duì)于其他微生物，紅曲菌生長(zhǎng)較慢。在平板分離純化過程中易被其他絲狀真菌覆蓋而難以分離純化，因此，本試驗(yàn)中采用改良麥芽汁培養(yǎng)基，即在普通麥芽汁培養(yǎng)基中加入10%無水乙醇，乳酸調(diào)pH5.0，抑制其他微生物的生長(zhǎng)，加入0.3%的去氧膽酸鈉抑制真菌菌絲蔓延，1 mg左右氯菌素使之特異性拮抗放線菌和細(xì)菌［13-14］。對(duì)不同樣品紅曲菌的分離純化，共得到18株紅曲菌，編號(hào)依次為MY1—MY18。

2.2產(chǎn)Monacolin K菌株篩選結(jié)果

用薄層層析法對(duì)得到的24株紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行Monacolin K檢測(cè)，結(jié)果顯示MY1、MY13、MY16共3株菌在薄層層析后有清晰或較清晰斑點(diǎn)，為Monacolin K陽(yáng)性菌株（見表1）。其余菌株發(fā)酵產(chǎn)物在同一薄層板上無與標(biāo)樣相同或相近Rf值的展開斑點(diǎn)。初步判斷除該3株菌外其余菌株不具備產(chǎn)Monacolin K能力。

表1　　Monacolin K陽(yáng)性菌株薄層層析法檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用HPLC法對(duì)3株Monacolin K陽(yáng)性菌株發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，其中僅MY1在14.272 min有吸收峰，與Lovastatin標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間14.260 min相近，其余2株未發(fā)現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)品相近的出峰時(shí)間（詳見圖1、圖2）。綜合薄層層析法和HPLC法的篩選結(jié)果判斷，MY1為1株產(chǎn)Monacolin K的紅曲菌株，Monacolin K含量為0.513mg/mL。

圖1　　 Lovastatin標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖

2.3 MY1菌株的微生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.3.1電鏡掃描結(jié)果

對(duì)MY1進(jìn)行活化培養(yǎng)后，通過電鏡掃描，得到其個(gè)體形態(tài)，詳見圖3。

2.3.2不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征

30℃恒溫培養(yǎng)7 d，MY1在不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)各異，參見表2和圖4、圖5、圖6。

圖2　　 MY1高效液相色譜圖

圖3　 MY1電鏡掃描圖

圖4　 MY1在麥芽汁培養(yǎng)基上菌落形態(tài)

綜合MY1的電鏡掃描個(gè)體形態(tài)與不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征，并與李鐘慶、郭芳編著的《紅曲菌的形態(tài)及分類學(xué)》進(jìn)行對(duì)比，判斷MY1為紅曲菌屬菌株，將結(jié)合分子生物學(xué)方法為輔助鑒定手段，得出最終結(jié)論［12］。

2.4 MY1菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

對(duì)MY1進(jìn)行分子生物學(xué)測(cè)序，用ITS1/ITS4擴(kuò)增其ITS區(qū)全長(zhǎng)，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度500～700 bp，再對(duì)500～700 bp左右PCR產(chǎn)物采用試劑盒對(duì)其進(jìn)行割膠純化。結(jié)果顯示ITS基因序列長(zhǎng)度為558 bp（圖7）。將所得ITS序列分別與genBank中已有序列進(jìn)行比對(duì)，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖8）。

表2　　MY1在不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征

圖5　 MY1在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)

圖6　 MY1在察氏培養(yǎng)基上菌落形態(tài)

圖7　 MY1菌株基因序列圖

根據(jù)分子生物學(xué)輔助鑒定結(jié)果可知，MY1與Monascus purpureus strain同源性最高，相似性為100%。結(jié)合MY1的電鏡掃描圖及在不同培養(yǎng)基上單菌落形態(tài)特征，最終鑒定MY1為紫色紅曲菌。

3結(jié)論與討論

以10個(gè)不同來源的大曲樣品為原料，采用改良麥芽汁培養(yǎng)基分離純化后，在收集到的18株紅曲菌株中，通過薄層層析法初篩及HPLC復(fù)篩，共得到1株產(chǎn)Monacolin K菌株MY1，通過對(duì)其形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，得出MY1的分類學(xué)地位為：真菌界（Eumycophyta），子囊菌門（Ascomycota），真子囊菌綱（Euascomyhcetes），散子囊菌目（Eurtotiales），紅曲菌科（Monascaceae），紅曲菌屬（Monascus），紫色紅曲菌（Monascus purpureus）。

一方面，因紅曲菌代謝產(chǎn)物十分豐富，后續(xù)將對(duì)MY1的γ-氨基丁酸、麥角甾醇、桔霉素等其他代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析檢測(cè)，以期為進(jìn)一步研究紅曲的相關(guān)功效提供依據(jù)。另一方面，MY1產(chǎn)Monacolin K能力與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)介紹的相關(guān)紅曲菌產(chǎn)Monacolin K能力還有一定差距，如Marlia Singgih等［15］對(duì)紅曲菌MFR95固態(tài)發(fā)酵得到Monacolin K含量為1790 μg/g；劉月等［16］得到的紅曲菌F12-11固態(tài)發(fā)酵Monacolin K含量達(dá)8.73 mg/g；Jun Zhang等［17］用紅曲菌9901液態(tài)發(fā)酵得到Monacolin K含量為2026.0 mg/L。后續(xù)將對(duì)MY1紅曲菌發(fā)酵理化條件進(jìn)行優(yōu)化，并充分利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)提高M(jìn)Y1產(chǎn)Monacolin K的能力。

參考文獻(xiàn)：

［1］傅金泉.中國(guó)紅曲及其實(shí)用技術(shù)［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1997：1-2.

［2］李雪梅，沈興海，段震海，等.紅曲生物活性研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)學(xué)，2011，22（12）：2989-2991.

［3］Lin Y L，Wang T H，Lee M H，et al. Biologically active components and nutraceuticals in the Monascus-fermented rice：a review［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2008，77（5）：965-973.

［4］Endo A. Monacolin K，a new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species［J］. The Journal of Antibiotics，1979，32（8）：852-854.

［5］涂志英，邵偉.國(guó)內(nèi)外紅曲的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)［J］.中國(guó)釀

圖8　 MY1系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

造，2008（7）：7-9.

［6］姚萬春，唐玉明，任道群，等.瀘州老窖國(guó)窖曲坯層次間微生物差異研究［J］.釀酒，2005，32（5）：35-37.

［7］李紹亮，李亞鳳，李學(xué)思.釀酒大曲中酯化紅曲的分離及應(yīng)用［J］.釀酒，2014，41（41）：32-38.

［8］王佳麗，韓建榮，趙景榮，等.汾酒大曲中紅曲霉的分離和鑒定［J］.山西大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，32（2）：289-293.

［9］沈萍，陳向東.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］4版.北京：高等教育出版社，2007.

［10］黑利生，周紅杰，秘鳴，等.1株產(chǎn)洛伐他汀紅曲菌的篩選和鑒定［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（6）：314-320.

［11］全國(guó)食品工業(yè)標(biāo)委會(huì)發(fā)酵分委會(huì).功能性紅曲米（粉）：QB/T 2847—2007［S］.北京：中國(guó)輕工出版社，2007.

［12］李忠慶，郭芳.紅曲菌的形態(tài)及分類學(xué)［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2003.

［13］呂旭聰，翁星，韓妙坤，等.福建紅曲中紅曲菌的分離鑒定及菌株特性研究［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)2012，12（2）：89-96.

［14］李曉樓.大曲中紅曲霉的簡(jiǎn)易分離方法［J］.中國(guó)西部科技，2008（7）：29-30.

［15］Singgih M，Saraswaty V，Ratnaningrum D，et al. The influence of temperature and ethanol concentration in Monacolin K extration from Monascus fermented rice［J］. Procedia Chemistry，2014，9：242-247.

［16］劉月，王璐，許贛榮.種間雙親滅活原生質(zhì)體融合選育高產(chǎn)Monacolin K紅曲菌［J］.工業(yè)微生物，2012，42（4）：54-59.

［17］Zhang J，Wang Y L，Lu L P，et al. Enhanced production of Monacolin K by addition of precursors and surfactants in submerged fermentation of Monascus purpureus 9901［J］. Biotechnology and Applied Biochemistry，2014，61（2）：202-207.DOI：10.13746/j.njkj.2016043

中圖分類號(hào)：TQ925.7；TS261.1；TS262.3；Q93-3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）05-0038-04

基金項(xiàng)目：四川省科技廳科技支撐項(xiàng)目《窖泥微生物混合菌群結(jié)構(gòu)分析及釀造微生物的分離鑒定（省院科技合作）》，2015JZ0001。

收稿日期：2016-01-19

作者簡(jiǎn)介：劉青青（1990-），女，重慶人，在讀碩士生，主要從事微生物及釀酒生物技術(shù)的研究。

通訊作者：沈才洪（1966-），男，教授級(jí)高工，四川省學(xué)術(shù)帶頭人，瀘州老窖有限公司副總經(jīng)理，總工程師。

DOI：10.13746/j.njkj.2016018 10.13746/j.njkj.2015442

Screening and Identification of a Monacolin K-producing Strain from Nongxiang Daqu

LIU Qingqing1，REN Jianbo2，4，SHEN Caihong2，4，WANG Songtao3，4，YU Xuechun3，CAO Zhenhua1and AO Zonghua2，4
（1.Sichuan University of Science & Engineering，Zigong，Sichuan 643000；2. Luzhou Laojiao Co.Ltd.，Luzhou，Sichuan 646000；3. Luzhou Laojiao Health Liquor Co. Ltd.，Luzhou，Sichuan 646000；4 National Engineering Technology Research Center of Solid-state Brewing，Luzhou，Sichuan 646000，China）

Abstract：To obtain Monacolin K-producing Monascus strains，18 Monascus strains were isolated from 10 Nongxiang Daqu samples of difference sources. Through TLC primary screening and HPLC secondary screening，a Monacolin K-producing strain MY1 was finally obtained. It was identified as Monascus purpureus based on morphological identification and molecular biology features.

Key words：microbe；Monascus；Monacolin K；screening；identification