董 晨，決登偉，胡會(huì)剛，趙秋芳，賈利強(qiáng)

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶果樹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524091）

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玉米1-吡咯啉-5-羧酸合成酶在非生物脅迫下的表達(dá)分析

董 晨，決登偉，胡會(huì)剛，趙秋芳，賈利強(qiáng)

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶果樹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524091）

摘 要：脯氨酸在植物滲透調(diào)節(jié)中起舉足輕重的作用，1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是脯氨酸的谷氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶，為了研究玉米P5CS基因家族與玉米抗逆性的關(guān)系，對(duì)玉米幼苗進(jìn)行了非生物脅迫（干旱、低溫、鹽脅迫）處理，利用半定量RT-PCR技術(shù)分析了ZMP5CS基因家族在不同脅迫條件下的表達(dá)特性。結(jié)果表明，ZMP5CS基因家族中除ZM02G27230以外的基因不論地上部葉還是地下部根均被干旱脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，但各成員之間其表達(dá)量最高點(diǎn)出現(xiàn)的時(shí)間不同；相同處理同一基因相同的處理時(shí)間點(diǎn)地上部與地下部基因表達(dá)量存在差異，在干旱脅迫下ZM08G14210的表達(dá)量最高，在鹽脅迫下ZM08G31890的表達(dá)量最高，在低溫脅迫下ZM06G25580的表達(dá)量最高，說明ZMP5CS基因家族表達(dá)受非生物脅迫的誘導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：玉米；1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）；非生物脅迫；表達(dá)分析；半定量RT-PCR

冷害、干旱、高鹽等非生物脅迫嚴(yán)重影響農(nóng)作物的生長發(fā)育，尤其是影響糧食作物的產(chǎn)量［1-2］。我國玉米種植面積居世界第2位，其中約2/3是旱地種植，從播種到收獲的全生育期都可遇到干旱。干旱脫水產(chǎn)生滲透脅迫可致玉米減產(chǎn)25%～30%，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致絕收［3］。鹽脅迫等其他非生物逆境也可能產(chǎn)生滲透脅迫［4］。提高玉米滲透脅迫抗性是改善玉米對(duì)干旱為主的多種非生物脅迫抗性的重要手段，揭示玉米對(duì)滲透脅迫的抗性機(jī)制是抗逆育種和栽培技術(shù)改良的理論基礎(chǔ)。

在滲透脅迫下可積累大量的脯氨酸，脯氨酸是重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，高等植物體內(nèi)有谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑來合成脯氨酸［5］。谷氨酸向脯氨酸轉(zhuǎn)化有2個(gè)關(guān)鍵酶，即吡咯啉-5-羧酸還原酶（P5CR）和吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）。P5CS是一個(gè)雙功能酶，催化谷氨酸磷酸化及谷氨酸γ半醛還原，其活性受脯氨酸反饋抑制［6-7］。P5CS基因受ABA、干旱、鹽脅迫誘導(dǎo)，但它不受熱或低溫所誘導(dǎo)［8］。擬南芥脫水處理2 h后，P5CS基因mRNA表達(dá)量在10 h之內(nèi)隨脅迫的時(shí)間延續(xù)而不斷增加，其后一直保持這一水平。脅迫處理10 h后，復(fù)水5 h后轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，回復(fù)到脫水處理前的程度［9］。Verbruggen等［10］報(bào)道，鹽脅迫下擬南芥的葉和根里P5CS基因轉(zhuǎn)錄的mRNA水平提高到10倍以上。擬南芥的AtP5CS1 和AtP5CS2具有不同的時(shí)間和空間表達(dá)特點(diǎn)，AtP5CS1基因在所有的組織中都具有較高的表達(dá)活性，并且在ABA處理，脫水和高鹽下主要是上調(diào)表達(dá)；而AtP5CS2基因則在分生組織受到ABA或高鹽脅迫的刺激時(shí)優(yōu)先表達(dá)［8，11］。Fujita等［12］研究表明，番茄在NaCl脅迫下，tomPRO2的mRNA表達(dá)量提高到3倍以上，而tomPRO1的信息沒有表達(dá)。因此，同一類植物P5CS基因可以對(duì)不同的逆境脅迫作出反應(yīng)，而不同的P5CS基因也可以受同一種脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。從高粱中分離到的兩個(gè)P5CS基因序列，在高鹽和干旱處理下表達(dá)上調(diào)，但兩個(gè)基因的時(shí)空表達(dá)存在差異，SbP5CS2基因呈組成型表達(dá)，而SbP5CS1主要在成熟營養(yǎng)和生殖器官中表達(dá)［13］。Chen等［14］將普通菜豆的兩個(gè)PvP5CS1和PvP5CS2基因序列轉(zhuǎn)化擬南芥，兩個(gè)基因的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株在鹽脅迫下的表達(dá)量要高，耐鹽性增強(qiáng)。Guerzoni等［15］將豇豆P5CS轉(zhuǎn)化甘蔗，鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)量比對(duì)照高，耐鹽性增強(qiáng)。

目前關(guān)于玉米吡咯啉- 5 -羧酸合成酶（ZMP5CS）的鑒定及其功能研究，國內(nèi)外尚少有報(bào)道。本研究利用半定量RT-PCR技術(shù)全面分析了玉米基因組中整個(gè)P5CS基因家族在干旱、高鹽和低溫脅迫條件下玉米葉和根中ZMP5CS的表達(dá)特性，為進(jìn)一步利用ZMP5CS改良玉米的抗逆性及其基因生物學(xué)功能及其應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為鄭單958，來源于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 P5CS基因數(shù)據(jù)來源及進(jìn)化分析 ZMP5CS基因、蛋白和CDS數(shù)據(jù)來源于MaizeGDB（Maize Genetics and Genomics Database）數(shù)據(jù)庫（http：//www.maizegdb.org/）的玉米B73全基因組數(shù)據(jù)。玉米P5CS蛋白同源的擬南芥蛋白序列來源于Tair （http：//www.arabidopsis.org/index.jsp）網(wǎng)站。玉米P5CS蛋白同源的水稻蛋白序列來源于Rice Annotation Project Database（http：//rice.plantbiology. msu.edu/）。GreenPhylDB（http：//www.greenphyl. org/cgi-bin/index.cgi）分析P5CS基因家族在不同物種的分布情況。同時(shí)采用MEGA5.1對(duì)玉米P5CS蛋白和擬南芥、水稻蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。參數(shù)設(shè)置：使用Neighbor-joining法則的P-距離（P-distance）模型構(gòu)建，選擇成對(duì)刪除（paiwise deletion）空位（gap）的選項(xiàng)，Bootstrap method取值1 000。

1.2.3 ZMP5CS在不同外源脅迫下的表達(dá)特性分析 （1）玉米幼苗的干旱脅迫處理：選取長勢一致、生長健壯的玉米幼苗進(jìn)行水培養(yǎng)7 d，在培養(yǎng)液（1/2 Hoagland培養(yǎng)液）中加入20% PEG6000 進(jìn)行模擬干旱脅迫處理。分別于干旱脅迫 0、1、6 、24 h進(jìn)行觀察和取樣，對(duì)株苗分地上部葉和地下部根分別取樣，立即用液氮速凍備用。

（2）玉米幼苗的鹽脅迫處理：選取長勢一致、生長健壯的玉米幼苗進(jìn)行水培養(yǎng)7 d，在培養(yǎng)液（1/2 Hoagland培養(yǎng)液）中加入200 mmol/L NaCl進(jìn)行鹽脅迫處理。分別于鹽脅迫 0、1、6、24 h進(jìn)行觀察和取樣，對(duì)株苗分地上部葉和地下部根分別取樣，立即用液氮速凍備用。

（3）玉米幼苗的低溫脅迫處理：選取長勢一致、生長健壯的玉米土培苗進(jìn)行水培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)液為（1/2 Hoagland培養(yǎng)液）放置4℃培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫脅迫處理。分別于低溫脅迫 0、1、6 、24 h進(jìn)行觀察和取樣，對(duì)株苗分地上部葉和地下部根分別取樣，立即用液氮速凍備用。

ZMP5CS半定量表達(dá)分析：采用植物RNA提取試劑盒（華越洋生物科技有限公司產(chǎn)品）提取玉米總 RNA。每個(gè)樣品取1μL檢測 RNA 質(zhì)量和濃度后，利用 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa 公司）合成 cDNA 鏈。選用 NCBI上已登錄的玉米ZMActin 片段為內(nèi)參，引物序列根據(jù)已登錄序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，查找已測序玉米基因組中所有的ZMP5CS編碼序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的半定量引物（表1）。PCR反 應(yīng) 體系為 20μL，PCR 產(chǎn)物的長度為 200 bp左右。半定量PCR 的反應(yīng)程序如下 ：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s、55℃退火30 s、72℃延伸 30 s，循環(huán) 35次。每個(gè)反應(yīng)重復(fù) 3 次。PCR 產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測條帶的亮度確定基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 ZMP5CS引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 P5CS基因在不同物種的分布及進(jìn)化分析

利用GreenPhyl在線數(shù)據(jù)庫分析P5CS基因家族在37個(gè)物種中共有163個(gè)序列（圖 1），玉米中有5個(gè)P5CS基因，模式植物擬南芥、水稻P5CS基因均為2個(gè)。

利用模式植物擬南芥、水稻的P5CS蛋白序列為參考，對(duì)玉米基因組中的P5CS蛋白采用鄰接法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2，5個(gè)ZMP5CS分為兩個(gè)亞家族，且與水稻的親緣關(guān)系較近，聚類聚在一起。

圖1 不同物種P5CS基因的分布情況

2.2 干旱脅迫P5CS基因家族表達(dá)變化

通過半定量PCR 分析（圖3）發(fā)現(xiàn)，ZMP5CS家族5個(gè)基因中，有5個(gè)ZMP5CS除ZM02G27230外均對(duì)干旱脅迫響應(yīng)。干旱處理可以誘導(dǎo)ZM06G25580的表達(dá)，其地上部葉中表達(dá)量隨著干旱處理時(shí)間增加呈現(xiàn)降-升-降的趨勢；地下部根中表達(dá)隨著干旱處理時(shí)間增加呈現(xiàn)逐步上升趨勢，但表達(dá)量低于地上部。ZM06G25590地上部葉中表達(dá)量隨著干旱處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)升-降的趨勢，表達(dá)量在干旱脅迫6 h達(dá)到最高，干旱脅迫24 h回落到較干旱脅迫0 h稍高的水平；地下部根中表達(dá)隨著干旱處理時(shí)間增加呈現(xiàn)逐步上升趨勢，干旱脅迫24 h表達(dá)量最高。ZM08G14210的表達(dá)最強(qiáng)，其地上部葉中表達(dá)量隨著干旱脅迫處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)上升趨勢，在干旱脅迫6 h達(dá)到最高；地下部根中表達(dá)隨著干旱處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)逐步上升趨勢，在干旱脅迫24 h達(dá)到最高。ZM08G31890地上部葉及地下部根中表達(dá)量均隨著干旱處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)逐步上升的趨勢，其中地上部葉中在干旱脅迫24 h表達(dá)量達(dá)到最高，地下部根中干旱脅迫6 h達(dá)到最高。

總之，ZMP5CS 受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，但不同基因間的表達(dá)量存在差異，同一基因在不同的組織間表達(dá)也存在差異。

圖2 擬南芥、水稻和玉米P5CS的鄰接法系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 干旱脅迫處理下ZMP5CS的表達(dá)

圖4 鹽脅迫處理下ZMP5CS的表達(dá)

2.3 鹽脅迫P5CS基因家族表達(dá)變化

通過半定量PCR 分析（圖4）發(fā)現(xiàn)，ZMP5CS家族5個(gè)基因中，有5個(gè)ZMP5CS基因除了ZM02G27230外均對(duì)鹽脅迫響應(yīng)。高鹽脅迫處理可以誘導(dǎo)ZM06G25580的表達(dá)，其表達(dá)趨勢與干旱脅迫一致，但地下部該基因的表達(dá)量比干旱脅迫高。ZM06G25590基因的表達(dá)不論地上部還是地下部其表達(dá)量均在鹽脅迫6 h達(dá)到最高，在鹽脅迫6 h地上部表達(dá)量要高于地下部；而地上部及地下部鹽脅迫1 、24 h表達(dá)量低于鹽脅迫0 h對(duì)照。ZM08G14210的表達(dá)趨勢呈現(xiàn)為升-降-升，鹽脅迫24 h表達(dá)量達(dá)到最高；地下部根中誘導(dǎo)表達(dá)變化不明顯，鹽脅迫6 h表達(dá)量略高于鹽脅迫0 h對(duì)照，鹽脅迫1 h表達(dá)量低于鹽脅迫0 h對(duì)照，鹽脅迫24 h表達(dá)量與鹽脅迫0 h對(duì)照相當(dāng)。ZM08G31890基因的表達(dá)在地上部呈現(xiàn)為逐步升高的趨勢，在鹽脅迫24 h達(dá)到最高；地下部根中表達(dá)量在鹽脅迫1 h到達(dá)平臺(tái)期。

2.4 低溫脅迫P5CS基因家族表達(dá)變化

通過半定量PCR 分析（圖5）發(fā)現(xiàn)，ZMP5CS基因家族均響應(yīng)低溫脅迫。受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)。ZM02G27230基因在地上部葉中低溫脅迫1、6 h檢測到表達(dá)，但表達(dá)量比較低，地下部根中沒有檢測到表達(dá)。ZM06G25580基因地上部表達(dá)趨勢為在低溫脅迫1、24 h比較高，低溫脅迫6 h表達(dá)量略低于1、24 h處理，但比低溫脅迫0 h對(duì)照要高；地下部的表達(dá)趨勢為升-降-升，在低溫脅迫1、24 h表達(dá)量比較高，低溫脅迫6 h表達(dá)量與對(duì)照相當(dāng)。ZM06G25590基因地上部表達(dá)趨勢為逐步升高。地下部的表達(dá)趨勢為升-降-升，低溫脅迫24 h表達(dá)量最高，低溫脅迫6 h表達(dá)量與低溫脅迫0 h對(duì)照相當(dāng)。ZM08G14210基因地上部表達(dá)在低溫脅迫6 h達(dá)到最高，地下部的表達(dá)在低溫脅迫1 h達(dá)到最高。ZM08G31890基因地上部表達(dá)趨勢為逐步升高，在低溫脅迫24 h達(dá)到最高；地下部的表達(dá)趨勢為升-降-升，低溫脅迫24 h表達(dá)量最高。

圖5 低溫脅迫處理下ZMP5CS的表達(dá)

3 結(jié)論與討論

植物在低溫、干旱、高鹽等脅迫下，體內(nèi)產(chǎn)生大量脯氨酸，它可作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)參與環(huán)境脅迫下的應(yīng)激代謝反應(yīng)。植物體內(nèi)脯氨酸的合成主要有谷氨酸和鳥氨酸兩條途徑，其中谷氨酸合成途徑在滲透脅迫條件下占主要地位。在谷氨酸途徑中，谷氨酸在1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）的催化下轉(zhuǎn)化成谷氨酸半醛，然后谷氨酸半醛自動(dòng)轉(zhuǎn)化成吡咯啉-5-羧酸（P5C ），接著P5C被吡咯啉-5-羧酸還原酶 （P5CR ） 催化生成脯氨酸［16-17］。P5CS是植物細(xì)胞內(nèi)脯氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶，目前已從多種植物中分離得到 P5CS基因，并從分子生物學(xué)及遺傳學(xué)的角度證明該基因?qū)儆谥参锟鼓婢趁{迫基因［18］。

本研究結(jié)果表明，除對(duì)照0 h外，不論地上部還是地下部，干旱、高鹽、低溫脅迫處理玉米幼苗ZMP5CS基因的表達(dá)量在不同脅迫時(shí)段均呈現(xiàn)為差異型上調(diào)表達(dá)，說明這3種逆境脅迫處理可以誘導(dǎo)ZMP5CS的表達(dá)，這與前人研究結(jié)果［16，19］一致。徐博等［19］從朝鮮堿茅分離到1個(gè) P5CS 的同源基因PuP5CS，PuP5CS 基因在朝鮮堿茅的根部和葉片均有表達(dá)，葉片中的表達(dá)量較高，而根部的表達(dá)量較低，且在根部PuP5CS 基因在鹽脅迫、堿脅迫和鹽堿復(fù)合脅迫下變化大；在葉片中各脅迫的誘導(dǎo)作用也不同。陳吉寶等［16］研究表明，干旱、NaCl和低溫均可誘導(dǎo)普通菜豆的PvP5CS1和PvP5CS2基因的表達(dá)，不同的脅迫處理使兩個(gè)基因有不同的表達(dá)模式，從而使脯氨酸積累也發(fā)生變化。本研究不同脅迫處理?xiàng)l件下P5CS表達(dá)變化規(guī)律基本一致，均受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，但誘導(dǎo)的強(qiáng)度及出現(xiàn)最高峰的位置上有差異。葛淑娟等［20］通過對(duì)玉米種質(zhì)POB21采用15% PEG滲透脅迫處理，表明玉米葉片 的P5CS響應(yīng)滲透脅迫表達(dá)上調(diào)。

本試驗(yàn)結(jié)果還顯示，在干旱、高鹽處理?xiàng)l件下，玉米幼苗根和葉中大多數(shù)ZMP5CS基因表達(dá)量明顯上升，說明ZMP5CS基因也是一個(gè)滲透脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因，同時(shí)說明脯氨酸在脅迫誘導(dǎo)下快速積累，滲透調(diào)節(jié)劑的積累是植物提高滲透脅迫逆境適應(yīng)能力最直接的方式。利用4℃冷處理水稻和擬南芥，水稻經(jīng)1 h可檢測到OsP5CS1表達(dá)水平的明顯增加［21］，而擬南芥24 h后AtP5CS1基因的表達(dá)才略有增加［8］；我們的研究發(fā)現(xiàn)ZMP5CS地下部根中該基因家族表達(dá)與OsP5CS1基因相似，都對(duì)4℃冷處理反應(yīng)迅速，是一個(gè)冷脅迫誘導(dǎo)早期表達(dá)基因，在早期滲透調(diào)控中起重要作用。正常情況下，苜蓿MtP5CS1基因在各個(gè)器官中的表達(dá)水平一樣，MtP5CS2沒有的表達(dá)信號(hào)；滲透脅迫下MtP5CS1的表達(dá)量沒有增加，但促進(jìn)了苜蓿根的MtP5CS2基因大量表達(dá)［22］。我們的檢測結(jié)果顯示，玉米ZMP5CS基因家族中ZM02G27230在對(duì)照葉片和根中均檢測不到表達(dá)，干旱脅迫及高鹽脅迫下也沒有表達(dá)，而在低溫情況下檢測到表達(dá)；其他4個(gè)ZMP5CS基因在葉片和根中都表達(dá)。這些結(jié)果說明，ZMP5CS基因的表達(dá)具有脅迫響應(yīng)和器官的特異性?？梢酝茢?，ZMP5CS 基因在脅迫條件下玉米幼苗的早期滲透調(diào)控中起重要作用。

總之，ZMP5CS 基因家族是受干旱、高鹽、冷害等逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因，該基因家族可能參與多種逆境脅迫過程中玉米體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)過程。本研究初步驗(yàn)證了ZMP5CS在植物抗逆過程中可能起著重要作用，但 ZMP5CS在植物抗逆過程中具體的功能和機(jī)制尚需深入研究。

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Differential exprssion of maize delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthase（ P5CS）gene family members under different abiotic stress

DONG Chen， JUE Deng-wei， HU Hui-gang， ZHAO Qiu-fang， JIA Li-qiang
（Institute of South Subtropical Corp Research， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/ Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture， Zhanjiang 524091，China）

Abstrct：Proline plays an important role in plant osmotic regulation， Delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthase （P5CS） is a key enzyme in proline of glutamic acid synthesis pathway. In order to study the relationship between P5CS gene families and abiotic stress in maize， the maize seedings were treated with abiotic stress （drought， low temperature and salt stress）. The expression levels of ZMPSCS in maize （leaf， root） under different stresses were analyzed by semi-quantitative RT-PCR. The results showed that the excepted ZM02G27230 in the ZMP5CS gene family both up-regulated in the leaf and root by drought stress， but its expression among each member peak appeared in different time. The same treatment of the same gene time point of leaf and root，gene expression was different. Under drought stress，ZM08G14210 expression quantity was the highest. Under salt stress，ZM08G31890 expression quantity was the highest. Under low temperature stress，ZM06G25580 expression quantity was the highest. The results indicated that the ZMP5CS expression was induced by abiotic stress.

Key words：maize；delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthase（P5CS）；abiotic stress； expression analysis；semi-quantitative RT-PCR

中圖分類號(hào)：S503.4；Q559

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-874X（2016）02-0008-06

收稿日期：2015-08-03

基金項(xiàng)目：中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)（1630062014010，1630062015017，1630062015003）；海南省自然科學(xué)基金（20153134）

作者簡介：董晨（1981-），女，碩士，講師，E-mail：nysdongchen@sina.com

通訊作者：賈利強(qiáng)（1976-），男，博士，副研究員，E-mail：liqiangj@zju.edu.cn