宋能，譚楊，羅鳳玲，關(guān)清，閆明哲，潘勤，章曉聯(lián)Δ

(1.武漢大學(xué) 病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北省過敏及免疫相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院/武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)系，湖北 武漢 430071；2.武漢市醫(yī)療救治中心，湖北 武漢 430071)

微滴數(shù)字PCR定量檢測全血樣品中結(jié)核分枝桿菌特異CFP10基因

宋能1，譚楊1，羅鳳玲1，關(guān)清1，閆明哲2，潘勤1，章曉聯(lián)1Δ

(1.武漢大學(xué) 病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北省過敏及免疫相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院/武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)系，湖北 武漢 430071；2.武漢市醫(yī)療救治中心，湖北 武漢 430071)

目的 采用微滴數(shù)字PCR技術(shù)(droplet digital PCR, ddPCR)檢測全血中結(jié)核分枝桿菌特異性CFP10(10-kDa culture filtrate protein，CFP10)基因的拷貝數(shù)含量。方法 收集10例活動性肺結(jié)核患者(active tuberculosis，aTB)、10例肺外結(jié)核患者(extrapulmonary tuberculosis，EPTB)和5例健康對照者(healthy donars , HDs)全血并提取DNA，優(yōu)化引物最佳擴(kuò)增條件并制定重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線，對樣本中CFP10基因的拷貝數(shù)含量分別用ddPCR與實(shí)時定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)進(jìn)行檢測和比較。 結(jié)果 對重組質(zhì)粒的靈敏度檢測顯示ddPCR技術(shù)明顯優(yōu)于qPCR技術(shù)。對樣本的檢測顯示qPCR技術(shù)檢測aTB、EPTB患者與健康人的全血中CFP10含量之間無統(tǒng)計學(xué)意義；但是ddPCR技術(shù)檢測aTB、EPTB患者與健康人之間有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)； ddPCR檢測aTB和EPTB患者(共20例)CFP10 基因絕對定量的濃度約為3.4～94.0 copies/μL。結(jié)論 本研究首次報道采用ddPCR技術(shù)能靈敏地用于TB患者全血的診斷。

微滴數(shù)字PCR; 結(jié)核分枝桿菌；定量檢測；CFP10

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)，俗稱結(jié)核桿菌，是引起人結(jié)核病的主要病原菌。結(jié)核病目前仍是很多發(fā)展中國家需要面臨的公共健康問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2012年調(diào)查報告顯示，全球每年約有130萬人死于結(jié)核病[1]。目前全球有將近1/3的人感染過結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)，感染人數(shù)以每年800～1000萬的速度增加，每年有近300萬人死于結(jié)核病[2]。我國活動性肺結(jié)核人數(shù)高居世界第二位，是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家[1]。由于抗結(jié)核藥物的廣泛使用，多重耐藥結(jié)核桿菌 (multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)種類不斷增多，與此同時艾滋病與結(jié)核病聯(lián)合發(fā)病使得結(jié)核病的治療難度加大[3-6]。因而早期而明確的診斷對于結(jié)核病的治療、預(yù)后及傳播的控制具有極其重要的意義[7]。

目前臨床上應(yīng)用的結(jié)核病診斷技術(shù)主要有結(jié)核菌素純蛋白衍生物(protein purified derivative，PPD)試驗(yàn)、痰培養(yǎng)、抗酸染色、血清學(xué)抗體檢測方法[8]， 但是各有靈敏度低、耗時、或特異性差等缺點(diǎn)；采用痰涂片等抗酸染色檢測的檢出率僅約為33%[9]。由于血液中結(jié)核分枝桿菌含量極低，其難以血液樣本中結(jié)核基因進(jìn)行準(zhǔn)確檢測, 一般技術(shù)很難檢測到[10]。最近發(fā)展的實(shí)時定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)技術(shù)、干擾素(interferon-γ，IFN-γ)的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(enzyme-linked immunospot, ELISPOT)具有較快速、靈敏度高、特異性較強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)， IFN-γ的ELISPOT用于檢測結(jié)核患者外周血中淋巴細(xì)胞經(jīng)結(jié)核特異抗原CFP10和早期分泌性抗原(6-kDa early secreted antigenic target，ESAT-6) 刺激后釋放的IFN-γ水平； 但是qPCR技術(shù)檢測的是結(jié)核特異基因的含量，樣本通常僅限于患者痰液而不是血液(由于血液中結(jié)核菌含量很低)， 或?qū)ι贁?shù)免疫低下患者血液(血液中結(jié)核菌含量高于正常人含量)的檢測[11]， 由于痰液取樣均一性較差等因素造成診斷準(zhǔn)確性下降。 qPCR要求目的基因拷貝數(shù)相對較高，對目的基因做出相對定量分析[10]， 會出現(xiàn)假陽性(如探針保存不當(dāng)而部分降解)和假陰性結(jié)果(對于低拷貝數(shù)時)。并且在分析外源基因拷貝數(shù)時必須依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和已知拷貝數(shù)的基因，而標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備容易受各種因素的影響，故此法對診斷標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一性仍值得商榷[12]。

微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)是近年來興起的一種新的絕對定量的更靈敏技術(shù)，又稱為第三代PCR技術(shù)，是通過將微量樣品作大倍數(shù)稀釋和分液(partitioning) ， 通過極度稀釋實(shí)現(xiàn)理論上的單分子擴(kuò)增，然后用終點(diǎn)法PCR 和統(tǒng)計學(xué)中的泊松分布原理計算出樣品的原始濃度[13]。與qPCR方法相比，ddPCR兼具qPCR方法的優(yōu)點(diǎn)，其相對qPCR具有更高的靈敏度和更多元分析的能力，為臨床診斷提供獨(dú)特的分析優(yōu)勢，并且也不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[14-16]。ddPCR已經(jīng)報道用于檢測拷貝數(shù)很低的血液中HBV(hepatitis B virus，HBV)的檢測[17]，在復(fù)雜的異質(zhì)樣品中的稀有序列檢測方面具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢，能夠完成很多qPCR無法完成的檢測任務(wù)。目前，ddPCR已被用于病毒的分析及腫瘤分子標(biāo)志物稀有突變的檢測，與疾病相關(guān)的基因拷貝數(shù)變異檢測以及其他病原微生物的RNA檢測和基因表達(dá)分析等[18-20]。但是用于結(jié)核的診斷還未見報道，因而本研究采用ddPCR對結(jié)核患者全血DNA中結(jié)核特異CFP10基因拷貝數(shù)進(jìn)行檢測。

本研究以aTB患者、EPTB患者和健康人全血DNA為研究對象，選取結(jié)核分枝桿菌保守基因Rv3874(亦稱CFP10)基因序列，設(shè)計相應(yīng)引物及熒光探針，利用ddPCR方法定量檢測目的基因的含量，并與qPCR法進(jìn)行平行比較; 并采用 ddPCR法對結(jié)核患者全血DNA中CFP10拷貝數(shù)含量進(jìn)行絕對定量的檢測，以期探討用于結(jié)核病的診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 全血及患者來源：10例活動性肺結(jié)核患者(active tuberculosis， aTB)與10例肺外結(jié)核患者(extrapulmonary tuberculosis， EPTB)(HIV感染者已排除)的EDTA-Na2抗凝全血于2015 年7月在湖北省武漢市醫(yī)療救助中心檢驗(yàn)科收集。5名健康自愿者來自于武漢大學(xué)中南醫(yī)院。

1.1.2 菌株與試劑：引物及探針由(Invitrogen公司，美國)合成；pET-28a(+)-CFP10由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存)；結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由武漢大學(xué)ABSL-Ⅲ實(shí)驗(yàn)室保存并提供；大腸埃希菌E.coliDH5α·感受態(tài)菌種、pET-28a(+) 質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI(Fermentas公司，美國)；Ligation high高效連接酶(Toyobo公司，日本)；全血DNA提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒(Axygen公司，美國)；DNA Marker購于東盛生物公司。其他材料：TaqMan? Gene Expression Master Mix (ABI公司， 美國)、ddPCRTMSupermix for Probes、Droplet Generation Oil、Droplet Reader Oil (Bio-Rad公司， 美國)。

1.1.3 主要儀器：DU-730紫外分光光度計(Beckman公司，美國)；GelDoc-It310紫外凝膠成像系統(tǒng)(UVP Bioimaging system公司，美國)；PowerPacBasic DNA凝膠電泳儀(Bio-Rad公司 ，美國)；Pro-s PCR儀(Eppendorf公司， 德國)；Step One Plus 實(shí)時熒光定量PCR儀(ABI，美國)；Bio-Rad S1000 PCR儀、微滴數(shù)字PCR儀為QX 100TMDroplet Digital PCR 系統(tǒng)( Bio-Rad公司，美國，包括微滴生成儀、微滴讀取儀和QuantaSoft1.7.4結(jié)果分析軟件)。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的設(shè)計及優(yōu)化：根據(jù)結(jié)核分枝桿菌CFP10基因序列設(shè)計引物及探針，其序列分別為：上游引物P1：5’-AAGCAGCCAATAAGCAGAAGC-3’；下游引物P2：5’-AGCCCATTTGCGAGGACA-3’；探針：5’-FAM-GACGAATATTCGTCAGGCCGG-BQ1-3’。采用設(shè)計好的引物和探針建立qPCR方法，包括擴(kuò)增循環(huán)條件的優(yōu)化及引物和探針濃度的優(yōu)化。上游引物與下游引物在PCR反應(yīng)體系中的濃度分別為350 nmol/L，設(shè)置探針濃度分別為100、150、200、250、300、350、400和450 nmol/L，加入10 μL 2×TaqMan?Gene Expression Master Mix，pET-28a(+)-CFP10模板2 μL，用超純水補(bǔ)足至20 μL，然后進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件確定為: 95 ℃，5min預(yù)變性；95 ℃，15 s; 60 ℃，30 s，40個循環(huán)。

1.2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：qPCR反應(yīng)體系和條件：qPCR反應(yīng)體系為20 μL，包含10 μL 2×TaqMan?Gene Expression Master Mix，10 nmol/L 正向引物和反向引物各1 μL，10 nmol/L探針0.5 μL，DNA模板1 μL，用超純水補(bǔ)足至20 μL。qPCR使用2步擴(kuò)增法，程序如下：94 ℃，5 min預(yù)變性；94 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，共40個循環(huán)。每個模板重復(fù)3個平行擴(kuò)增，重復(fù)3 輪實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增結(jié)束后使用Step One Plus自帶軟件進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并獲得qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2值以及擴(kuò)增效率。ddPCR反應(yīng)體系和條件：ddPCR反應(yīng)包括4個步驟：配制體系、生成微滴、擴(kuò)增循環(huán)和信號讀取[21]。配制體系使用10 μL 2×ddPCRTMSupermix for Probes，正、反向引物各1 μL ，探針0.5 μL ，DNA模板1 μL，用超純水補(bǔ)足至20 μL。將配制好的20 μL PCR反應(yīng)液，轉(zhuǎn)移至微滴發(fā)生卡(DG8 cartridge)孔中，再加入70 μL微滴發(fā)生油(droplet generation oil)至oil孔中，利用QX100TM微滴式數(shù)字PCR儀的微滴生成器制備反應(yīng)微滴。將每個樣品的微滴分別轉(zhuǎn)移至96孔PCR反應(yīng)板中對應(yīng)的反應(yīng)孔中，用鋁膜熱封(180 ℃，5 sec)后，于普通PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，本實(shí)驗(yàn)的PCR擴(kuò)增是在Bio-Rad S1000 PCR儀上完成的，其中退火溫度是經(jīng)過溫度梯度優(yōu)化后的溫度。

ddPCR擴(kuò)增使用3步法，設(shè)置程序如下：95 ℃，10 min預(yù)變性；94 ℃變性30 s，60 ℃退火60 s，共45個循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行98 ℃、10 min的熱變性。每個模板重復(fù)3個平行檢測。將PCR擴(kuò)增后的96孔板放入QX100TM微滴式數(shù)字PCR儀的微滴分析器中，檢測FAM的熒光信號，96個樣品檢測用時約3 h。儀器會自動分析樣品的各微滴熒光信號，然后由QuantaSoft1.7.4完成對數(shù)據(jù)的自動處理。將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-CFP10進(jìn)行梯度倍比稀釋：109、108、107、106、105、104、103、102和10 copies/μL，各取以上倍比稀釋的重組質(zhì)粒DNA 2 μL分別用于qPCR和ddPCR，并將結(jié)果繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 qPCR法對樣本的檢測 應(yīng)用全血DNA提取試劑盒提取待檢測者的全血DNA，經(jīng)由紫外分光光度計測量OD260/OD280和瓊脂糖凝膠進(jìn)行質(zhì)量鑒定，DNA濃度為20 ng/μL,OD260/OD280=1.82。全血DNA的提取按Axygen公司試劑盒說明書操作。qPCR反應(yīng)體系為20 μL，包含10 μL 2×TaqMan? Gene Expression Master Mix，10 nmol/L 正向引物和反向引物各1 μL，10 nmol/L探針0.5 μL ，DNA樣本2 μL，用超純水補(bǔ)足至20 μL。qPCR 使用2步擴(kuò)增法(同2.2中qPCR 2步擴(kuò)增法)。擴(kuò)增結(jié)束后使用Step One Plus自帶軟件獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 ddPCR法對樣本的檢測 配制體系使用10 μL 2×ddPCRTMSupermix for Probes，正、反向引物各1 μL ，探針0.5 μL，DNA樣本2 μL(此樣本與方法2.3中所用樣本相同)，用超純水補(bǔ)足至20 μL。ddPCR 擴(kuò)增使用3步法(同2.2中ddPCR 3步擴(kuò)增法)。將PCR擴(kuò)增后的96孔板放入QX100TM微滴式數(shù)字PCR儀的微滴分析器中，檢測FAM的熒光信號，然后由Quanta Soft1.7.4完成對數(shù)據(jù)的自動處理。

2 結(jié)果

2.1 PCR探針最佳反應(yīng)濃度的確定 通過qPCR擴(kuò)增得到當(dāng)探針濃度為350 nmol /L時，熒光信號強(qiáng)度較高，且不再隨著濃度的增加而增加 ，見圖1。因而后續(xù)的PCR反應(yīng)采用的探針濃度均是350 nmol /L。

圖1 qPCR與ddPCR探針最佳濃度的確定 Fig.1 Determination of optimum concentration of probe for qPCR and ddPCR

2.2 qPCR探針法與ddPCR法對CFP10重組質(zhì)粒DNA的線性范圍分析 將pET-28a(+)-CFP10 重組質(zhì)粒DNA的濃度進(jìn)行梯度倍比稀釋：109、108、107、106、105、104、103、102、10和1copies/μL分別對應(yīng)S’10-S’1，結(jié)果顯示當(dāng)重組質(zhì)粒濃度達(dá)到102copies/μL以下時已偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線，說明qPCR最低檢測濃度是102copies/μL。 當(dāng)質(zhì)粒濃度在108、107、106、105、104、103、102copies/μL時qPCR對目的基因的檢測能準(zhǔn)確反映出相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=-3.324x+1.6459，R2=0.9997，擴(kuò)增效率(Efficiency)=99.91%，該qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線對重組質(zhì)粒測定濃度線性范圍為：109～102copies/μL，Ct值測定范圍為5.049～30.124，見圖2。

圖2 qPCR法對pET-28a(+)-CFP10重組質(zhì)粒線性范圍的測定Fig.2 Linearity range of qPCR for quantifying pET-28a(+)-CFP10 genomic DNA

ddPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線: 將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-CFP10進(jìn)行梯度倍比稀釋： 107、106、105、104、103、102、10和1.2 copies/μL對應(yīng)圖中S8～S1，各取以上倍比稀釋的重組質(zhì)粒DNA 2 μL用于ddPCR定量分析，其相關(guān)方程式為：y=0.9706x+0.0949，R2=0.9987，見圖3。結(jié)果顯示當(dāng)CFP10重組質(zhì)粒濃度稀釋達(dá)到1.2 copies/μL時仍保持著正相關(guān)性，說明ddPCR最低檢測濃度是1.2 copies/μL以下，因而其靈敏度高于qPCR的最低檢測濃度(102copies/μL)。

圖3 ddPCR法對pET-28a(+)-CFP10重組質(zhì)粒線性范圍的測定Fig.2B Linearity range of ddPCR for quantifying pET-28a(+)-CFP10 genomic DNA

2.3 qPCR對樣本的分析 圖4顯示10例aTB患者樣本 (圖4A)與10例EPTB患者(圖4B)目的基因CFP10的CT值分布為30.163～32.478均不在制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，故無法通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來準(zhǔn)確計算出其拷貝數(shù)，因而采用相對定量計算出10例aTB病人相對拷貝數(shù)為(2.948±0.5375)copies/μL，10例EPTB病人相對拷貝數(shù)(9.752±3.755)copies/μL，并分別與5例健康人(healthy donars,HDs)(1.455±0.1526)copies/μL比較算得t值分別為(t=1.929、t=1.549)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。用相對定量估算出各例病人其相對拷貝數(shù)值為1.47～8.8 copies/μL，見圖4。

圖4 qPCR法對10例aTB病人(A)10例EPTB病人(B)全血DNA中CFP10基因拷貝數(shù)的檢測Fig.4 qPCR analysis for CFP10 gene copies of whole blood DNA of aTB patients(A)and EPTB patients(B)

2.4 ddPCR對樣本的分析 在圖5A中(a)顯示3號EPTB患者的原始散點(diǎn)圖，其陽性微滴數(shù)值Pos: 1236, 說明是強(qiáng)陽性;(b)顯示了8號aTB患者的原始散點(diǎn)圖，其陽性微滴數(shù)值Pos: 36, 說明是弱陽性； (c)顯示的是健康人陰性對照散點(diǎn)圖; (d)顯示無模板陰性對照散點(diǎn)圖;(e)顯示陽性對照(CFP10重組質(zhì)粒)散點(diǎn)圖;(f)顯示所有樣本綜合散點(diǎn)圖。圖5B、C結(jié)果表明10例aTB病人拷貝數(shù)(16.47±1.942)copies/μL，10例EPTB病人相對拷貝數(shù)(44.99±5.586 )copies/μL，并分別與5例健康人(HDs)對照(0.1740±0.0267)copies/μL比較，算得t值分別為t=5.881與t=5.623，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)。ddPCR檢測aTB和EPTB病人(共20例)CFP10基因絕對定量的濃度范圍約為3.4～94.0 copies/μL，見圖5。

圖5 ddPCR法對TB患者樣本全血DNA中CFP10基因拷貝數(shù)的檢測A.原始微滴圖片 a ：強(qiáng)陽性病例(94.0 copies/μL) ； b：弱陽性病例(3.4 copies/μL) ； c：臨床陰性樣本； d：陰性對照； e：陽性對照； f：各樣本及對照綜合B. ddPCR法對10例aTB患者全血DNA中CFP10基因拷貝數(shù)檢測;C.ddPCR法對10例EPTB患者全血DNA中CFP10基因拷貝數(shù)檢測Fig.5 Measurement of CFP10 gene copies from whole blood samples of TB patients by ddPCR analysisA. Part of the original micro drop pictures, a: The strong positive cases copies/mu (94.0 copies/μL); b:Weak positive cases copies/mu (3.4 copies/μL); c: Clinical negative samples; d: Negative control; e:Positive control; f:All samples and comprehensive;B. ddPCR analysis for CFP 10 gene copies from whole blood DNA of aTB patients; C. ddPCR analysis for CFP10 gene copies from whole blood DNA of EPTB patients

3 討論

目前臨床上應(yīng)用的結(jié)核病診斷技術(shù)多種多樣， 當(dāng)靶標(biāo)序列含量很低時采用qPCR檢測技術(shù)往往無法獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，因此需要更加靈敏的方法檢測低含量的DNA。ddPCR作為一種新興的、準(zhǔn)確的定量技術(shù)，正大力推廣研究于DNA的絕對定量檢測中，尤其是對微量樣本的絕對定量[23-24]。目前國內(nèi)外有見報道通過ddPCR技術(shù)對病原微生物的檢測有很多，例如用于檢測拷貝數(shù)很低的血液中HBV的檢測[17]、對HIV感染者的檢測[25]、對沙眼衣原體的檢測[26]，植物病原菌的檢測[27]、手足口病的檢測[28]等，在對AIDS患者血液中HIV病毒檢測報道的核酸拷貝數(shù)可低至2 copies/μL，對HBV患者石蠟包埋肝組織提取的總DNA中能檢測到HBV病毒核酸拷貝數(shù)能低至6 copies/μL[17]，但對結(jié)核桿菌基因組的檢測還未見報道。本研究報道通過標(biāo)準(zhǔn)曲線采用ddPCR能檢測到CFP10拷貝數(shù)能低至1.2 copies/μL(圖3)。

本研究選取了編碼結(jié)核分枝桿菌CFP10基因?qū)儆谄銻D1 (Region of deletion 1)區(qū)的DNA序列，RD1區(qū)基因存在于結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(M.tuberculosisH37Rv)、非洲分枝桿菌(M.africanum)、牛分枝桿菌(M.bovis)等有毒菌株中。恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)、H37Ra中無此區(qū)域?；贓SAT-6、CFP10蛋白的IFN-γ的T-SPOT是世界范圍內(nèi)公認(rèn)的結(jié)核病確診的最重要診斷手段，在臨床檢測方面有獨(dú)特的優(yōu)勢，故選取檢測CFP10基因，其特異度強(qiáng)。ddPCR法對結(jié)果的判讀是基于反應(yīng)終點(diǎn)閱讀到的微滴的熒光信號強(qiáng)度，結(jié)合無模板對照和陰陽性對照劃出相應(yīng)的閥值，信號強(qiáng)度位于閥值之上的微滴判定為陽性微滴，位于閥值之下的微滴判定為陰性微滴，并利用泊松分布統(tǒng)計學(xué)公式計算出目的DNA分子濃度。本實(shí)驗(yàn)選取10例aTB患者和10例EPTB患者全血DNA用于ddPCR檢測與分析TB患者全血DNA測得特異性序列濃度范圍約為3.4 copies/μL ～ 94.0 copies/μL，以上結(jié)果表明，采用qPCR技術(shù)檢測aTB、EPTB患者與健康人的全血中結(jié)核特異基因CFP10含量之間無統(tǒng)計學(xué)意義；但是ddPCR技術(shù)檢測aTB、EPTB患者與健康人之間有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)。

ddPCR微滴化的過程可以實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)序列的富集，從而實(shí)現(xiàn)微量靶標(biāo)序列的檢測，即使在低豐度靶標(biāo)序列檢測時，也表現(xiàn)出較好的重復(fù)性。ddPCR技術(shù)與目前臨床上其他結(jié)核診斷技術(shù)相比具有快速、簡便、靈敏和特異性高的優(yōu)點(diǎn)，并能準(zhǔn)確監(jiān)測TB患者全血中結(jié)核桿菌特異性基因的絕對含量。綜上所述，ddPCR在結(jié)核病的全血診斷中具有很大應(yīng)用前景。

[1] Glaziou P, Sismanidis C, Floyd K, et al. Global epidemiology of tuberculosis[J]. Cold Spring Harb Perspect Med,2015,5(2):a17798.

[2] Lienhardt C, Glaziou P, Uplekar M, et al. Global tuberculosis control: lessons learnt and future prospects[J]. Nat Rev Microbiol,2012,10(6):407-416.

[3] Li WG, Zhao L, Zhao H. Epidemiology of HIV-Associated Tuberculosis in Urumqi, China[J]. Transplant Proc,2015,47(8):2456-2459.

[4] Kingkaew N, Sangtong B, Amnuaiphon W, et al. HIV-associated extrapulmonary tuberculosis in Thailand: epidemiology and risk factors for death[J]. Int J Infect Dis,2009,13(6):722-729.

[5] Glaziou P, Floyd K, Raviglione M. Global burden and epidemiology of tuberculosis[J]. Clin Chest Med,2009,30(4):621-636.

[6] Gao J, Zheng P, Fu H. Prevalence of TB/HIV co-infection in countries except China: a systematic review and meta-analysis[J]. PLoS One,2013,8(5):e64915.

[7] Vittor AY, Garland JM, Schlossberg D. Improving the diagnosis of tuberculosis: From QuantiFERON to new techniques to diagnose tuberculosis infections[J]. Curr HIV/AIDS Rep,2011,8(3):153-163.

[8] Mitchison DA. The diagnosis and therapy of tuberculosis during the past 100 years[J]. Am J Respir Crit Care Med,2005,171(7):699-706.

[9] 全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組. 2000年全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告[J]. 中國防癆雜志，2002(2)：3-46.

[10] Lima JF, Guedes GM, Lima JF, et al. Single-tube nested PCR assay with in-house DNA extraction for Mycobacterium tuberculosis detection in blood and urine[J]. Rev Soc Bras Med Trop,2015,48(6):731-738.

[11] Getahun H, Gunneberg C, Granich R, et al. HIV infection-associated tuberculosis: the epidemiology and the response[J]. Clin Infect Dis,2010,50( Suppl 3):S201-S207.

[12] Cankar K, Stebih D, Dreo T, et al. Critical points of DNA quantification by real-time PCR--effects of DNA extraction method and sample matrix on quantification of genetically modified organisms[J]. BMC Biotechnol,2006(6):37.

[13] Hindson BJ, Ness KD, Masquelier DA, et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number[J]. Anal Chem,2011,83(22):8604-8610.

[14] Sedlak RH, Cook L, Huang ML, et al. Identification of chromosomally integrated human herpesvirus 6 by droplet digital PCR[J]. Clin Chem,2014,60(5):765-772.

[15] Zhang BO, Xu CW, Shao Y, et al. Comparison of droplet digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring gene mutation[J]. Exp Ther Med,2015,9(4):1383-1388.

[16] Yang R, Paparini A, Monis P, et al. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples[J]. Int J Parasitol,2014,44(14):1105-1113.

[17] Huang JT, Liu YJ, Wang J, et al. Next generation digital PCR measurement of hepatitis B virus copy number in formalin-fixed paraffin-embedded hepatocellular carcinoma tissue[J]. Clin Chem,2015,61(1):290-296.

[18] Jones M, Williams J, Gartner K, et al. Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'[J]. J Virol Methods,2014(202):46-53.

[19] Zhao H, Wilkins K, Damon IK, et al. Specific qPCR assays for the detection of orf virus, pseudocowpox virus and bovine papular stomatitis virus[J]. J Virol Methods,2013,194(1-2):229-234.

[20] Brunetto GS, Massoud R, Leibovitch EC, et al. Digital droplet PCR (ddPCR) for the precise quantification of human T-lymphotropic virus 1 proviral loads in peripheral blood and cerebrospinal fluid of HAM/TSP patients and identification of viral mutations[J]. J Neurovirol,2014,20(4):341-351.

[21] Pinheiro LB, Coleman VA, Hindson CM, et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification[J]. Anal Chem,2012,84(2):1003-1011.

[22] Morisset D, Stebih D, Milavec M, et al. Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR[J]. PLoS One,2013,8(5):e62583.

[23] Sedlak RH, Jerome KR. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction[J]. Diagn Microbiol Infect Dis,2013,75(1):1-4.

[24] Mazaika E, Homsy J. Digital Droplet PCR: CNV Analysis and Other Applications[J]. Curr Protoc Hum Genet,2014(82):7-24.

[25] Persaud D, Gay H, Ziemniak C, et al. Absence of detectable HIV-1 viremia after treatment cessation in an infant[J]. N Engl J Med,2013,369(19):1828-1835.

[26] Roberts CH, Last A, Molina-Gonzalez S, et al. Development and evaluation of a next-generation digital PCR diagnostic assay for ocular Chlamydia trachomatis infections[J]. J Clin Microbiol,2013,51(7):2195-2203.

[27] Dreo T, Pirc M, Ramsak Z, et al. Optimising droplet digital PCR analysis approaches for detection and quantification of bacteria: a case study of fire blight and potato brown rot[J]. Anal Bioanal Chem,2014,406(26):6513-6528.

[28] Lui YL, Tan EL. Droplet digital PCR as a useful tool for the quantitative detection of Enterovirus 71[J]. J Virol Methods,2014(207):200-203.

(編校：王冬梅)

Sensitive and quantitative detection of specific CFP10 gene ofMycobacteriumtuberculosisin whole blood samples by droplet digital PCR

SONG Neng1, TAN Yang1, LUO Feng-ling1, GUAN Qing1, YAN Ming-zhe2, PAN Qin1, ZHANG Xiao-lian1Δ

(1.State Key Laboratory of Virology/Hubei Province Key Laboratory of Allergy and Immunology/ Medical Research Institute,Wuhan University/Department of Immunology, Wuhan University School of Basic Medical Sciences, Wuhan 430071, China; 2.Wuhan Medical Treatment Center, Wuhan 430071, China)

ObjectiveTo analyse content of mycobacterium tuberculosis (MTB) specific CFP10 gene copies from whole blood samples using droplet digital PCR (ddPCR) technique.MethodsWhole blood samples were collected from 10 activetuberculosis(aTB) patients, 10 extrapulmonarytuberculosis (EPTB)patients and 5 healthy donors (HDs), respectively. Total DNA from each blood samples were extracted. The optimal amplification conditions of the primers were optimized and the standard curves of CFP10 recombinant plasmids were established. 10-kDa culture filtrate protein (CFP10) gene copies from whole blood samples were determined and compared using ddPCR and quantitative real-time PCR (qPCR) techniques.ResultsResults showed that ddPCR had much higher sensitivity for measuring CFP gene than qPCR technique.Compared withHDs, there were significantly statistical differences between aTB and EPTB patients using ddPCR(P<0.0001), however there was no statistical significance using qPCR(P>0.05); The absolute quantitative concentration ranges of CFP10 gene in these 20 TB patients measured by ddPCR were about 3.4～94.0copies/μL.ConclusionsThis is the first report showing that ddPCR technique could used for diagnosis of TB patients from whole blood samples with high sensitive.

droplet digital PCR;Mycobacteriumtuberculosis(MTB); Tuberculosis (TB); CFP10

國家重大傳染病專項(2012ZX10003002)；國家自然科學(xué)基金項目(31270176，81471910)；國家杰出青年科學(xué)基金(81025008)

宋能，男，碩士在讀，研究方向：感染與分子免疫，E-mail：Soner2008@qq.com；章曉聯(lián)，通信作者，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：病原微生物與感染，E-mail：zhangxiaolian@whu.edu.cn。

R378.911

A

1005-1678(2016)02-0010-06