宋興超，徐　超，劉宗岳，岳志剛，叢　波，劉琳玲，楊福合

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林省特種經(jīng)濟(jì)動物分子生物學(xué)省部共建國家重點實驗室，長春 130112)

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美洲水貂刺鼠信號蛋白基因SNPs檢測及其與毛色表型的關(guān)聯(lián)分析

宋興超，徐超，劉宗岳，岳志剛，叢波，劉琳玲，楊福合*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林省特種經(jīng)濟(jì)動物分子生物學(xué)省部共建國家重點實驗室，長春 130112)

摘要：旨在檢測刺鼠信號蛋白(Agouti signaling protein，Agouti)基因外顯子2、內(nèi)含子2、外顯子3及部分內(nèi)含子3的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)在不同毛色美洲水貂群體中的分布，探討該基因變異與水貂被毛顏色表型的相關(guān)性。以金州黑水貂、吉林白水貂、銀藍(lán)水貂、咖啡水貂和珍珠色水貂共計430個樣本的血液基因組DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增和Sanger雙脫氧鏈終止測序技術(shù)，對Agouti基因序列進(jìn)行SNPs檢測，并將突變位點與水貂毛色表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，獲得的美洲水貂Agouti基因長度為2 510 bp，內(nèi)含子2存在4個SNPs：g.18G>A、g.159A>G、g.235G>T和g.1189C>T，部分內(nèi)含子3檢測到6個SNPs：g.252C>T、g.290A>C、g.298G>C、g.340A>G、g.343T>C和g.379T>C，在外顯子2和3區(qū)域并未檢測到SNPs位點。關(guān)聯(lián)分析表明，Agouti基因7個SNPs(內(nèi)含子2：g.1189C>T；內(nèi)含子3：g.252C>T、g.290A>C、g.298G>C、g.340A>G、g.343T>C和g.379T>C)位點的基因型均與水貂毛色表型極顯著相關(guān)(P<0.000 1)，且部分內(nèi)含子3中的5個SNPs位點(g.290A>C、g.298G>C、g.340A>G、g.343T>C和g.379T>C)可能處于緊密連鎖狀態(tài)。研究結(jié)果初步表明，Agouti基因可能是影響美洲水貂被毛顏色的候選基因或與決定毛色性狀主效基因相連鎖的分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：美洲水貂；Agouti基因；毛色表型；單核苷酸多態(tài)性；關(guān)聯(lián)分析

哺乳動物皮膚、被毛的顏色和鳥類的羽色是一種重要的質(zhì)量性狀，也是動物形態(tài)選擇、品種歸屬識別及鑒定的重要依據(jù)之一[1]。野生美洲水貂(Neovisonvison)全身被毛一致，呈深褐色，在家養(yǎng)條件下稱為標(biāo)準(zhǔn)貂，彩色水貂是深褐色標(biāo)準(zhǔn)貂的突變型，目前已出現(xiàn)30多個毛色突變基因(包括復(fù)等位基因)，并通過各種組合，已增加至100余種[2]。彩色水貂皮色澤鮮艷、絢麗多彩，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值，根據(jù)毛色可以分為黑色系、白色系、淺褐色系和灰藍(lán)色系4大類[3]。水貂作為一種小型珍貴毛皮動物，其被毛顏色是決定貂皮質(zhì)量及價值最重要的指標(biāo)，培育出新穎美觀的彩貂新品種是當(dāng)前水貂的主要育種方向之一，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆水貂毛色相關(guān)基因，篩選與水貂被毛顏色表型相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點，通過分子標(biāo)記輔助選擇(Marker assisted selection，MAS)可以加快彩貂良種的選育進(jìn)度。

近年來，關(guān)于水貂毛色發(fā)生的分子遺傳學(xué)機(jī)理研究備受關(guān)注。S.Cirera等[4]研究表明，銀藍(lán)水貂黑素親和素(Melanophilin，MLPH)蛋白缺失肌動蛋白Va (MYO5A)結(jié)合域可導(dǎo)致稀釋色型。R.Anistoroaei等[5]報道，酪氨酸酶(Tyrosinase)基因外顯子1的錯義突變(g.138T>A)可能與水貂的白化表型相關(guān)。宋興超等[6]對美洲水貂黑色素皮質(zhì)激素受體-1(Melanocortin-1 receptor，MC1R)基因完整編碼區(qū)進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析。被毛顏色的形成主要受控于毛囊中黑色素細(xì)胞合成及分泌的真黑色素(Eumelanin)和褐黑色素(Pheomelanin)的比例及分布，是涉及多個基因與位點共同進(jìn)行調(diào)控的復(fù)雜信號通路，該通路涉及黑色素細(xì)胞發(fā)育、黑色素小體形成與轉(zhuǎn)運、黑色素合成與類型轉(zhuǎn)變等生物學(xué)過程，其中，刺鼠信號蛋白(Agouti signal protein gene，Agouti)基因是參與調(diào)控大多數(shù)脊椎動物毛色性狀的一個主效基因，該基因主要通過調(diào)控色素合成過程中真黑色素和褐黑色素之間的轉(zhuǎn)換來控制毛色的發(fā)生[7]。Agouti基因外顯子與非編碼區(qū)突變對小鼠[8]、家貓[9]、山羊[10]和驢[11]毛色的影響機(jī)制已有相關(guān)報道。但是該基因?qū)λ趺誀畹恼{(diào)控方式還不清楚，因此，研究探討Agouti基因變異與水貂毛色表型的相關(guān)性，對于進(jìn)一步揭示水貂毛色形成的分子遺傳學(xué)機(jī)制尤為重要。本研究以5個不同毛色水貂群體為研究對象，通過PCR擴(kuò)增及Sanger雙脫氧鏈終止測序技術(shù)對Agouti基因外顯子2、內(nèi)含子2、外顯子3和部分內(nèi)含子3區(qū)域進(jìn)行SNPs位點檢測，并對該基因突變位點與水貂毛色表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，旨在篩查與水貂被毛顏色相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，以期為深入研究Agouti基因調(diào)控水貂毛色性狀的功能提供參考。

1材料與方法

1.1血液采集及基因組DNA提取

以2個培育品種和3個引進(jìn)品種共計5種毛色表型430個樣本為研究對象(圖1)。其中培育品種包括金州黑水貂(圖1A，JZH，120只)和吉林白水貂(圖1B，JLB，86只)，引進(jìn)品種包括銀藍(lán)水貂(圖1C，YL，95只)，咖啡水貂(圖1D，KF，86只)和珍珠色水貂(圖1E，ZZ，43只)。樣本取自大連名威貂業(yè)有限公司和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所毛皮動物試驗基地7月齡左右、雄性家養(yǎng)美洲水貂血液，水貂取皮時用一次性無菌注射器心采血5.0 mL置于真空采血管中，參考文獻(xiàn)[12]中酚-氯仿抽提法提取水貂血液基因組DNA，滅菌超純水溶解，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測完整性、含量及純度，稀釋為70 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑

DNA提取所用試劑購于天根生化科技(北京)有限公司，DL2000 DNA Marker、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、ExTaqDNA聚合酶和dNTPs均購自寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖購自Promega公司。

A.金州黑水貂；B.吉林白水貂；C.銀藍(lán)水貂；D.咖啡水貂；E.珍珠色水貂A.Jinzhou black mink；B.Jilin white mink；C.Silverblue mink；D.Coffee mink；E.Pearl mink圖1　不同被毛顏色的美洲水貂Fig.1　Different coat color in American mink

1.3引物設(shè)計、PCR擴(kuò)增及測序

因GenBank數(shù)據(jù)庫中未公布美洲水貂Agouti基因序列信息，所以本研究以與水貂同屬鼬科動物的雪貂(序列號：XM_004785317)Agouti基因mRNA序列作為參考，將該序列在Ensembl數(shù)據(jù)庫中雪貂全基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，獲得一段4 321 bp雪貂Agouti基因核苷酸序列，以該序列作為假定的美洲水貂Agouti基因，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件篩選3對引物(表1)，擴(kuò)增水貂Agouti基因。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

反應(yīng)體系25 μL：ExTaqDNA 聚合酶(5 U·μL-1)0.25 μL，10×PCR Buffer(Mg2+Plus)2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，模板DNA 1.0 μL(70 ng·μL-1)，上、下游引物(10 pmol·μL-1)各1 μL，滅菌超純水17.25 μL。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，Tm(表1)退火30 s，72 ℃延伸30～82 s(表1)，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的片段經(jīng)過切膠、回收純化后，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序。

表1擴(kuò)增美洲水貂Agouti基因序列引物信息

Table 1Information of primer sequences for amplifying American minkAgoutigene

引物Primer序列(5'→3')Sequence退火溫度/℃Tm延伸時間/sExtendedtime擴(kuò)增區(qū)域AmplifiedregionAgouti-1F:CTATCGGAACACTTAGGAAATGGGTR:TTATTAAATTGGTGGTATACAGGGC57.530外顯子2Agouti-2F:TTGGATTTCCCTTCTGTCTCTATTGR:TCTTCTTTTCCGCCTCTTTTCTACT60.282內(nèi)含子2+外顯子3Agouti-3F:GAAGCACTGAACAAGAAATCCAAAR:CCATCCAGGTAAAATCCACTAACA59.562部分內(nèi)含子3

1.4數(shù)據(jù)分析

1.4.1SNPs位點識別與基因型判定利用BioEdit 7.0生物軟件的ClustalW Multiple alignment程序?qū)Λ@得的美洲水貂Agouti基因序列進(jìn)行比對，檢測SNPs位點；通過測序峰圖軟件Chromas 5.0判定SNPs位點的基因型，單一峰為純合基因型，套峰為雜合基因型。

1.4.2基因型、等位基因頻率統(tǒng)計及SNPs位點與毛色性狀關(guān)聯(lián)分析采用Popgene 1.32軟件計算基因型頻率和等位基因頻率，并利用SAS 9.2統(tǒng)計軟件的χ2獨立性檢驗程序進(jìn)行SNPs位點基因型與毛色表型的關(guān)聯(lián)分析(P<0.05表示差異顯著，P<0.01為差異極顯著)。

2結(jié)果

2.1Agouti基因PCR產(chǎn)物檢測

利用設(shè)計引物(表1)進(jìn)行水貂Agouti基因擴(kuò)增，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2)，3對引物均獲得特異性的產(chǎn)物，Agouti-1引物擴(kuò)增片段為494 bp(圖2A)，Agouti-2引物擴(kuò)增片段為1 335 bp(圖2B)，Agouti-3引物擴(kuò)增片段為1 032 bp(圖2C)，3個片段大小與預(yù)期設(shè)計擴(kuò)增長度一致，單一無拖尾，表明引物特異性較好，適合進(jìn)行測序分析。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.陰性對照；2～12.產(chǎn)物。A. Agouti-1；B. Agouti-2；C. Agouti-3M.DL2000 DNA marker；1.Negative control；2-12.The products of Agouti gene.A.Agouti-1；B.Agouti-2；C.Agouti-3圖2　水貂Agouti基因3對引物PCR產(chǎn)物電泳Fig.2　Electrophoresis of the products of Agouti gene in mink from 3 pairs primers

2.2SNPs位點篩查及基因型判定

參照雪貂Agouti基因序列結(jié)構(gòu)特征分析3對引物的測序結(jié)果，共獲得美洲水貂Agouti基因2 510 bp核苷酸序列，其中外顯子2、內(nèi)含子2、外顯子3和部分內(nèi)含子3長度分別為160、1 256、62和967 bp(序列號KJ488543)。利用BioEdit 7.0軟件中的ClustalW Multiple alignment程序?qū)?個不同毛色水貂群體的測序結(jié)果進(jìn)行比對，篩查SNPs位點，結(jié)合測序峰圖判定每個位點的基因型。SNPs位點的命名原則：每個內(nèi)含子的第1個起始堿基標(biāo)記為“1”，在不同毛色水貂Agouti基因內(nèi)含子2和3中，共檢測到10個SNPs(圖3和表2)，外顯子2和3區(qū)域均未檢測到多態(tài)位點。內(nèi)含子2中檢測到4個SNPs，其中吉林白水貂、咖啡水貂和珍珠色水貂僅檢測到3個位點發(fā)生變異：g.18G>A、g.159A>G和g.1189C>T，每個位點均包括3種基因型；金州黑水貂僅檢測到1個變異位點：g.235G>T，包括2種基因型；銀藍(lán)貂這4個突變位點均存在。部分內(nèi)含子3上，在不同毛色水貂群體間檢測到6個SNPs：g.252C>T、g.290A>C、g.298G>C、g.340A>G、g.343T>C和g.379T>C，6個SNPs位點在5種毛色水貂群體中分別存在3種基因型。

2.3Agouti基因內(nèi)含子2序列4個SNPs位點基因型及等位基因頻率的分布

對獲得的5個不同毛色品種的430只水貂Agouti基因內(nèi)含子2序列進(jìn)行分析，統(tǒng)計各毛色表型中4個SNPs的基因型和等位基因頻率。由表3可見，在g.18G>A和g.159A>G位點上，5種不同毛色水貂中G和A等位基因頻率均較高，為優(yōu)勢等位基因，其中金州黑水貂G和A等位基因的基因頻率最高，均為1.000 0，即金州黑水貂群體在這2個位點未發(fā)生變異；在其它毛色品種中，這2個等位基因的分布大致相似。對于g.235G>T位點，僅在金州黑水貂和銀藍(lán)水貂群體間檢測到變異位點，存在GG和TT兩種基因型，然而，對于位點g.1189C>T，金州黑水貂、吉林白水貂、咖啡水貂和珍珠色水貂均存在CC、CT和TT 3種基因型，且CT基因型在吉林白水貂中為優(yōu)勢等位基因型，而銀藍(lán)水貂未檢測到TT基因型。由此推測，g.1189C>T位點可能與吉林白水貂的白色被毛表型相關(guān)。

圖3　美洲水貂Agouti基因SNPs位點測序Fig.3　Sequencing profiles of Agouti gene from American mink with different coat color

表2水貂Agouti基因10個SNPs的信息

Table 2The information of 10 SNPs in minkAgoutigene

項目ItemSNP1SNP2SNP3SNP4SNP5SNP6SNP7SNP8SNP9SNP10位置/bpPosition181592351189252290298340343379突變MutationG/AA/GG/TC/TC/TA/CG/CA/GT/CT/C分布DistributionIntron2Intron2Intron2Intron2Intron3Intron3Intron3Intron3Intron3Intron3

表3Agouti基因內(nèi)含子2序列4個SNPs在5個不同毛色水貂群體中的基因型與等位基因頻率

Table 3Genotype and allele frequency of 4 SNPs forAgoutigene intron 2 in 5 coat color mink breeds

突變位點SNPs基因型與等位基因Genotypeandallele不同毛色水貂群體Differentcoatcolorpopulationsofmink金州黑水貂JZH吉林白水貂JLB銀藍(lán)水貂YL咖啡水貂KF珍珠水貂ZZg.18G>AGG1.0000(120)0.7442(64)0.8211(78)0.8372(72)0.5349(23)GA0.0000(0)0.2209(19)0.1474(14)0.1512(13)0.4186(18)AA0.0000(0)0.0349(3)0.0315(3)0.0116(1)0.0465(2)G1.00000.85470.89470.91280.7442A0.00000.14530.10530.08720.2558g.159A>GAA1.0000(120)0.8256(71)0.8105(77)0.8837(76)0.5349(23)AG0.0000(0)0.1512(13)0.1684(16)0.1047(9)0.4186(18)GG0.0000(0)0.0232(2)0.0211(2)0.0116(1)0.0465(2)A1.00000.90120.89470.93610.7442G0.00000.09880.10530.06390.2558g.235G>TGG0.9333(112)1.0000(86)0.9368(89)1.0000(86)1.0000(43)GT0.0667(8)0.0000(0)0.0632(6)0.0000(0)0.0000(0)TT0.0000(0)0.0000(0)0.0000(0)0.0000(0)0.0000(0)G0.96671.00000.96321.00001.0000T0.03330.00000.03680.00000.0000g.1189C>TCC0.3583(43)0.3488(30)0.8211(78)0.6163(53)0.7442(32)CT0.4417(53)0.5349(46)0.1789(17)0.3139(27)0.2326(10)TT0.2000(24)0.1163(10)0.0000(0)0.0698(6)0.0232(1)C0.57920.61630.91050.77530.8605T0.42080.38370.08950.22670.1395

括號內(nèi)的數(shù)字為該基因型個體數(shù)。下表同

Figures in brackets are the individual number of the genotype.The same as below

2.4Agouti基因部分內(nèi)含子3序列6個SNPs位點基因型及等位基因頻率的分布

利用引物Agouti-3對5個不同毛色水貂品種的430個樣本進(jìn)行擴(kuò)增，獲得所有個體6個SNPs的基因型數(shù)據(jù)，并統(tǒng)計各群體各位點的基因型與等位基因頻率(表4)。結(jié)果顯示，5個水貂群體的6個位點均發(fā)生了突變。g.252C>T位點的C等位基因在5個毛色水貂群體中為優(yōu)勢等位基因，其中金州黑水貂群體突變率最低，等位基因T頻率為0.222 2。除金州黑水貂品種外，g.290A>C位點的C等位基因在吉林白水貂、銀藍(lán)水貂、咖啡水貂和珍珠色水貂群體中為優(yōu)勢等位基因。g.298G>C、g.340A>G、g.343T>C和g.379T>C位點在各群體中等位基因頻率與g.290A>C位點完全一致，初步推測，這5個變異位點在所有群體內(nèi)可能處于緊密連鎖狀態(tài)，或者與控制水貂毛色表型的位點連鎖。

表4Agouti基因內(nèi)含子3序列6個SNPs在5個不同水貂毛色群體中的基因型與等位基因頻率

Table 4Genotype and allele frequency of 6 SNPs forAgoutigene intron 3 in 5 coat color mink breeds

突變位點SNPs基因型與等位基因Genotypeandallele不同毛色水貂群體Differentcoatcolorpopulationsofmink金州黑水貂JZH吉林白水貂JLB銀藍(lán)水貂YL咖啡水貂KF珍珠水貂ZZg.252C>TCC0.6667(80)0.5000(43)0.5263(50)0.5116(44)0.2558(11)CT0.2222(27)0.4302(37)0.4526(43)0.3605(31)0.6279(27)TT0.1111(13)0.0698(6)0.0211(2)0.1279(11)0.1163(5)C0.77780.71510.75260.69190.5698T0.22220.28490.24740.30810.4302g.290A>CAA0.4750(57)0.2442(21)0.0526(5)0.0698(6)0.0465(2)AC0.2083(25)0.5000(43)0.1158(11)0.3488(30)0.3256(14)CC0.3167(38)0.2558(22)0.8316(79)0.5814(50)0.6279(27)A0.57920.49420.11050.24420.2093C0.42080.50580.88950.75580.7907g.298G>CGG0.4750(57)0.2442(21)0.0526(5)0.0698(6)0.0465(2)GC0.2083(25)0.5000(43)0.1158(11)0.3488(30)0.3256(14)CC0.3167(38)0.2558(22)0.8316(79)0.5814(50)0.6279(27)G0.57920.49420.11050.24420.2093C0.42080.50580.88950.75580.7907g.340A>GAA0.4750(57)0.2442(21)0.0526(5)0.0698(6)0.0465(2)AG0.2083(25)0.5000(43)0.1158(11)0.3488(30)0.3256(14)GG0.3167(38)0.2558(22)0.8316(79)0.5814(50)0.6279(27)A0.57920.49420.11050.24420.2093G0.42080.50580.88950.75580.7907g.343T>CTT0.4750(57)0.2442(21)0.0526(5)0.0698(6)0.0465(2)TC0.2083(25)0.5000(43)0.1158(11)0.3488(30)0.3256(14)CC0.3167(38)0.2558(22)0.8316(79)0.5814(50)0.6279(27)T0.57920.49420.11050.24420.2093C0.42080.50580.88950.75580.7907g.379T>CTT0.4750(57)0.2442(21)0.0526(5)0.0698(6)0.0465(2)TC0.2083(25)0.5000(43)0.1158(11)0.3488(30)0.3256(14)CC0.3167(38)0.2558(22)0.8316(79)0.5814(50)0.6279(27)T0.57920.49420.11050.24420.2093C0.42080.50580.88950.75580.7907

2.5Agouti基因SNPs位點與水貂毛色表型的關(guān)聯(lián)分析

根據(jù)篩查到SNPs位點所形成的不同基因型及其在不同毛色群體中頻率的差異，由于個別毛色群體在g.18G>A、g.159A>G和g.235G>T位點處的基因型數(shù)量<5，不具有統(tǒng)計學(xué)意義，且位點g.290A>C與g.298G>C、g.340A>G、g.343T>C、g.343T>C的等位基因頻率完全一致，因此選取3個SNPs，即g.1189C>T、g.252C>T、g.290A>C，分別進(jìn)行卡方獨立性檢驗(表5)，分析各位點基因型與毛色表型的相關(guān)性。結(jié)果表明，內(nèi)含子2中1 189位、內(nèi)含子3中252位、290位各基因型在不同毛色群體中差異極顯著(P<0.000 1)，另外，由于內(nèi)含子3中g(shù).298G>C、g.340A>G、g.343T>C和g.379T>C可能與g.290A>C位點處于緊密連鎖狀態(tài)，因此，筆者推測g.1189C>T、g.252C>T、g.290A>C、g.298G>C、g.340A>G、g.343T>C和g.379T>C位點均可能與水貂毛色表型存在一定的相關(guān)性。

表5Agouti基因SNPs位點的各基因型分布及其與毛色的關(guān)聯(lián)分析

Table 5Association between genotype ofAgoutigene SNPs and coat color phenotype

位點SNPs基因型Genotype不同毛色群體頻數(shù)Numberofdifferentcoatcolor金州黑水貂JZH吉林白水貂JLB銀藍(lán)水貂YL咖啡水貂KF珍珠水貂ZZχ2PCC4330785332g.1189C>TCT534617271077.7501<0.0001TT2410061CC8043504411g.252C>TCT273743312734.6981<0.0001TT1362115AA5721562g.290A>CAC2543113014133.7328<0.0001CC3822795027

3討論

隨著測序成本的逐漸下降，在所有SNPs的檢測方法中，對欲檢測片段進(jìn)行擴(kuò)增、直接測序是最為準(zhǔn)確的方法，該方法主要用于SNPs位點的檢測及分型，通常情況下，純合型SNPs位點的測序峰圖為單一峰型，而雜合型SNPs位點的測序峰為套峰，因而很容易將其區(qū)分，通過直接測序方法進(jìn)行SNPs篩查的檢出率接近100%[13]。本試驗采用PCR產(chǎn)物直接測序技術(shù)，對5個不同毛色水貂群體Agouti基因進(jìn)行了單核苷酸多態(tài)性檢測，在內(nèi)含子2和部分內(nèi)含子3區(qū)域共檢測到10個SNPs位點。與非翻譯區(qū)相比，5個毛色水貂群體Agouti基因外顯子2和3未檢測到變異位點，這與M.Girardot等[14]在牛上和X.L.Li等[15]在山羊中的研究結(jié)果一致。J.Voisey等[16]也未檢測到人Agouti基因外顯子2和3具有多態(tài)性。初步推斷，Agouti基因外顯子2和3在所選取的水貂樣本中相對保守，應(yīng)進(jìn)一步增加樣本量或檢測更多的毛色類型個體，同時篩查其他外顯子區(qū)域以確保水貂Agouti基因編碼區(qū)是否存在與毛色表型相關(guān)的遺傳標(biāo)記位點。

在內(nèi)含子2所檢測到的4個SNPs位點中，g.18G>A和g.159A>G位點僅存在于吉林白水貂、銀藍(lán)水貂、咖啡水貂和珍珠色水貂群體中，且GG和AA為優(yōu)勢基因型，但是金州黑水貂群體中未見這兩個變異位點。g.235G>T位點僅在金州黑和銀藍(lán)水貂群體中存在少量GT基因型，因此推測這3個SNPs位點與水貂的毛色表型關(guān)系不大，可能是在個體自然進(jìn)化或品種選育過程中產(chǎn)生的稀有變異堿基。關(guān)于g.1189C>T位點，CT基因型在白色水貂群體頻率最高，且經(jīng)卡方獨立性檢驗表明，該位點形成的基因型與水貂毛色表型極顯著相關(guān)(P<0.000 1)，所以g.1189C>T位點的CT基因型可能與美洲水貂的白色被毛性狀存在關(guān)聯(lián)，該位點或者是控制水貂白色被毛表型的主控位點，或者是與控制水貂白色表型的位點存在連鎖關(guān)系，需要進(jìn)一步試驗驗證。部分內(nèi)含子3中的g.252C>T位點形成的CT基因型在珍珠色水貂群體中的頻率最高(0.627 9)，CT基因型可能與珍珠色水貂的毛色相關(guān)。g.290A>C、g.298G>C、g.340A>G、g.343T>C和g.379T>C位點的突變純合子基因型頻率(0.831 6)在銀藍(lán)水貂群體中的頻率最高，與銀藍(lán)水貂的灰藍(lán)色被毛表型存在關(guān)聯(lián)(P<0.000 1)，也可能與控制銀藍(lán)水貂毛色表型的位點存在連鎖關(guān)系。

本研究檢測到的水貂Agouti基因7個SNPs位點中，內(nèi)含子2中與白色表型相關(guān)的g.1189C>T、內(nèi)含子3中與珍珠色表型相關(guān)的g.252C>T位點以及與銀藍(lán)色表型相關(guān)的g.290A>C、g.298G>C、g.340A>G、g.343T>C和g.379T>C位點可能與某個等位基因連鎖，從而表現(xiàn)出不同的基因型，對應(yīng)不同的毛色表型。前人研究證實，Agouti基因表達(dá)的ASIP蛋白與α-MSH競爭性結(jié)合MC1R，進(jìn)一步導(dǎo)致真黑色素合成數(shù)量減少，生成淺色被毛[17]。根據(jù)彩貂毛色遺傳基因型可知[3]，吉林白水貂(基因型：bbcc)和珍珠色水貂(基因型：ppkk)都屬于兩對純合隱性基因組合色型，銀藍(lán)水貂的基因型為pp，這3種毛色均為淺色表型，與Agouti基因表達(dá)的ASIP蛋白拮抗α-MSH與MC1R相結(jié)合的理論相符。盡管本試驗檢測的SNPs存在于內(nèi)含子中，但有研究表明Agouti基因內(nèi)含子的變異可以導(dǎo)致其編碼mRNA存在不同的剪接體，通過修復(fù)蛋白合成而影響相應(yīng)蛋白的調(diào)控功能[18]。

4結(jié)論

本研究對美洲水貂Agouti基因的SNPs進(jìn)行檢測并分析了內(nèi)含子2和3中的10個SNPs與水貂毛色性狀的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)7個SNPs位點與水貂淺色被毛表型存在關(guān)聯(lián)。該結(jié)果提示，Agouti基因可作為影響美洲水貂被毛顏色的主效候選基因或與決定毛色性狀的主效基因連鎖的分子遺傳標(biāo)記，為解析Agouti基因調(diào)控水貂毛色性狀的分子遺傳學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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(編輯程金華)

Single Nucleotide Polymorphisms Detection of Agouti Gene and Its Association with Coat Color Phenotype in American Mink(Neovisonvison)

SONG Xing-chao，XU Chao，LIU Zong-yue，YUE Zhi-gang，CONG Bo，LIU Lin-ling，YANG Fu-he*

(StateKeyLaboratoryofSpecialEconomicAnimalMolecularBiology，InstituteofSpecialAnimalandPlantSciences，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Changchun130112，China)

Abstract:The aim of this study was to research single nucleotide polymorphisms of agouti signal protein(Agouti)gene and analyze the association of SNPs with coat color phenotype in American mink(Neovisonvison).The DNA of blood from 5 mink breeds(Jinzhou black，Jilin white，Silverblue，Coffee and Pearl mink)that possessed significant difference in coat color phenotype were selected as templates，SNP sites were screened by PCR and Sanger double chain termination sequencing technology，and then the relationship between the mutation sites ofAgoutigene and coat color phenotype were analyzed in 430 minks.The results showed that the obtained minkAgoutigene was 2 510 bp in length.Total 10 SNPs were screened from 430 individuals of 5 coat color breeds，of which 4 SNPs (g.18G>A，g.159A>G，g.235G>T and g.1189C>T)were located in intron 2 and 6 SNPs(g.252C>T，g.290A>C，g.298G>C，g.340A>G，g.343T>C and g.379T>C)were detected from partial intron 3 ofAgoutigene，while no SNPs was discovered in exon 2 and 3.Association analysis of 7 SNPs inAgoutigene with coat color phenotype indicated that all sites were very significantly(P<0.000 1)correlated with coat color phenotype of American mink.In addition，the 5 loci including g.290A>C，g.298G>C，g.340A>G，g.343T>C and g.379T>C might show closely linkaged phenomenon.Results of the present study indicated thatAgoutigene might be the candidate gene or linked with the major gene affecting the coat color phenotype of American mink.

Key words:American mink；Agoutigene；coat color phenotype；SNPs；correlation analysis

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.012

收稿日期：2015-06-08

基金項目：國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃-973項目(2012CB722907)；水貂優(yōu)良種質(zhì)資源及選育技術(shù)引進(jìn)-948項目(2014-Z8)

作者簡介：宋興超(1982-)，男，河北保定人，博士生，助理研究員，主要從事特種經(jīng)濟(jì)動物遺傳育種研究，E-mail：songxingchao@caas.cn *通信作者：楊福合，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事特種經(jīng)濟(jì)動物種質(zhì)資源收集、評價及遺傳育種研究，E-mail：yangfh@126.com

中圖分類號：S865.2+2.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)04-0723-10