張　悅，符喬珊，劉　韡，高　慶

(1. 西安市第四人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安　710004；2. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安　710004)

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◇中醫(yī)藥研究◇

黃芩苷對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用及其機(jī)制

張悅1，符喬珊1，劉韡2，高慶2

(1. 西安市第四人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安710004；2. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安710004)

摘要：目的觀察黃芩苷對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其相應(yīng)機(jī)制。方法利用MTT法檢測(cè)黃芩苷對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響；Transwell小室法檢測(cè)黃芩苷對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響；Real-time PCR法檢測(cè)黃芩苷對(duì)MMP-2、MMP-9 RNA表達(dá)水平的影響；Western blot法檢測(cè)黃芩苷對(duì)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響；Western blot法檢測(cè)黃芩苷對(duì)P38和p-P38蛋白表達(dá)的影響；Real-time PCR法檢測(cè)黃芩苷和sb203580聯(lián)合應(yīng)用對(duì)MMP-2和MMP-9 RNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果黃芩苷能夠有效抑制HeLa細(xì)胞的增值，當(dāng)質(zhì)量濃度超過60 μg/mL時(shí)，與對(duì)照組相比(0 μg/mL)差異出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在低于細(xì)胞增殖抑制濃度時(shí)，黃芩苷也能夠有效抑制HeLa細(xì)胞的侵襲，10、20、40 μg/mL組穿過基質(zhì)膠到達(dá)小室底端的細(xì)胞數(shù)目分別為對(duì)照組的(97.58±17.78)%、(67.95±49.75)%和(32.35±20.41)%。黃芩苷能夠有效抑制HeLa細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)及有效抑制HeLa細(xì)胞中P38的磷酸化水平；P38信號(hào)通路抑制劑預(yù)處理，能夠增強(qiáng)黃芩苷對(duì)MMP-2和MMP-9表達(dá)的抑制作用。結(jié)論黃芩苷能夠有效抑制HeLa細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，這種作用可能與其通過調(diào)節(jié)P38信號(hào)通路的活性進(jìn)一步調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：黃芩苷；HeLa細(xì)胞；侵襲；P38信號(hào)通路；基質(zhì)金屬蛋白酶

宮頸癌是最為常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率位于婦科惡性腫瘤的第2位。近年來35歲以下年輕女性中宮頸癌的發(fā)病率逐年上升，這與HPV感染率的增高相關(guān)。宮頸癌的常規(guī)治療包括手術(shù)治療、放療、化療和綜合治療，這些治療在取得一定療效的同時(shí)會(huì)帶來較多的副作用和并發(fā)癥。黃芩苷是從中藥黃芩中提取的一種單體化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、免疫活化和抗病毒等多種功能[1-2]。新近的研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷在體內(nèi)外均有廣泛的抗腫瘤作用，且在發(fā)揮這種抗腫瘤作用時(shí)對(duì)正常細(xì)胞沒有明顯毒性[2]。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對(duì)包括結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌和淋巴瘤在內(nèi)的多種腫瘤中具有明確的抗腫瘤作用[3-6]。但關(guān)于黃芩素對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用的報(bào)道較少?；谝陨希狙芯繑M探討黃芩素對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑黃芩苷購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司；MTT細(xì)胞增殖及活性檢測(cè)試劑、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、DMSO、Trypsin-EDTA溶液、蛋白分子量標(biāo)記、細(xì)胞裂解液、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(H+L)抗體和PVDF膜購(gòu)于碧云天公司；兔抗人MMP-2、MMP-9，P38和p-P38購(gòu)于Cellsignal公司；GAPDH購(gòu)于Santa Crus公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)HeLa細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保有。細(xì)胞培養(yǎng)液為含有100 mL/L血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素。細(xì)胞在37 ℃、50 mL/L CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，細(xì)胞融合率達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3黃芩苷溶液的配制利用100% DMSO配制黃芩苷母液，原液質(zhì)量濃度為60 mg/mL，儲(chǔ)存溫度為4 ℃。所有實(shí)驗(yàn)中用藥均采用DMEM培養(yǎng)基現(xiàn)用現(xiàn)配的方法，所有培養(yǎng)液中DMSO的終質(zhì)量濃度均小于1 g/L。

1.4MTT法檢測(cè)黃芩苷對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，配成密度為5×104/mL懸液接種于96孔板中，每孔接種量為100 μL。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)6 h后，利用含有黃芩苷藥物的溶液培養(yǎng)細(xì)胞24 h，藥物質(zhì)量濃度為0、10、20、40、60、80、100 μg/mL，其中0 μg/mL組為對(duì)照組。其后96孔板中每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，置于37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)4 h。在加入DMSO后于酶標(biāo)儀中選取570 nm進(jìn)行吸光度(A)讀數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

抑制率(IR)(%)=(1-治療組A/對(duì)照組A)×100%。

1.5細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，胰酶常規(guī)消化后利用含20 mL/L血清的培養(yǎng)基制成5×105/mL細(xì)胞懸液，在Tranwell小室上室中加入含有不同濃度黃芩素的細(xì)胞懸液0.4 mL，下室中加入血清濃度為100 mL/L的常規(guī)培養(yǎng)基。24 h后取出小室對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，用棉簽去除上室中殘留細(xì)胞并對(duì)小室底部的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色和拍照，并在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)(每個(gè)濃度組隨機(jī)選擇5個(gè)視野)。

1.6Real-time PCR檢測(cè)黃芩苷對(duì)MMP-2和MMP-9轉(zhuǎn)錄水平的影響Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，根據(jù)TaKaRa公司PrimeScript RT-PCR Kit試劑說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，引物設(shè)計(jì)見表1。每組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

表1Real-time PCR 引物序列

Tab.1Gene-specific primer pairs used for Real-time PCR

基因序列β-actinCCATCGTCCACCGCAAAT(forward)CATGCCAATCTCATCTTGTTT(reverse)MMP-2CTCATCGCAGATGCCTGGAA(forwardTTCAGGTAATAGGCACCCTTGAAGA(reverse)MMP-9GTCCACCCTTGTGCTCTTCC(forward)GCCACCCGAGTGTAACCAT(reverse)

1.7Western blot檢測(cè)黃芩苷對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的影響黃芩苷處理HeLa細(xì)胞24 h后，細(xì)胞常規(guī)消化，冰PBS洗滌2次，然后加入裂解液進(jìn)行裂解。利用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，并根據(jù)蛋白提取物濃度確定上樣量。SDS凝膠中每孔加入等量蛋白，根據(jù)不同分子量的目的蛋白調(diào)整電泳時(shí)間和電壓，其后轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，在50 g/L脫脂牛奶中封閉1 h。然后將膜封閉于含有各種抗體的溶液中，4 ℃ 搖床過夜。第2天PBST洗滌3次，每次15 min。然后常溫封閉相應(yīng)二抗1 h。再次用PBST洗滌3次，最后一次用PBS洗滌，時(shí)間均為15 min。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，最后利用成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果圖像進(jìn)行采集，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2結(jié)果

2.1黃芩苷對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響本研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷能夠明顯抑制HeLa細(xì)胞的增殖，隨著黃芩苷濃度的升高，其對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，與對(duì)照組相比，當(dāng)濃度達(dá)到60 μg/mL時(shí)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，圖1)。

圖1黃芩苷對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 The inhibition of baicalin on the proliferation of HeLa cells

與0 μg/mL組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2黃芩苷對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響本研究前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩苷在濃度高于60 μg/mL時(shí)，能夠明顯抑制HeLa細(xì)胞的增殖。為此我們選擇低于60 μg/mL濃度的黃芩苷作為檢測(cè)其抗侵襲能力的實(shí)驗(yàn)濃度，以消除其抗增殖能力對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，在低于細(xì)胞毒性濃度的情況下，黃芩苷能夠明顯抑制HeLa細(xì)胞的侵襲，10、20、40 μg/mL濃度組細(xì)胞穿過基質(zhì)膠到達(dá)小室底端的細(xì)胞數(shù)目，分別為對(duì)照組的(97.58±17.78)%、(67.95±49.75)%和(32.35±20.41)%，這種抑制作用隨著藥物濃度的升高而增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖2黃芩苷對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

Fig.2 The inhibitory effect of baicalin on the invasion of HeLa cells

A：不同濃度組穿過基質(zhì)膠到達(dá)小室低端的細(xì)胞(紫色)；B：對(duì)小室底端細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。與0 μg/mL組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3黃芩苷對(duì)MMP-2和MMP-9 RNA轉(zhuǎn)錄水平的影響為了進(jìn)一步檢測(cè)黃芩苷抑制HeLa細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，我們利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)了黃芩苷對(duì)MMP-2和MMP-9 RNA轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能夠在RNA水平明顯抑制MMP-2和MMP-9的轉(zhuǎn)錄，10、20、40 μg/mL濃度組MMP-2為對(duì)照組的(72.32±0.49)%、(58.70±11.42)%和(48.12±4.24)%，MMP-9為對(duì)照組的(74.37±10.18)%、(62.50±15.89)%和(39.54±6.18)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

2.4黃芩苷對(duì)MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響同2.3項(xiàng)，我們檢測(cè)了黃芩苷對(duì)HeLa細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能夠明顯抑制MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)，對(duì)照組和黃芩苷治療組MMP-2和MMP-9的相對(duì)表達(dá)量分別為0.73±0.1和0.52±0.06，0.95±0.1和0.64±0.07，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

圖3黃芩苷對(duì)HeLa細(xì)胞中MMP-2和MMP-9轉(zhuǎn)錄水平的影響

Fig.3 The effect of baicalin on the transcription of MMP-2 and MMP-9 in HeLa cells at the mRNA level

與0 μg/mL組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖4黃芩苷對(duì)MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

Fig.4 The effect of baicalin on the expressions of MMP-2 and MMP-9 in HeLa cells at the protein level

A：各組細(xì)胞MMP-2、MMP-9和GADPH的蛋白表達(dá)情況；B：對(duì)各蛋白表達(dá)的灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后的結(jié)果。與0 μg/mL組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.5黃芩苷對(duì)P38磷酸化水平的影響為了進(jìn)一步探討黃芩苷抑制HeLa細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的可能調(diào)控機(jī)制，檢測(cè)了黃芩苷對(duì)P38信號(hào)通路活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能夠明顯抑制P38信號(hào)通路的活性。隨著黃芩苷濃度的升高P38的磷酸化水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。而黃芩苷與P38信號(hào)通路抑制劑聯(lián)合應(yīng)用后，sb203580組、sb203580+黃芩素和黃芩苷組MMP-2為對(duì)照組的(88.08±5.39)%、(51.85±11.36)%和(67.03±7.23)%，MMP-9為對(duì)照組的(84.09±21.58)%、(44.90±3.25)%和(55.47±12.07)%(圖6)。

圖5黃芩苷對(duì)P38信號(hào)通路活性的影響

Fig.5 The effect of baicalin on the activity of P38 signal pathway

A：各組細(xì)胞中P38和p-P38蛋白的表達(dá)情況；B：對(duì)各個(gè)蛋白的灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后的結(jié)果。與0 μg/mL組比較，**P<0.01。

圖6黃芩苷與sb203580聯(lián)合應(yīng)用對(duì)MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響

Fig.6 The effect of baicalin and sb203580 on the expressions of MMP-2 and MMP-9

與0 μg/mL組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3討論

宮頸癌是最為常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率位于婦科惡性腫瘤的第2位。隨著HPV的感染率增高宮頸癌呈現(xiàn)出年輕化的趨勢(shì)，表現(xiàn)為35歲以下年輕女性中宮頸癌的發(fā)病率逐年上升[7]。宮頸癌的常規(guī)治療包括手術(shù)治療、放療治療、化學(xué)治療和綜合治療。但對(duì)于晚期宮頸癌患者，這些治療在取得一定療效的同時(shí)會(huì)帶來較多的副作用和并發(fā)癥。黃芩苷是從中藥黃芩中提取的一種單體化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、免疫活化和抗病毒等多種功能[1]。新近的研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能在對(duì)正常細(xì)胞無明顯毒性的情況下，發(fā)揮明顯的抗腫瘤細(xì)胞作用，提示黃芩苷是一種高效低毒的抗腫瘤中藥[2]。但是至今為止還未見關(guān)于黃芩苷在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中作用的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能夠有效抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)在低于細(xì)胞毒性濃度時(shí)也能夠有效抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程極為復(fù)雜，許多分子參與其中。在這個(gè)過程中腫瘤細(xì)胞需要從原發(fā)部位脫離，經(jīng)過很多環(huán)節(jié)最終到達(dá)轉(zhuǎn)移位點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞完成這一過程，需要獲得新的特性，這些新的特性的獲得能夠幫助它們從原發(fā)腫瘤脫離、遷移進(jìn)入周圍組織，滲入循環(huán)系統(tǒng)，到達(dá)遠(yuǎn)處并最終在到達(dá)部位形成新的腫瘤病灶?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)被認(rèn)為是促使腫瘤細(xì)胞完成侵襲轉(zhuǎn)移過程的關(guān)鍵性分子，其中最具有代表性的是MMP-2和MMP-9。研究發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[1,8]。在MMP-2和MMP-9的表達(dá)升高后，宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)[9]。而在MMP-2和MMP-9的表達(dá)受到抑制之后，宮頸癌的侵襲受到明顯抑制[10]。本研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷能夠有效降低MMP-2和MMP-9的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，提示其對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用，可能與其對(duì)MMP-2和MMP-9表達(dá)的抑制作用相關(guān)。

P38信號(hào)通路對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡等發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，激活P38信號(hào)通路能夠有效增強(qiáng)下游多種靶點(diǎn)的表達(dá)與活化，其中就包括MMP-2和MMP-9[11-12]。此外研究發(fā)現(xiàn)，P38信號(hào)通路能夠通過調(diào)節(jié)MMP-9啟動(dòng)子位點(diǎn)的活性調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[13]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能夠降低HeLa細(xì)胞P38的磷酸化水平，在與P38信號(hào)通路抑制劑聯(lián)合應(yīng)用后，其對(duì)HeLa中MMP-2、MMP-9表達(dá)的抑制作用明顯增強(qiáng)，提示其對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用可能是通過對(duì)P38信號(hào)通路的活性的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷能夠有效抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，這種抑制作用與通過下調(diào)P38信號(hào)通路的活性進(jìn)一步抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)相關(guān)。本研究為黃芩苷在宮頸癌臨床治療中的應(yīng)用奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(編輯卓選鵬)

收稿日期：2015-06-25修回日期：2015-10-20

通訊作者：高慶. E-mail: dqinggao@163.com

中圖分類號(hào)：R737.33

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604027

Inhibitory effect of baicalin on invasion of cervical cancer HeLa cells and its mechanism

ZHANG Yue1, FU Qiao-shan1, LIU Wei2, GAO Qing2

(1. Department of Obstetrics and Gynecology, Xi’an No. 4 Hospital, Xi’an 710004;2. Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo observe the anti-metastatic effect and mechanism of baicalin on the growth of HeLa cells was measured by MTT assay, and cell migration baicalin on human cervical cancer HeLa cells. MethodsThe effects of baicalin on the proliferation and invasion of HeLa cells were analyzed by MTT method and Transwell assay. Moreover, Real-time PCR was used for investigating the expressions of MMP-2 and MMP-9 at the RNA level. Western blot was used for investigating the expressions of MMP-2, MMP-9, P38 and p-P38 at the protein level. ResultsBaicalin could significantly inhibit the proliferation of HeLa cells in the dose-dependent manner at the concentration above 60 μg/mL. Anti-metastatic signaling induced by baicalin was characterized by down-regulating the RNA and protein expressions of MMP-2 and MMP-9, and down-regulating the phosphorylation level of P38. Pre-treatment of P38 signal pathway inhibitor could enhance the inhibitory effect of baicalin on the expressions of MMP-2 and MMP-9. ConclusionThese results indicate that baicalin-induced anti-metastatic effect involves the inhibition of MMP-2 and MMP-9 in HeLa cells through P38 signal pathway.

KEY WORDS:baicalin; HeLa cell; invasion; P38 signal pathway; matrix metalloproteinases (MMP)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160620.0837.002.html(2016-06-20)