王海超，張乃鋒，柴建民，王　波，刁其玉

(中國農業(yè)科學院飼料研究所 農業(yè)部飼料生物技術重點實驗室，北京 100081)

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培育方式對雙胞胎湖羊羔羊肝基因表達的影響

王海超，張乃鋒，柴建民，王波，刁其玉*

(中國農業(yè)科學院飼料研究所 農業(yè)部飼料生物技術重點實驗室，北京 100081)

摘要：旨在研究培育方式對雙胞胎湖羊羔羊肝基因表達的影響。選取24對雙胞胎湖羊公羔羊，采用配對試驗設計，將每對雙胞胎羔羊均勻分成兩組，一組為試驗組，7日齡后實行人工哺育代乳粉(Artificially reared，AR)；另一組為對照組，進行隨母哺乳(Ewe reared，ER)，每組24只羔羊。兩組羔羊均在60日齡斷奶，之后飼喂開食料至90日齡。羔羊在60和90日齡時，分別隨機選取3對雙胞胎羔羊進行屠宰。用基因芯片技術和生物信息學的方法分析肝組織的差異表達基因。通過基因芯片分析，本試驗發(fā)現了許多差異表達基因。AR組和ER組間差異表達基因在60和90日齡都發(fā)生改變的基因有7個，它們是OR1E2、S1PR3、KMO、APOA4、ORM2、HTR4和FADS1；60和90日齡間的差異表達基因在AR組和ER組中表達也發(fā)生變化的基因有20個，它們是ACO1、HBA1、MFSD2A、CYSJ、LOC785954、FCN、GRB2、LOC100037663、ORM2、RXRG、LOC100602447、SQLE、HSD17B2、CYP4F2、INHBE、EAAT2，其中有4個未知基因，探針號為14780690、14815720、14845504、14854080；在不同日齡和不同處理中，表達均發(fā)生改變的基因是ORM2。GO功能顯著性富集分析發(fā)現，這些差異表達基因主要參與氨基酸、小分子化合物和有機酸代謝的生物過程、酶活性反應生物過程和免疫反應過程。KEGG代謝途徑分析發(fā)現，這些差異表達基因主要參與氨基酸代謝、脂類代謝、激素合成和信號轉導途徑。綜上所述，不同的培育方式導致肝的基因表達發(fā)生了改變，發(fā)現了肝差異表達基因參與的生物學過程及其發(fā)揮的生物學功能，初步揭示了羔羊早期培育的分子機理。

關鍵詞：雙胞胎羔羊；早期斷奶；代乳粉；差異表達基因；基因芯片

隨著人類基因組計劃(Human genome project，HGP)的完成，研究人員將重點聚焦在基因功能的研究上。而以高通量為主要特點的基因芯片技術的出現，使科學家能夠高效快捷地實現這一宏偉目標。1991年，美國Affymetrix公司生產的第一塊原位雜交合成的寡聚核苷酸基因芯片問世[1]。1994年，美國斯坦福大學E.M.Southern等用直接點樣法成功制備出第一塊cDNA微陣列芯片[2]。從此，基因芯片技術便迅速得到普及和推廣?；蛐酒目焖侔l(fā)展使人們能夠深入剖析生命現象，從DNA水平研究生命機理。1998年，基因芯片技術被美國科學促進會(America association for the advancement of science，AAAS)評為1998年度世界自然科學領域十大科技突破之一[3]。2001年，美國國家牛功能基因組研究協(xié)會第一次應用芯片對牛刀豆球蛋白A (Concanavalin A)刺激的外周血單核細胞開展研究后[4]，人們開始利用芯片技術對反芻動物的胚胎發(fā)育機理[5]、組織特異性表達基因[6]、免疫機理[7]、營養(yǎng)分子機理[8]進行探索。2005 年，Y.H.Wang 等[9]通過對日本和牛與荷斯坦牛背最長肌差異基因進行分析，獲得影響肉質和脂肪代謝的候選基因。生物信息網絡數據庫能夠將基因芯片所挖掘的數據信息轉換為生命的語言，賦予其生物學意義?；蛐酒夹g和生物信息學方法成為研究系統(tǒng)生物學的主要工具和方法[10]。

湖羊是世界上著名的多胎綿羊品種之一，平均產羔率達220%，產雙胞胎的幾率很高。雙胞胎具有相似的遺傳背景，在這個具有純化性的先天因素條件下，后天環(huán)境對雙胞胎表達出的不同征候或者表型的影響能夠清晰的體現出來，有利于對影響因子進行詳細剖析[11]。雙胞胎動物以其得天獨厚的優(yōu)越條件成為一種非常理想的試驗模型。本試驗選用雙胞胎湖羊羔羊作為試驗動物，通過比較屠宰試驗方法，采用基因芯片的手段對肝樣品的差異表達基因進行生物信息學分析，測定肝基因表達的變化情況，初步探討營養(yǎng)素對羔羊早期生長發(fā)育和代謝調控等生命活動的影響，為羔羊早期培育的營養(yǎng)調控提供科學理論基礎。

1材料與方法

1.1 試驗時間和地點

本試驗于2013年10月—2014年2月在江蘇省姜堰市海倫羊業(yè)有限公司進行。

1.2試驗設計

本試驗采用配對試驗設計，選取發(fā)育正常，出生日齡和體重相近，遺傳基礎相同的雙胞胎湖羊羔羊24對。將每對雙胞胎羔羊均勻的分成兩組，一組為試驗組，7日齡后實行人工哺育代乳粉(Artificial reared，AR)；另一組為對照組，進行隨母哺乳(Ewe reared，ER)，每組24只羔羊。兩組羔羊均于60日齡斷奶，之后飼喂開食料至90日齡。羔羊在60和90日齡時，分別隨機選取3對雙胞胎羔羊進行屠宰試驗。

1.3試驗日糧

試驗所需代乳粉由中國農業(yè)科學院飼料研究所提供，代乳粉的主要成分參照我國發(fā)明專利ZL 201210365927.6 “中0～3月齡羔羊的代乳品及其制備方法”[12]。試驗中的代乳粉和開食料的營養(yǎng)水平見表1。

1.4飼養(yǎng)管理

羊舍為半開放式暖棚，通風良好。所有試驗羔羊均打耳號，并按照羊場的正規(guī)程序進行免疫和消毒。試驗組羔羊自出生至7日齡隨母羊哺乳，8日齡時開始由母羊哺乳逐漸過渡到飼喂代乳粉，至10日齡時完全飼喂代乳粉。羔羊在11～50和51～60日齡期間，代乳粉的飼喂量分別以體重的2.0%和 1.5%為標準[13]。在試驗過程中，根據羔羊的采食和健康狀況調整代乳粉的飼喂量。30日齡前，每日飼喂3次(07:00、13:00和19:00)，31～60日齡每日飼喂兩次(08:00和18:00)。代乳粉飼喂前用煮沸后冷卻至50 ℃的熱水按代乳粉∶水=1∶5的比例沖泡，再冷卻至(40±1) ℃飼喂。每次飼喂后及時用干凈的毛巾將羔羊嘴邊的乳液擦拭干凈。對照組羔羊每日在上述時間和母羊接觸一次哺乳，每次10 min。試驗羔羊均于15日齡開始訓練采食相同的開食料，自由采食和飲水。

表1代乳粉和開食料的營養(yǎng)水平(干物質基礎)

Table 1Nutrient levels of milk replacer and starter(DM basis)

%

表中所列項目均為實測值。配方由于涉及專利內容，未公開

The items in the table were measured values.The formulas involved in patent could not be opened to the public

1.5樣品采集

羔羊在60和90日齡時，分別隨機選取3對雙胞胎羔羊于清晨08:00進行屠宰。宰前16 h禁水禁食。試驗羊經二氧化碳氣體致暈后，頸脈放血屠宰。羔羊解剖后將肝分離，在處理組和對照組的羔羊肝相同的位置分別取肝組織樣品，用生理鹽水沖洗干凈后放到預先標記好的1.5 mL凍存管中，并迅速置于液氮中速凍，運到實驗室后存放到-80 ℃冰箱中備用。

1.6總RNA的提取

用化學有機試劑法提取綿羊肝組織的總RNA，然后分別用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測所提RNA的質量。

1.7芯片操作

對于1%瓊脂糖凝膠電泳初步質檢合格的樣品，進一步測定該樣品的總RNA濃度，并將全部樣品的總RNA液均稀釋至濃度為2.0 μg·μL-1。以兩兩配對為設計原則，采用Affmetrix綿羊組織基因芯片對不同處理和不同日齡的羔羊肝組織中的表達基因進行檢測，芯片試驗操作由北京博奧生物有限公司按照Affmetrix表達分析技術手冊完成。

1.8基因芯片的數據分析

采用Affymetrix GeneChip?Scanner 3000掃描儀對雜交芯片進行掃描，掃描的圖像結果被保存成.DAT文件，然后將.DAT 文件轉存為.JPG 圖片文件。接著用Affymetrix AGCC軟件將圖像信號(.DAT文件)轉化為數字信號(.CEL文件)，.CEL文件記錄每個探針(Probe) 的熒光信號強度。然后用RMA算法[14]對原始數據進行預處理。用cluster 3.0軟件進行聚類分析，并用Treeview軟件進行可視化。

1.9差異表達基因的篩選

按照S.Audic等[15]提出的方法篩選差異表達基因。按照Y.Benjamini等[16]提出的錯誤發(fā)現率(False discovery rate，FDR) 對P值進行多重假設檢驗校正，記為q值(qvalue)。本試驗采用的差異表達基因篩選標準是q<0.05，并且差異倍數(Fold change)>2[17]，差異表達倍數計算方法為同一個基因在兩個樣本中表達量比值的log2對數。

1.10差異表達基因的GO功能分析和通路分析

利用DAVID(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)在線分析系統(tǒng)(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)對差異表達基因進行基因注釋(基因基本信息來源于NCBI Entrez Gene 數據庫，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)、GO功能聚類分析(Gene Ontology數據庫，http://www.geneontology.gov/)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析(http://www.genome.jp/kegg/)。

2結果

2.1 RNA質檢結果

經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，從圖1中可以看到，電泳條帶總體比較清晰，部分RNA 樣品略有降解，28S rRNA與18S rRNA 條帶亮度的比值接近1∶1或更大。另外，分光光度計的結果顯示，提取的總RNA的A260 nm/A280 nm比值為1.9～2.1，質量基本符合表達譜芯片的試驗要求。

2.2芯片質檢結果

通過對芯片中檢測到的表達基因進行統(tǒng)計，不同芯片中的基因檢出率為50%～60%(表2)，最低檢出率為53.78%，最高檢出率達到57.33%，符合芯片試驗的結果。芯片表達譜的聚類分析顯示(圖2)，60日齡時的兩個不同處理聚在了一起，90日齡的兩個不同處理聚在了一起，這符合試驗分組和處理的要求。

2.3差異表達基因的篩選

60日齡時，代乳粉組和母乳組(60ARvs60ER)差異表達的基因有60個，其中33個基因表達上調，27個基因表達下調；90日齡時，代乳粉組和母乳組(90ARvs90ER)差異表達的基因有80個，其中58個基因表達上調，22個基因表達下調；代乳粉組中，60日齡和90日齡相比(60ARvs90AR)，差異表達的基因有102個，其中64個基因表達上調，38個基因表達下調；母乳組中，60日齡和90日齡相比(60ERvs90ER)，差異表達的基因有76個，其中49個基因表達上調，27個基因表達下調(圖3)。

表2基因芯片檢出率

Table 2The call rate of gene in microarray

樣品號SampleID未檢出Absent檢出Present檢出率/%Callrate949193671258457.339715100291192254.31974194461250556.97949395081244356.699625101081184353.95969396931225855.848159101461180553.78968196251232656.15970795501240156.498157101021184953.98961596401231156.08967597361221555.65

圖1　湖羊肝總RNA電泳圖Fig.1　The electrophoregram of total RNA in Hu sheep

圖2　芯片表達譜聚類熱圖Fig.2　The heat map of microarray clustering

A是60日齡時，代乳粉組與母乳組的差異表達基因；B是90日齡時，代乳粉組與母乳組的差異表達基因；C是母乳組中，60日齡與90日齡的差異表達基因；D是代乳粉組中，60日齡與90日齡的差異表達基因。紅點表示上調表達基因，綠點表示下調表達基因，黑點表示基因表達無差異A.DEGs of 60AR vs 60ER；B.DEGs of 90AR vs 90ER；C.DEGs of 60ER vs 90ER；D.DEGs of 60AR vs 90AR.Dots in red mean up regulated genes；Dots in green mean down regulated genes；Dots in black mean no differences圖3　差異表達基因散點圖Fig.3　Scatter plot of differentially expressed genes

由韋恩圖(圖4)可以看出，在60日齡時，AR組和ER組的差異表達基因中有7(=1+2+4)個基因在90日齡的不同處理之間也發(fā)生了改變，它們是OR1E2、S1PR3、KMO、APOA4、ORM2、HTR4和FADS1。組間差異基因APOA4在60日齡時表達上調，在90日齡時表達下調。而組間差異基因ORM2則相反，它在60日齡時表達下調，在90日齡時表達上調。組間差異基因S1PR3和HTR4的表達在不同日齡中的表達均上調，OR1E2、KMO和FADS1的表達在不同日齡中的表達均下調(表3)；在AR組中，60日齡和90日齡的差異表達基因中有20(=15+2+2+1)個基因在ER組的不同日齡中也發(fā)生了改變，其中有4個基因尚不清楚其符號(Gene symbol)和功能，它們的探針號分別為14780690、14815720、14845504、14854080，其他的16個基因是ACO1、HBA1、MFSD2A、CYSJ、LOC785954、FCN、GRB2、LOC100037663、ORM2、RXRG、LOC100602447、SQLE、HSD17B2、CYP4F2、INHBE、EAAT2。不同日齡差異表達基因ORM2和LOC100602447在AR組中上調表達，在ER組中下調表達。而MFSD2A在AR組中下調表達，在ER組中上調表達。CYSJ、FCN、RXRG、SQLE、HSD17B2、CYP4F2、INHBE和EAAT2在不同處理組之間的表達均上調，ACO1、HBA1、LOC785954、LOC100037663和4個未知的基因在不同處理組之間的表達均下調(表4)；在不同日齡和不同處理中，表達均發(fā)生改變的基因是ORM2。2.4差異表達基因的GO分析

通過GO(Gene ontology)功能顯著性分析，結果發(fā)現，60日齡時，AR組和ER組的差異表達基因參與的生物學過程主要是氨基酸分解代謝過程、小分子分解代謝過程、有機酸代謝過程和胺代謝過程等(表5)；90日齡時，AR組和ER組的差異表達基因參與的生物學過程包括炎癥反應過程、脂蛋白代謝過程和免疫反應過程等(表6)；AR組中，60和90日齡差異表達的基因參與的生物過程包括胰核糖核酸酶活性反應過程、單氧化酶活性反應過程、離子結合過程和蛋白酶活性反應過程等(表7)；ER組中，60和90日齡差異表達的基因參與的生物過程包括底物跨膜過程、離子交換過程、電子傳遞過程和有機酸跨膜轉運過程等(表8)。

2.5差異表達基因的Pathway分析

對差異表達基因進行KEGG pathway 代謝途徑顯著性富集分析。結果發(fā)現，在60日齡時，AR組和ER組的差異表達基因參與的生物學途徑主要是甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑、色氨酸代謝途徑、鞘糖脂生物合成途徑、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝途徑以及糖類的消化和吸收(表9)；90日齡時，AR組和ER組的差異表達基因參與的生物學途徑主要是固醇類激素生物合成途徑、氨基糖和核苷酸糖代謝途徑、谷胱甘肽代謝途徑、細胞色素P450介導的藥物代謝途徑、P53信號途徑、神經活性腺體受體互作途徑(表10)；AR組中，60和90日齡差異表達的基因參與的生物途徑主要是花生四烯酸代謝途徑、氨基糖和核苷酸糖代謝途徑、固醇類激素生物合成途徑和膽汁分泌途徑(表11)；ER組中，60和90日齡差異表達基因參與的生物途徑主要是PPAR信號途徑、固醇生物合成途徑、膽汁分泌途徑、萜類化合物骨架生物合成途徑、卟啉代謝途徑、固醇類激素生物合成途徑、視黃醇代謝途徑和細胞色素P450介導的外源性物質代謝途徑(表12)。

圖4　差異表達基因韋恩圖Fig.4　Venny view of differentially expressed genes

表3不同處理組的差異表達基因在不同日齡時表達也發(fā)生改變的基因

Table 3Differentially expressed genes in both 60ARvs60ER and 90ARvs90ER

探針號ProbeID基因Gene基因描述Description60ARvs60ER90ARvs90ER倍數變化Foldchange+/-倍數變化Foldchange+/-14731708OR1E2olfactoryreceptor1E22.0383-3.2227-14732242S1PR3sphingosine1-phosphatereceptor34.2149+3.5249+14790803KMOkynurenine3-monooxygenase2.2528-2.2594-14791676APOA4apolipoproteinA-IV11.4418+3.1908-14833655ORM2orosomucoid22.4450-3.8018+14840715HTR45-hydroxytryptaminereceptor43.5515+3.5279+14876903FADS1fattyaciddesaturase12.3004-2.2316-

“+” 表示表達上調；“-” 表示表達下調。下同

“+” means up regulated；“-” means down regulated.The same as below

表4不同日齡的差異表達基因在不同處理組之間表達也發(fā)生改變的基因

Table 4Differentially expressed genes in both 60ARvs90AR and 60ERvs90ER

探針號ProbeID基因Gene基因描述Description60ARvs90AR60ARvs90ER倍數變化Foldchange+/-倍數變化Foldchange+/-14709484ACO1aminocyclopropanecarboxylateoxidase2.2952-2.0665-14725669HBA1hemoglobinsubunitalpha6.4061-10.1112-14756654MFSD2Amajorfacilitatorsuperfamilydomaincontaining2A2.0020-3.8621+14758027CYSJsulfitereductase(NADPH)flavoproteinalpha-component2.6658+2.0501+14773310LOC785954smallsubunitribosomalproteinS10e2.2952-2.5602-14776443FCNficolin2.2309+2.2194+14780690NULLnull3.5224-3.8595-14785130GRB2growthfactorreceptor-bindingprotein22.5634-2.2665-14809531LOC100037663glutathionetransferaseM32.2619-2.0670-14815720NULLnull4.1477-5.9312-14833655ORM2orosomucoid3.4285+2.7115-14845504NULLnull7.6394-5.7670-14850419RXRGretinoidXreceptorgamma3.7414+2.3365+14854080NULLnull2.9214-3.3807-14854806LOC100602447serumamyloidAprotein-like2.6755+2.5259-14858743SQLEsqualenemonooxygenase2.1339+6.5550+14862677HSD17B2estradiol17beta-dehydrogenase2.4498+3.5070+14865413CYP4F2cytochromeP4503.2780+3.9278+14885536INHBEinhibin,betaE2.2869+2.2567+14887970EAAT2excitatoryaminoacidtransporter210.4228+2.1005+

null表示暫無基因信息

null mean no gene information found

表560日齡AR組和ER組差異表達基因最顯著富集的10個GO條目

Table 5Top 10 significantly enriched GO terms at 60ARvs60ER

GO號和條目GOIDandterms基因符號GenesymbolP值PvalueGO:0043436//oxoacidmetabolicprocessACMSD;AFMID;KMO;LOC100297420;SDS;GNMT;IDNK;ELOVL7;LPIN1;FADS1;GLCE;DDAH13.85E-06GO:0006082//organicacidmetabolicprocessACMSD;AFMID;KMO;LOC100297420;SDS;GNMT;IDNK;ELOVL7;LPIN1;FADS1;GLCE;DDAH14.70E-06GO:0019752//carboxylicacidmetabolicprocessACMSD;AFMID;KMO;LOC100297420;SDS;GNMT;IDNK;ELOVL7;LPIN1;FADS1;DDAH19.11E-06GO:0016054//organicacidcatabolicprocessAFMID;KMO;SDS;IDNK;LPIN1;DDAH12.29E-05GO:0046395//carboxylicacidcatabolicprocessAFMID;KMO;SDS;IDNK;LPIN1;DDAH12.29E-05GO:1901605//alpha-aminoacidmetabolicprocessAFMID;KMO;LOC100297420;SDS;GNMT;DDAH14.19E-05GO:0044282//smallmoleculecatabolicprocessAFMID;KMO;SDS;IDNK;LPIN1;DDAH11.24E-04GO:0044712//single-organismcatabolicprocessAFMID;KMO;SDS;IDNK;LPIN1;DDAH11.24E-04GO:0046874//quinolinatemetabolicprocessACMSD;KMO1.85E-04GO:1901606//alpha-aminoacidcatabolicprocessAFMID;KMO;SDS;DDAH11.91E-04

表690日齡AR組和ER組差異表達基因最顯著富集的10個GO條目

Table 6Top 10 significantly enriched GO terms at 90ARvs90ER

GO號和條目GOIDandterms基因符號GenesymbolP值PvalueGO:0006953//acute-phaseresponseORM2;ENSBTAP00000030311-D2;ENSBTAP00000052221-D4;SAA14.45E-06GO:0006954//inflammatoryresponseENSBTAP00000030311-D2;ENSBTAP00000052221-D4;S1PR3;CHI3L1;ORM2;SAA1;CXCL102.71E-05GO:0002526//acuteinflammatoryresponseORM2;ENSBTAP00000030311-D2;ENSBTAP00000052221-D4;SAA13.99E-05GO:0034364//high-densitylipoproteinparticleAPOA4;ENSBTAP00000030311-D2;ENSBTAP00000052221-D4;SAA11.5E-06GO:0034358//plasmalipoproteinparticleAPOA4;ENSBTAP00000030311-D2;ENSBTAP00000052221-D4;SAA18.22E-06GO:0005615//extracellularspaceENPP2;PAI-1;CHI3L1;APOA4;ORM2;ENSBTAP00000030311-D2;ENSBTAP00000052221-D4;SAA1;LCN2;CRELD2;CXCL108.83E-06GO:0032994//protein-lipidcomplexENSBTAP00000030311-D2;ENSBTAP00000052221-D4;APOA4;SAA19.4E-06GO:0005576//extracellularregionENPP2;PAI-1;AGR2;IL1R1;CHI3L1;APOA4;ENSBTAP00000030311-D2;ENSBTAP00000052221-D4;ORM2;RNASE12;BRB;SAA1;MANF;LCN2;CES4A;CRELD2;CXCL102.12E-05GO:0044421//extracellularregionpartENPP2;PAI-1;CHI3L1;APOA4;ORM2;ENSBTAP00000030311-D2;ENSBTAP00000052221-D4;SAA1;LCN2;CRELD2;CXCL101.41E-04GO:0006955//immuneresponseENPP2;BCL6;IL1R1;ENSBTAP00000031029-D2;APOA4;IL18BP;SAA1;LCN2;CXCL102.4E-04

表7AR組60和90日齡差異表達基因最顯著富集的10個GO條目

Table 7Top 10 significantly enriched GO terms at 90ARvs60AR

GO號和條目GOIDandterms基因符號GenesymbolP值PvalueGO:0004522//pancreaticribonucleaseactivityRNASE12;ENSBTAP00000036091-D2;BRB8.63E-05GO:0004497//monooxygenaseactivityLOC537017;ENSBTAP00000050244-D2;CYP7A1;SQLE;CYP4F29.78E-05GO:0016892//endoribonucleaseactivity,produ-cing3-phosphomonoestersRNASE12;ENSBTAP00000036091-D2;BRB1.25E-04GO:0016894//endonucleaseactivity,activewitheitherribo-ordeoxyribonucleicacidsandprodu-cing3-phosphomonoestersRNASE12;ENSBTAP00000036091-D2;BRB2.65E-04GO:0008235//metalloexopeptidaseactivityDPEP1;CPM;CPXM14.31E-04GO:0016705//oxidoreductaseactivity,actingonpaireddonors,withincorporationorreductionofmolecularoxygenLOC537017;ENSBTAP00000050244-D2;CYP7A1;SQLE;CYP4F28.28E-04GO:0051787//misfoldedproteinbindingDNAJB9;DNAJC38.29E-04GO:0005506//ironionbindingCYP7A1;ENSBTAP00000050244-D2;HBA1;CYP4F2;LCN29.46E-04GO:0002020//proteasebindingPAI-1;IL1R1;LCN21.10E-03GO:0004521//endoribonucleaseactivityRNASE12;ENSBTAP00000036091-D2;BRB1.38E-03

表8ER組60和90日齡差異表達基因最顯著富集的10個GO條目

Table 8Top 10 significantly enriched GO terms at 90ERvs60ER

GO號和條目GOIDandterms基因符號GenesymbolP值PvalueGO:0005310//dicarboxylicacidtransmembranetransporteractivitySLC26A8;SLC13A3;SLC38A7;EAAT23.65E-07GO:0022892//substrate-specifictransporteractivityGABRG1;HBA1;SLC28A1;APOA4;SLC26A8;SLC13A3;LOC100509620;SLC38A7;EAAT21.72E-05GO:0004497//monooxygenaseactivityCYP51A1;LOC511498;SQLE;CYP4F2;MSMO13.72E-05GO:0022891//substrate-specifictransmembranetransporteractivityGABRG1;SLC28A1;SLC26A8;SLC13A3;LOC100509620;SLC38A7;EAAT26.08E-05GO:0015075//iontransmembranetransporteractivityGABRG1;SLC28A1;SLC26A8;SLC13A3;SLC38A7;EAAT21.54E-04GO:0016709//oxidoreductaseactivity,actingonpaireddonors,withincorporationorreductionofmolecularoxygen,NAD(P)Hasonedonor,andincorporationofoneatomofoxygenCYP51A1;SQLE;MSMO11.67E-04GO:0046943//carboxylicacidtransmembranetransporteractivitySLC26A8;SLC13A3;SLC38A7;EAAT21.73E-04GO:0005342//organicacidtransmembranetransporteractivitySLC26A8;SLC13A3;SLC38A7;EAAT22.08E-04GO:0008324//cationtransmembranetransporteractivitySLC28A1;SLC13A3;SLC38A7;EAAT22.21E-04GO:0008514//organicaniontransmembranetransporteractivitySLC26A8;SLC13A3;SLC38A7;EAAT22.48E-04

表960日齡AR組和ER組差異表達基因顯著富集的途徑

Table 9The significantly enriched pathways of DEGs at 60ARvs60ER

KEGG號和通路KEGGIDandpathway基因符號GenesymbolP值Pvalueko00260Glycine,serineandthreoninemetabolismLOC100297420;SDS;GNMT0.0014ko00380TryptophanmetabolismACMSD;AFMID;KMO0.0023ko00601Glycosphingolipidbiosynthesis-lactoandneolactoseriesB3GALT5;ST3GAL40.0092ko00270CysteineandmethioninemetabolismLOC100297420;SDS0.0214ko04973CarbohydratedigestionandabsorptionTFF2;SLC2A50.0214

表1090日齡AR組和ER組差異表達基因顯著富集的途徑

Table 10The significantly enriched pathways of DEGs at 90ARvs90ER

KEGG號和通路KEGGIDandpathway基因符號GenesymbolP值Pvalueko00140SteroidhormonebiosynthesisHSD17B14;ENSBTAP00000030543-D14;LOC7857620.0019ko00520Aminosugarandnucleotidesugarme-tabolismLOC537017;CHI3L1;AMIGO30.0078ko05146AmoebiasisSERPINI2;IL1R1;MCTP20.0159ko00480GlutathionemetabolismENSP00000420168-D2;AGR20.0295ko00982Drugmetabolism-cytochromeP450ENSP00000420168-D2;FMO50.0435ko04115p53signalingpathwayPAI-1;STEAP40.0446ko04080Neuroactiveligand-receptorinteractionGABRG1;S1PR3;GRIA1;ENSBTAP000000530180.0452

表11AR組60和90日齡差異表達基因顯著富集的途徑

Table 11The significantly enriched pathways of DEGs at 90ARvs60AR

KEGG號和通路KEGGIDandpathway基因符號GenesymbolP值Pvalueko00590ArachidonicacidmetabolismENSBTAP00000040874-D5;CYP4F2;LCN20.0076ko00520Aminosugarandnucleotidesugarme-tabolismLOC537017;CHI3L1;AMIGO30.0130ko00140SteroidhormonebiosynthesisCYP7A1;HSD17B20.0359ko04976BilesecretionCYP7A1;NR0B20.0412

表12ER組60和90日齡差異表達基因顯著富集的途徑

Table 12The significantly enriched pathways of DEGs at 90ERvs60ER

KEGG號和通路KEGGIDandpathway基因符號GenesymbolP值Pvalueko03320PPARsignalingpathwayCPT1B;PLIN2;GK;LOC100509620;RXRG0.0003ko00100SteroidbiosynthesisCYP51A1;SQLE;MSMO10.0014ko00900TerpenoidbackbonebiosynthesisENSBTAP00000036625;HMGCR0.0040ko00860PorphyrinandchlorophyllmetabolismALAS2;UGT2B150.0323ko00140SteroidhormonebiosynthesisUGT2B15;HSD17B20.0375ko00830RetinolmetabolismUGT2B15;LOC5114980.0488ko00980MetabolismofxenobioticsbycytochromeP450UGT2B15;LOC5114980.0503

3討論

基因芯片技術是研究差異表達基因的有效手段，在本試驗中發(fā)現了許多差異表達基因。60日齡時，代乳粉組和母乳組(60ARvs60ER)差異表達的基因有60個；90日齡時，代乳粉組和母乳組(90ARvs90ER)差異表達的基因有80個；代乳粉組中，60和90日齡相比(60ARvs90AR)差異表達的基因有102個；母乳組中，60和90日齡相比(60ERvs90ER)差異表達的基因有76個。

酸性糖蛋白(ORM2)主要在肝中合成，是炎癥反應急性期的一個關鍵蛋白，存在于人、大鼠、小鼠以及其他的哺乳動物中。當機體組織受到傷害、發(fā)生炎癥或受到感染，酸性糖蛋白的濃度會相應的升高[18]。本研究中，ORM2基因在不同的處理組之間以及不同的日齡中，其表達均發(fā)生了改變。60日齡時，ORM2在AR組中下調表達；90日齡時，ORM2在AR組中上調表達。說明飼喂代乳粉能夠增強羔羊免疫力和對外界惡劣環(huán)境的抵抗力。斷奶后，羔羊的抵抗力降低。X.Zhang 等[19]對人類結直腸癌的研究表明，ORM2基因的選擇性表達使其成為診斷腸癌的一個潛在的生物標記基因。載脂蛋白A4(APOA4)主要在哺乳動物的小腸中表達，在小鼠和大鼠的肝中也有表達。載脂蛋白合成后分泌到血液中吸附在新生成的乳糜微粒的表面。脂肪在小腸的吸收能夠促進APOA4的合成和分泌。本試驗中，APOA4在60日齡時表達上調，在90日齡時表達下調。說明60日齡時，脂肪的吸收比較充分。斷奶后，脂肪的吸收相對下降，這也說明代乳粉的脂肪含量比后期的母乳要充足，能夠滿足羔羊的生長需要。在體外試驗中，APOA4能夠激活卵磷脂-膽固醇脂?；D移酶和膽固醇轉移蛋白[20]。磷酸神經胺受體3(S1PR3)是G蛋白偶聯(lián)受體EDG受體家族成員之一，可能的功能是調節(jié)血管再生和血管內皮細胞[21]。5-羥色胺受體4(HTR4)是G蛋白偶聯(lián)受體5-羥色胺受體家族成員之一，能夠與5-羥色胺結合刺激cAMP的產生。該受體在中樞神經系統(tǒng)和外周神經系統(tǒng)中合成一種糖基化的跨膜轉運蛋白，能夠調節(jié)許多神經傳遞素的釋放。神經胺和5-羥色胺都是機體內神經活性物質，在本試驗中，在60和90日齡時，AR組的表達較ER組均上調，說明羔羊的神經活動在加強，神經系統(tǒng)發(fā)育比較活躍，代乳粉能促進羔羊神經系統(tǒng)的發(fā)育。興奮性氨基酸轉運子2(EAAT2)是蛋白質溶質運載體家族成員之一，能夠清除中樞神經細胞樹突周圍的興奮性傳遞素谷氨酸鹽。谷氨酸鹽的清除有利于特定樹突的激活，并能夠防止谷氨酸過多的與受體結合造成神經損傷。EAAT2的上調表達能夠修補精神分裂癥患者的前脈沖抑制[22]，有些抗神經藥物能夠降低EAAT2的表達[23]。在本試驗中，無論是在AR組還是在ER組，90日齡時EAAT2的表達都比60日齡時上調，說明在這段時間中，羔羊的神經活動比較活躍，需要更多的EAAT2來清除谷氨酸鹽以保證神經功能的正常發(fā)揮。MFSD2A在血管中表達行程血腦屏障，該基因的敲除使緊密連接受到破壞，從而增加血腦屏障的通透性[24]。MFSD2A在非小細胞肺癌細胞中嚴格的低表達，可以作為肺癌細胞抑制子[25]。

4結論

本研究采用Affymetrix芯片篩選了不同的培育方式下羔羊肝組織的差異表達基因，這些差異表達基因主要參與氨基酸、小分子化合物和有機酸代謝的生物過程、酶活性反應過程、免疫反應過程以及氨基酸代謝、脂類代謝、激素合成和信號轉導途徑。這些代謝途徑和信號通路的發(fā)現能夠為研究相關基因在幼齡反芻動物肝組織中的作用提供理論依據。

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(編輯郭云雁)

Effect of Different Rearing Systems on Hepatic Gene Expression of Early Weaned Hu Twin Lambs

WANG Hai-chao，ZHANG Nai-feng，CHAI Jian-min，WANG Bo，DIAO Qi-yu*

(KeyLaboratoryofFeedBiotechnologyofMinistryofAgriculture，FeedResearchInstitute，>ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100081，China)

Abstract:This experiment was conducted to study the effect of different rearing systems on hepatic gene expression in twin lambs.Twenty-four pairs of Hu male twin lambs were equally divided into 2 groups.Twenty-four subjects were artificially reared(AR) with milk replacer after 7 days colostrum while 24 others were ewe reared(ER) with mother milk as control.All lambs were weaned at day 60 and then fed with starter till day 90.When the lambs reached 60 and 90 days old，three pairs of twin lambs at each time point were slaughter to collect liver samples.Hepatic gene expression were analyzed via microarray and bioinformatics method.We found many differentially expressed genes(DEGs).They wereOR1E2，S1PR3，KMO，APOA4，ORM2，HTR4，FADS1 in both 60ARvs60ER and 90ARvs90ER，andACO1，HBA1，MFSD2A，CYSJ，LOC785954，FCN，GRB2，LOC100037663，ORM2，RXRG，LOC100602447，SQLE，HSD17B2，CYP4F2，INHBE，EAAT2 in both 60ARvs90AR and 60ERvs90ER，among which 4 unknown genes were identified with the probe ID 14780690，14815720，14845504，14854080.ORM2 was differentially expressed among all the comparisons.Those DEGs involved in the amino acid metabolism，small molecular metabolism，enzyme activities and immune response of GO process and amino acid metabolism，lipid metabolism，hormone biosynthesis and signaling transductions of KEGG pathways.In summary，different rearing systems altered hepatic gene expression.The pathways and functions those DEGs involved in could shed lights on the mechanisms of early cultivation of lambs.

Key words:twin lambs；early weaning；milk replacer；differentially expressed gene；genechip

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.013

收稿日期：2015-05-05

基金項目：農業(yè)部公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201303143)；國家肉羊產業(yè)技術體系(CARS-39)

作者簡介：王海超(1990-)，男，河北臨漳人，碩士生，主要從事反芻動物營養(yǎng)學研究，E-mail：qiusuoba@163.com *通信作者：刁其玉，研究員，博士生導師，E-mail：diaoqiyu@caas.cn

中圖分類號：S826；S815.4

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)04-0733-12