姚素艷，趙　剛，劉建生，馬萬(wàn)里，鄭德宇

(錦州醫(yī)科大學(xué)：1. 病理生理學(xué)教研室；2. 解剖學(xué)教研室，遼寧錦州　121001；3. 盤(pán)錦市中心醫(yī)院骨外科，遼寧盤(pán)錦　124000)

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◇基礎(chǔ)研究◇

沉默HLA A2表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞安全性的研究

姚素艷1，趙剛2,3，劉建生2，馬萬(wàn)里2,3，鄭德宇2

(錦州醫(yī)科大學(xué)：1. 病理生理學(xué)教研室；2. 解剖學(xué)教研室，遼寧錦州121001；3. 盤(pán)錦市中心醫(yī)院骨外科，遼寧盤(pán)錦124000)

摘要：目的探討人白細(xì)胞抗原A2(HLA A2)表達(dá)沉默后人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)的安全性。方法實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(正常培養(yǎng)至第8代細(xì)胞組)及實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2(分別為HLA A2表達(dá)沉默后第5代、第15代)。復(fù)蘇HLA A2表達(dá)沉默的hBMSCs，通過(guò)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線、端粒酶活性和抑癌基因P27的表達(dá)水平、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶4(CDK4)和Cyclin D2的表達(dá)水平，分析細(xì)胞的安全性。并將細(xì)胞接種于裸鼠的皮下，24周后觀察荷瘤組織的種類(lèi)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2與對(duì)照組相比，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線沒(méi)有明顯的左移或右移。HLA A2表達(dá)沉默的hBMSCs在沉默HLA A2表達(dá)后，3組間的端粒酶活性沒(méi)有明顯差異；3組的Cyclin D2、CDK4和抑癌基因P27的表達(dá)量也沒(méi)有明顯變化。細(xì)胞接種于裸鼠皮下24周，只有異位成骨，而沒(méi)有形成腫瘤組織。結(jié)論人BMSCs的HLA A2表達(dá)沉默后，在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，沒(méi)有明顯證據(jù)表明有安全性的改變。

關(guān)鍵詞：人白細(xì)胞抗原(HLA)A2；RNA干擾；安全性；人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)；Cyclin D2；CDK4；P27

在組織工程研究中，來(lái)源于自體的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是所有來(lái)源的金標(biāo)準(zhǔn)，沒(méi)有倫理的限制，沒(méi)有免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。但在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程，存在自體細(xì)胞隨年齡增加數(shù)量減少的趨勢(shì)，并且易受病毒污染等缺陷，限制了自體細(xì)胞的應(yīng)用。近年來(lái)，人們一直在尋找可以替代的細(xì)胞。有學(xué)者認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種免疫豁免細(xì)胞，不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)[1]，但也有一些實(shí)驗(yàn)室研究者認(rèn)為同種異體移植BMSCs存在一定的免疫排斥反應(yīng)并影響了組織缺損的修復(fù)。針對(duì)異體種子細(xì)胞抗原性引起宿主的免疫排斥反應(yīng)這一問(wèn)題，本課題組以往應(yīng)用RNA干擾方法有效降低了人白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)A基因的表達(dá)，在減弱種子細(xì)胞抗原性方面取得了明顯進(jìn)展[2]。但也有實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，應(yīng)用病毒載體將異基因?qū)爰?xì)胞后，載體與基因組發(fā)生隨機(jī)融合，可以導(dǎo)致某些管家基因的失活或激活原癌基因，引起細(xì)胞的基因表達(dá)譜變化，誘發(fā)細(xì)胞安全性變化[3]。

P27是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，可以抑制原癌基因的活化[4-5]。以往的研究發(fā)現(xiàn)各種類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞幾乎P27都低表達(dá)。此外，腫瘤細(xì)胞也常有一些細(xì)胞周期因子的表達(dá)異常增高，如細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶-4(cyclin dependent kinase 4, CDK4)和細(xì)胞周期蛋白D2(cyclin D2)等是促進(jìn)細(xì)胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白分子，可以使細(xì)胞由靜止期改變?yōu)樵鲋称赱6]。如果在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，出現(xiàn)P27表達(dá)降低或缺乏，CDK4和Cyclin D2的異常增高，說(shuō)明細(xì)胞可能發(fā)生惡性變[7]，出現(xiàn)致瘤性。

本研究結(jié)合細(xì)胞安全性的常規(guī)評(píng)價(jià)方法和腫瘤細(xì)胞的研究進(jìn)展，針對(duì)本課題組中沉默HLA A2表達(dá)而降低了抗原性的人BMSCs(hBMSCs)進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，從細(xì)胞形態(tài)、抑癌基因和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)以及端粒酶的活性等方面來(lái)檢測(cè)和評(píng)價(jià)細(xì)胞的安全性。

1 材料與方法

1.1材料HLA A2表達(dá)沉默的hBMSCs(由錦州醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室凍存)，CO2恒溫孵育箱(E191IR，美國(guó)SIM公司)，倒置相差顯微鏡(CKX41)，數(shù)碼相機(jī)(C-5060，日本Olympus公司)，臺(tái)式低速離心機(jī)(L80-2B，上海安亭儀器廠)，超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FB，蘇州凈化設(shè)備有限公司)，胎牛血清、L-DMEM(Gibco)、胰蛋白酶、CDK單克隆抗體、Cyclin D2單克隆抗體、端粒酶檢測(cè)試劑盒和小鼠抗HLA-A2單克隆抗體(美國(guó)Sigma公司)，DAB顯色試劑盒(北京賽馳)。

1.2HLA A2表達(dá)沉默的hBMSCs的復(fù)蘇及實(shí)驗(yàn)分組

常規(guī)方法復(fù)蘇細(xì)胞，以5×105/mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%～90%時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶(含0.2 g/L EDTA)常規(guī)消化傳代[8-9]。

以HLA A2表達(dá)沉默后傳5代hBMSCs為實(shí)驗(yàn)組1，HLA A2表達(dá)沉默后傳15代hBMSCs為實(shí)驗(yàn)組2，正常hBMSCs培養(yǎng)傳8代為對(duì)照組。

1.3繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分別收集實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2和對(duì)照組細(xì)胞，將細(xì)胞以1×104/mL密度接種于24孔板中，每孔1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)，從第2天開(kāi)始，每天消化4孔細(xì)胞，計(jì)數(shù)，直到細(xì)胞數(shù)目不再增加。以每天hBMSCs的平均數(shù)目繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的變化。

1.4HLA A2表達(dá)沉默后的致瘤性檢測(cè)

1.4.1端粒酶活性PCR-ELISA檢測(cè)[10-11]按試劑盒要求對(duì)實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2和對(duì)照組的hBMSCs進(jìn)行端粒酶活性PCR-ELISA檢測(cè)。以已知端粒酶陽(yáng)性的人纖維肉瘤HT1080作為陽(yáng)性對(duì)照，以試劑盒自備樣品為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照的最大吸光度(A)值應(yīng)是0.25(A450～690 nm)。如果此值高，全部實(shí)驗(yàn)包括TRAP應(yīng)重復(fù)。陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)的吸光值應(yīng)高于1.5(A450～690 nm)。如果測(cè)定值過(guò)低，全部實(shí)驗(yàn)包括TRAP應(yīng)重復(fù)?！鰽，即A樣品-A陰性對(duì)照>0.2(A450～690 nm)，則認(rèn)為該樣品端粒酶陽(yáng)性。

1.4.2P27、CDK4和Cyclin D2的檢測(cè)收集3組細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)基(或離心去除培養(yǎng)基)，0.1 mol/L PBS洗1次，分別加入裂解緩沖液提取蛋白并測(cè)定蛋白含量。煮沸5 min，放置于-20 ℃冰箱中冰凍保存?zhèn)溆?。?yáng)性對(duì)照組采用人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞株。按試劑盒要求，應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)P27(1∶1 000)、Cyclin D2(1∶800)和CDK4(1∶500)的表達(dá)。

1.4.3荷瘤實(shí)驗(yàn)及HE染色收集實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、對(duì)照組和人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞株各106細(xì)胞，接種于裸鼠的皮下，于接種后24周處死動(dòng)物，取出接種周?chē)慕M織，HE染色，觀察組織結(jié)構(gòu)。

2結(jié)果

2.1HLA A2表達(dá)沉默后hBMSCs復(fù)蘇后的狀態(tài)觀察復(fù)蘇后的第2天即可見(jiàn)少量的細(xì)胞貼壁，大約4 d 時(shí)細(xì)胞開(kāi)始增多，約8 d左右細(xì)胞能生長(zhǎng)融合達(dá)到70%～80%。經(jīng)傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度較復(fù)蘇時(shí)稍快。在熒光顯微鏡下觀察，大部分細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及部分胞核顯示綠色熒光(圖1)，與倒置顯微鏡下觀察到的細(xì)胞形態(tài)幾乎一致。

圖1HLA A2表達(dá)沉默的hBMSCs細(xì)胞形態(tài)(bar=100 μm)

Fig.1 The phynotype of the hBMSCs after silencing of HLA A2 expressionA：相差倒置顯微鏡下細(xì)胞呈梭形或多角形；B：A圖的同一視野熒光顯微鏡下可見(jiàn)轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞為與細(xì)胞形態(tài)幾乎一致的綠色熒光。

2.2細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)組1的hBMSCs在接種后1 d的細(xì)胞數(shù)量并沒(méi)有明顯增加，2 d開(kāi)始增加，3 d時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，大約7 d細(xì)胞數(shù)量達(dá)到極值，之后細(xì)胞不再增加反而略有下降。實(shí)驗(yàn)組2與對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)與實(shí)驗(yàn)組1大致相當(dāng)，3組間沒(méi)有明顯差異。說(shuō)明hBMSCs在HLA A2表達(dá)沉默后，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度并沒(méi)有明顯增加或減緩，同時(shí)也沒(méi)有喪失接觸性抑制的特性(圖2)。

圖2不同處理方法的hBMSCs的生長(zhǎng)曲線

Fig.2 Growth curve of hBMSCs treated by different methods

實(shí)驗(yàn)組1：HLA A2表達(dá)沉默后傳5代hBMSCs；實(shí)驗(yàn)組2：HLA A2表達(dá)沉默后傳15代hBMSCs；對(duì)照組：正常培養(yǎng)傳8代的hBMSCs。

2.3hBMSCs在HLA A2表達(dá)沉默后的致瘤性檢測(cè)結(jié)果

2.3.1TRAP PCR-ELISA檢測(cè)端粒酶活性結(jié)果結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組的端粒酶活性為0.037，陽(yáng)性對(duì)照組的端粒酶活性為2.687。在HLA A2表達(dá)沉默的第5代和第15代的hBMSCs的端粒酶活性均小于0.1，分別為0.085和0.064，與對(duì)照組0.073相比，沒(méi)有明顯差異。但與陽(yáng)性對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01。表1)。一般細(xì)胞端粒酶的活性都小于1.5，故可以認(rèn)為在正常范圍。

表1端粒酶活性

Tab.1Activities of telomerase activation

±s, n=4)

與陰性對(duì)照組相比，##P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，**P<0.01。

2.3.2P27、CDK4和Cyclin D2的表達(dá)變化Western blot檢測(cè)顯示，P27蛋白在HLA A2表達(dá)沉默后第5代和15代的hBMSCs的表達(dá)水平與正常經(jīng)8代培養(yǎng)的hBMSCs表達(dá)水平相近，而P27在陽(yáng)性對(duì)照組(人纖維肉瘤細(xì)胞株HT1080)的表達(dá)明顯降低，幾乎檢測(cè)不到目的條帶(圖3)。應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)的HLA A2表達(dá)沉默未使抑癌基因P27表達(dá)改變，提示不引起成瘤的潛在危險(xiǎn)。

HLA A2表達(dá)沉默后第5代和15代的hBMSCs和正常培養(yǎng)的8代hBMSCs中，Cyclin D2和CDK4呈現(xiàn)出低水平的表達(dá)，均明顯弱于陽(yáng)性對(duì)照組的表達(dá)(圖3)。

圖3Western blot 檢測(cè)各組hBMSCs的P27、CDK4及Cyclin D2的表達(dá)變化

Fig.3 The expressions of P27, CDK4 and Cyclin D2 in hBMSCs detected by Western blot

1：對(duì)照組； 2：實(shí)驗(yàn)組1(HLA A2表達(dá)沉默后第5代)；3：實(shí)驗(yàn)組2(HLA A2表達(dá)沉默后第15代)；4：HT1080陽(yáng)性對(duì)照組。

2.3.3荷瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果各組BMSCs接種于裸鼠皮下后，24周處死動(dòng)物取周?chē)M織行HE檢測(cè)，顯示只有類(lèi)骨組織(圖4)，分析為BMSCs的異位成骨，而人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞株接種于祼鼠皮下后，在12周時(shí)就可見(jiàn)明顯的腫瘤組織形成。說(shuō)明HLA A2沉默后在實(shí)驗(yàn)期限內(nèi)沒(méi)有形成腫瘤組織。

圖4各組BMSCs種植于裸鼠皮下的異位成骨

Fig.4 Subdermal ectopic bone formation of BMSCs transplanted in the nude mice (×200)

A：HLA A2表達(dá)沉默后傳5代的BMSCs；B：HLA A2表達(dá)沉默后傳15代的BMSCs；C：正常培養(yǎng)傳8代的BMSCs。

3討論

同種異體的間充質(zhì)干細(xì)胞是一種較好的自體間充質(zhì)干細(xì)胞的替代細(xì)胞，但對(duì)于同種異體的BMSCs是否存在抗原性和能否引起免疫排斥反應(yīng)，不同的實(shí)驗(yàn)室也有不同的觀點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室結(jié)合實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題和其他一些實(shí)驗(yàn)室的結(jié)論認(rèn)為BMSCs存在一定的免疫排斥反應(yīng)，并且能影響骨缺損的愈合[12-13]。本實(shí)驗(yàn)室以往的研究表明，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，能夠降低HLA A2的表達(dá)，抑制同種異體的T淋巴細(xì)胞的增殖，減弱免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生[14]。并且這種作用可以維持15代培養(yǎng)時(shí)間，即10周以上。但是細(xì)胞的安全性尚沒(méi)有明確的闡述，本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了初步的探索。

細(xì)胞安全性包括細(xì)胞的生長(zhǎng)特性、細(xì)胞核型、動(dòng)物致瘤性的研究、細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)水平、端粒酶活性和抑癌基因的表達(dá)水平等方面。本研究對(duì)HLA A2表達(dá)沉默后hBMSCs的安全性進(jìn)行了初步探索，觀察其細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)特性與正常對(duì)照組細(xì)胞一樣，呈現(xiàn)較為均一的梭形或多角形，細(xì)胞中生長(zhǎng)達(dá)到鋪滿(mǎn)瓶底時(shí)，也存在接觸性抑制的特性。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HLA A2基因表達(dá)沉默后的15代細(xì)胞的端粒酶活性與正常對(duì)照組hBMSCs基本保持在同一水平，雖然較陰性對(duì)照組有些差異，但遠(yuǎn)低于異常的標(biāo)準(zhǔn)。

Cyclin D2和CDK4是細(xì)胞周期重要的調(diào)節(jié)因子，在大部分癌細(xì)胞中，Cyclin D2和CDK4表達(dá)異常增高，腫瘤細(xì)胞分裂增殖異常活躍，細(xì)胞的惡性程度也高。而在正常的細(xì)胞，如果由于某種原因引起cyclin D2和CDK4的表達(dá)上調(diào)，可能會(huì)預(yù)示細(xì)胞加快了細(xì)胞周期，使細(xì)胞呈現(xiàn)了致瘤的可能性。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到HLA A2表達(dá)沉默的hBMSCs培養(yǎng)第15代時(shí)，并沒(méi)有Cyclin D2和CDK4的異常增高，與正常對(duì)照組或陰性對(duì)照組沒(méi)有明顯區(qū)別。

P27基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要的抑癌基因，能夠調(diào)控細(xì)胞周期并且具有抑制細(xì)胞分裂的重要作用，其編碼的P27蛋白屬于細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors, CKIs)家族中的一員，對(duì)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶具有廣譜抑制作用[15-16]。在很多的腫瘤細(xì)胞中也存在有P27表達(dá)下降甚至不表達(dá)的現(xiàn)象，這會(huì)減弱或失去P27的抑制作用，可使細(xì)胞不受細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)的限制而迅速增生，促使腫瘤的發(fā)生[17-18]。本實(shí)驗(yàn)慢病毒載體導(dǎo)入干擾RNA片段沉默HLA A2表達(dá)傳15代時(shí)，相當(dāng)正常培養(yǎng)細(xì)胞的傳第18代，P27的表達(dá)量正常，與正常培養(yǎng)傳8代的BMSCs表達(dá)量相差無(wú)幾，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于人纖維肉瘤細(xì)胞株HT1080。

以上均提示，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)選擇慢病毒載體向BMSCs中導(dǎo)入小干擾序列降低HLA A2的表達(dá)，可減弱同種異體的BMSCs的抗原性。進(jìn)一步將HLA A2沉默后的hBMSCs接種到裸鼠的皮下后，在6個(gè)月內(nèi)只形成異位骨組織，而對(duì)照組HT1080則在2個(gè)月時(shí)就形成明顯的腫瘤組織。說(shuō)明在所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的時(shí)間內(nèi)，這種降低抗原性的hBMSCs是安全的，不具有致瘤和致畸的危險(xiǎn)，可以作為組織工程中的種子細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的研究。

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(編輯國(guó)榮)

收稿日期：2015-07-22修回日期：2016-01-30

基金項(xiàng)目：遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2013022066，2013022048)，遼寧省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(No.LT2012016)和一般項(xiàng)目(No.L2013335)資助

通訊作者：鄭德宇. E-mail: zdy4673349@163.com

中圖分類(lèi)號(hào)：R322.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604005

Safety of the bone marrow derived mesenchymal stem cells after HLA A2 gene silencing

YAO Su-yan1, ZHAO Gang2,3, LIU Jian-sheng2, MA Wan-li2,3, ZHENG De-yu2

(1.Department of Pathophysiology, 2. Department of Anatomy,Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001; 3. Department of Orthopedic Surgery,Central Hospital of Panjin, Panjin 124000, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the safety of the human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hBMSCs) after silencing of human leukocyte antigen A2 expression. MethodsWe divided the cells into three groups: normal cultured cells of the 8th passage served as control group, and hBMSCs after HLA A2 silencing expression of the 5th and 15th passage as experimental groups 1 and 2, respectively. The hBMSCs were recultured by sterile methods. The growth curve, telomerase activation, and expressions of P27, cyclin D2 and cyclin-dependent kinase 4 (CDK4) were utilized to explore the safety of the hBMSCs induced by LV-siRNA-HLA A2. The BMSCs were transplanted to the subcutaneous layer of nude mice. Tissue types were detected 24 weeks after transplantation. ResultsThe cell curves had no obvious left or right shift in all the groups. The telomerease activation in experimental groups 1 and 2 did not significantly differ from those in control group. The expressions of anti-oncogene P27, cyclin D2 and CDK4 had no obvious difference between the two experimental groups and control group, either. There was only ectopic osteogenesis 24 weeks after the BMSCs (HLA A2 gene silenced) were transplanted to the subcutaneous layer of the nude mice. ConclusionThere was no obvious evidence to support that hBMSCs had undergone change in safety after the silencing of HLA A2 expression.

KEY WORDS:HLA A2; RNA interference; safety; human bone marrow-derived mesenchymal stem cell (hBMSC); Cyclin D2; CDK4; P27

Supported by the Natural Science Foundation of Liaoning Province (No.2013022066, 2013022048) and Innovative Team Foundation (No. LT2012016) and Common Foundation of the Department of Education of Liaoning Province (No.L2013335)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160608.0922.010.html(2016-06-08)