王倩倩，楊　彪，夏麗麗，孫曉先，耿拓宇，龔道清

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

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鵝乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶2基因的克隆及其在鵝肥肝形成過(guò)程中的表達(dá)變化

王倩倩，楊彪，夏麗麗，孫曉先，耿拓宇，龔道清*

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

摘要：為了探討ACAA2基因與鵝(Anseranser)肝脂肪代謝的關(guān)系，本試驗(yàn)選取35只朗德鵝分為填飼組(15只)和對(duì)照組(20只)，填飼組包括填飼7、14和19天3個(gè)階段。運(yùn)用RT-PCR方法克隆出朗德鵝ACAA2基因的完整編碼序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測(cè)定了朗德鵝填飼不同階段該基因在肝中的表達(dá)水平，并用葡萄糖、脂肪酸和胰島素分別處理鵝原代肝細(xì)胞，觀察這些因子對(duì)基因表達(dá)的影響。朗德鵝ACAA2基因完整CDS區(qū)長(zhǎng)1 194 bp，編碼 397個(gè)氨基酸；各階段填飼組肝中該基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但隨填飼時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)。另外，在培養(yǎng)的鵝原代肝細(xì)胞中，相較于對(duì)照組，0.5 mmol·L-1的油酸能使ACAA2的表達(dá)量顯著上調(diào)，而0.25 mmol·L-1的棕櫚酸和不同濃度的胰島素能顯著下調(diào)ACAA2的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)果表明，ACAA2基因的表達(dá)與鵝肥肝的形成密切相關(guān)，為深入研究ACAA2基因在鵝肥肝形成過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鵝；乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶2；脂肪肝；基因克隆

鵝肥肝是一種高級(jí)營(yíng)養(yǎng)品，富含不飽和脂肪酸，易被人體吸收和利用，且可降低人體血液中膽固醇的含量。因其營(yíng)養(yǎng)豐富、質(zhì)地細(xì)嫩、味道鮮美，鵝肥肝被公認(rèn)為是三大美味佳肴之一[1-2]。有關(guān)鵝肥肝形成機(jī)理一直受到人們的關(guān)注，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者從分子水平上開展了相關(guān)研究，篩選出一些與鵝肥肝形成相關(guān)的基因，并對(duì)基因功能進(jìn)行了研究，使得人們對(duì)鵝肥肝形成的分子機(jī)理有了初步的了解[3-5]。乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶2(Acetyl-coenzyme A acyltransferase 2，ACAA2)又稱線粒體3-羰基輔酶A硫解酶(Mitochondrial 3-Oxoacy-l Coenzyme A Thiolase)，作為?；D(zhuǎn)移酶主要分布于線粒體，參與脂肪酸的β氧化和膽固醇的生物合成過(guò)程等，被認(rèn)為是非常重要的脂類代謝基因[6-7]。李文娟[8]利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)ACAA2 是雞肌肉組織間脂質(zhì)代謝差異基因路徑上起樞紐作用的節(jié)點(diǎn)基因。V.C.De Boer 等[9]采用基因組芯片對(duì)不同小鼠脂質(zhì)代謝組織進(jìn)行了表達(dá)譜分析，同樣檢測(cè)到ACAA2基因的差異表達(dá)。A.Sidrah等[10]研究發(fā)現(xiàn)ACAA2基因的表達(dá)量在飲食誘發(fā)的肥胖小鼠中顯著降低。上述研究結(jié)果提示，ACAA2在維持肝脂肪酸代謝的過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。鵝是肝脂肪沉積能力最強(qiáng)的動(dòng)物，經(jīng)過(guò)20 d填飼其肝可以增加8～10倍，且有研究表明填飼能使與脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)量顯著上調(diào)[11-12]，但有關(guān)鵝ACAA2基因的研究未見報(bào)道。

本試驗(yàn)以肥肝專門化品種朗德鵝為素材，克隆出鵝ACAA2基因的完整編碼區(qū)序列(CDS)，利用熒光定量PCR技術(shù)分析該基因在填飼期不同階段肝中的表達(dá)情況，并用不同的與脂肪合成相關(guān)因子(葡萄糖、胰島素和脂肪酸)處理鵝原代肝細(xì)胞，研究這些因子對(duì)其表達(dá)的影響，為深入研究ACAA2基因在鵝肥肝形成過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用素材為揚(yáng)州瑞農(nóng)股份有限公司提供的朗德鵝。選取35只朗德鵝公鵝分為填飼組(15只)和對(duì)照組(20只)。對(duì)照組分別于70、77、84和89日齡各屠宰5只；填飼組從71日齡開始填飼，70日齡為填飼0天，分別于77日齡(填飼7天)、84日齡(填飼14天)和89日齡(填飼19天)各屠宰5只，試驗(yàn)組和對(duì)照組均取肝右葉組織，經(jīng)液氮速凍后在-70 ℃保存?zhèn)溆谩Ｌ铒曈玫娘暳咸幚矸椒ǎ悍Q取適量的玉米，入鍋煮沸5 min后取出瀝干，趁熱加入1%食鹽、1%鵝油，充分?jǐn)嚢枥鋮s后即可填飼。填飼量：其中1～7 d，每天填飼3次，每次填飼的玉米用量約為100 g；8～13 d，每天填飼4次，玉米用量約為200 g；最后5 d每天填飼5次，每次玉米用量約為280 g。填飼組人工強(qiáng)制填飼，對(duì)照組鵝自由飲水和采食玉米飼料。試驗(yàn)鵝在填飼期單獨(dú)籠養(yǎng)，自由飲水。

1.2試驗(yàn)材料

Trizol、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；Pmd19-T Vector購(gòu)于寶生物(大連)工程有限公司；HiScriptTMQ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper) 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光定量試劑盒SYBR Green Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；10×PCR Buffer，25 mmol·L-1MgCl2，dNTP Mixture(Each 10 mmol·L-1)，rTaq DNA聚合酶，瓊脂糖(Agarose)購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自GIBCO公司，Ⅳ 膠原酶購(gòu)自Worthington公司，葡萄糖、DMSO、紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，油酸鈉、棕櫚酸鉀、胰島素購(gòu)自Sigma公司，EGF購(gòu)自peprotech(派普泰克)公司中國(guó)代表處，青霉素/鏈霉素混合液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所 。

1.3試驗(yàn)方法1.3.1全長(zhǎng)CDS克隆根據(jù)雞(Gallus)ACAA2基因序列(GenBank登錄號(hào)：NM_001006571 )設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增朗德鵝ACAA2基因全長(zhǎng)編碼區(qū)序列(CDS)。上下游引物：F：5′-ATGGCGCTGCTCAGGGGTGT-3′，R：5′-CTCAGGCGGTGTTCTCAATG-3′。

PCR反應(yīng)總體系為20 μL：其中模板DNA 1 μL (約150 ng)，10×PCR Buffer 2 μL，Mg2+2.2 μL，dNTPs 0.8 μL，rTaqDNA聚合酶0.2 μL，ddH2O 11.8 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL。PCR反應(yīng)條件：9 5℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，62.9 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；產(chǎn)物于4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行目的片段的回收，并將回收后的PCR產(chǎn)物連接到pMD-19T Vector，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后挑單菌落并接種于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，進(jìn)行菌液PCR鑒定后，挑選3個(gè)陽(yáng)性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.2生物信息學(xué)分析通過(guò)DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank上發(fā)表的各個(gè)物種的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)；用MEGA軟件將ACAA2基因氨基酸序列與雞、人、鼠等物種進(jìn)行同源性比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹；在ExPASy服務(wù)器上使用ProtParam和ProtScale程序進(jìn)行蛋白質(zhì)親疏水性、理化性質(zhì)分析；用HNN (https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_hnn.html)分析朗德鵝ACAA2氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用NetPhos2.0預(yù)測(cè)ACAA2氨基酸序列存在的磷酸化位點(diǎn)；使用SWISS-MODEL在線預(yù)測(cè)其蛋白3D結(jié)構(gòu)；利用PSOTⅡProtein Sorting Prediction在線軟件對(duì)ACAA2蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.3.3熒光定量PCR分析用Trizol法提取肝樣品總RNA，按照HiScriptTMQ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA置于-20℃保存。根據(jù)擴(kuò)增的朗德鵝ACAA2基因的CDS序列設(shè)計(jì)引物，以磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)為內(nèi)參，采用SYBR-Green法對(duì)ACAA2基因在朗德鵝填飼不同階段肝中的表達(dá)量進(jìn)行定量分析。定量引物信息如表1所示。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Green Master Mix為10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)分別為0.4 μL，模板cDNA為2 μL，Rox Reforence Dye 2為0.4 μL，余下的用水補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火/延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。所有樣本進(jìn)行3個(gè)重復(fù)測(cè)定，qRT-PCR 結(jié)果采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

表1實(shí)時(shí)熒光定量引物

Table 1The primers for qRT-PCR

基因Gene引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Annealingtemperature產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpProductsizeACAA2F:ACACCTTGTGGGAAGGTCTGR:CGTTAAAATGGCCAGCATCT60165GAPDHF:GCCATCAATGATCCCTTCATR:CTGGGGTCACGCTCCTG60155

1.3.4鵝原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)孵化第22～23天正常發(fā)育的朗德鵝胚蛋用于鵝原代細(xì)胞分離。鵝原代肝細(xì)胞的分離主要采用“膠原酶消化法”[13]，而分離后鵝肝細(xì)胞的培養(yǎng)參照小鼠、大鼠原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法進(jìn)行[14-15]。細(xì)胞培養(yǎng)所需的完全培養(yǎng)基配制體系：90%高糖DMEM、10%FBS、1%青/鏈霉素混合液、0.02 ml·L-1EGF。用12孔板按7×105個(gè)·孔-1進(jìn)行細(xì)胞鋪板培養(yǎng)，培養(yǎng)26 h后進(jìn)行處理。

1.3.5鵝原代肝細(xì)胞的葡萄糖、脂肪酸或胰島素處理葡萄糖對(duì)肝細(xì)胞的處理：試驗(yàn)組分別用100、200 mmol·L-1葡萄糖的完全培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)照組用正常完全培養(yǎng)基；胰島素對(duì)肝細(xì)胞的處理：試驗(yàn)組分別用100和200 nmol·L-1胰島素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)照組用正常的完全培養(yǎng)基；油酸對(duì)肝細(xì)胞的處理：試驗(yàn)組分別用0.25和0.5 mmol·L-1油酸且含2%BSA的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)照組用含2%BSA的完全培養(yǎng)基；棕櫚酸對(duì)肝細(xì)胞的處理：試驗(yàn)組分別用0.25和0.5 mmol·L-1棕櫚酸且含2% BSA的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)照組用含2% BSA的完全培養(yǎng)基。各試驗(yàn)組和對(duì)照組處理細(xì)胞時(shí)間為14 h。

2結(jié)果

2.1朗德鵝ACAA2基因的克隆

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在1 000bp上方可見一條清晰的特異性條帶(圖1)。測(cè)序結(jié)果表明，鵝ACAA2基因的完整CDS區(qū)包含1 194bp，編碼397個(gè)氨基酸 (圖2)。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)M.DNA marker圖1　鵝ACAA2基因編碼區(qū)序列的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1　The electrophoresis of PCR products of goose ACAA2 CDS

2.2ACAA2基因序列的分析

對(duì)ACAA2序列進(jìn)行同源性分析(表2)，所獲得的鵝ACAA2的CDS與雞(Gallus，NM_001006571.2)、斑胸草雀(Taeniopygiaguttata，XM_002194733.3)、小鼠(Musmusculus，NM_177470.3)、豬(Susscrofa，NM_001167638.1)、牛(Bostaurus，NM_001035342.2)、綿羊(Ovisaries，XM_012120952.1)、人(Homosapiens，NM_006111.2)和斑馬魚(Daniorerio，NM_213052.1)的同源性分別為88.11%、85.71%、73.37%、72.28%、71.44%、71.36%、71.02%和70.27%。利用MEGA軟件使用Neighbour-joining法對(duì)ACAA2基因的氨基酸序列進(jìn)行聚類分析(圖3)，結(jié)果顯示，綿羊與牛聚為一類，人與豬聚為一類，這兩類最后與小鼠匯于一支，這些哺乳動(dòng)物最后均匯聚一支，而本次試驗(yàn)克隆出鵝ACAA2基因編碼的氨基酸序列與原雞聚為一類，之后與斑胸草雀聚為一類，這些鳥類最后匯聚為一支，進(jìn)一步證實(shí)克隆出的序列為鵝的ACAA2基因。

用ExPASy網(wǎng)站上的ProtParam程序?qū)ζ溥M(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析，預(yù)測(cè)其分子量為41 674.9，等電點(diǎn)為8.02，分子式為C1831H2981N519O554S17。ACAA2基因可編碼397個(gè)氨基酸，其中40個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸(E和D)，42個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸(K和R)，154個(gè)疏水氨基酸(A、I、L、F、W和V)，85個(gè)極性氨基酸(N、C、Q、S、T和Y)，其中丙氨酸(Ala)含量最高，有54個(gè)，占13.6%。使用ProtScale程序進(jìn)行親水性分析，預(yù)測(cè)鵝ACAA2蛋白疏水性最高為2.244，最低為-3.133，且疏水性低分值區(qū)域(score<0)比高分值區(qū)(score>1.5)多，由此推測(cè)，鵝ACAA2蛋白是一種親水性蛋白(圖4)；用 HNN(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_hnn.html)對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測(cè)序列具有α螺旋(Alpha helix：43.83%)、延長(zhǎng)片段(Extended strand：12.34%)和無(wú)規(guī)卷曲(Random coil：43.83%)3種二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖5)。同時(shí)，預(yù)測(cè)鵝ACAA2存在 16 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別在 Ser(5)、Thr(8)和Tyr(3)，表明鵝ACAA2存在磷酸化調(diào)控。用SWISS-MODEL在線預(yù)測(cè)其蛋白3D結(jié)構(gòu)(圖6)。經(jīng)PSOTⅡProtein Sorting Prediction軟件對(duì)ACAA2蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，該蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中的概率最高。

表2朗德鵝ACAA2基因與其他物種在核苷酸和氨基酸水平上的同源性

Table 2Homology of gooseACAA2 nucleotide and amino acid sequences to other species

物種Species核苷酸水平一致度/%Identityofnucleotidesequence氨基酸水平一致度/%IdentityofaminoacidsequenceGenBank登錄號(hào)GenBankaccessionnumber雞Gallusgallus88.1194.71NM_001006571.2斑胸草雀Taeniopygiaguttata85.7192.21XM_002194733.3小鼠Musmusculus73.3779.85NM_177470.3豬Susscrofa72.2880.60NM_001167638.1牛Bostaurus71.4479.60NM_001035342.2綿羊Ovisaries71.3678.84XM_012120952.1人Homosapiens71.0278.09NM_006111.2斑馬魚Daniorerio70.2779.60NM_213052.1

雙劃線為磷酸化位點(diǎn)；方框?yàn)槠鹗济艽a子和終止密碼子The double lines are phosphorylation sites；the boxes are the initiation codon and the termination codon圖2　鵝ACAA2基因CDS核酸和氨基酸序列Fig.2　The coding sequence and the predicted amino acid sequence of goose ACAA2 gene

2.3ACAA2基因在填飼鵝肝中的表達(dá)規(guī)律

70日齡朗德鵝肝平均重量為124 g，用玉米強(qiáng)制填飼7、14和19 d后，其肝平均重量分別達(dá)183、416和827 g，表明填飼后鵝肝脂肪沉積逐步增加。使用熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)對(duì)照組和填飼組的ACAA2基因mRNA在不同填飼階段(填飼第7天、第14天、第19天)的表達(dá)水平。如圖7所示，各階段填飼組肝中ACAA2基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但隨著填飼時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，表明填飼可以誘導(dǎo)肝中ACAA2基因的表達(dá)。

圖3　基于氨基酸序列分析的ACAA2基因系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3　The phylogenetic tree of ACAA2 gene drawn with its amino acid sequence

圖4　ProtScale預(yù)測(cè)的鵝ACAA2蛋白疏水性分布圖Fig.4　The putative hydrophobicity of ACAA2 protein predicted by ProtScale

圖5　HNN對(duì)鵝ACAA2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)示意圖Fig.5　The secondary structure of goose ACAA2 protein predicted by HNN

圖6　鵝ACAA2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型Fig.6　The putative tertiary structure of goose ACAA2 protein

*.P<0.05；GAPDH為內(nèi)參基因；數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示；n=5*.P<0.05；GAPDH was used as internal reference gene；all data are presented as “means ± SEM”；n=5圖7　填飼不同階段朗德鵝肝中ACAA2的mRNA水平Fig.7　The mRNA abundance of ACAA2 gene in the livers in Landes geese at different overfeeding stages

2.4葡萄糖、脂肪酸和胰島素對(duì)鵝ACAA2基因表達(dá)的調(diào)控

為了檢測(cè)ACAA2基因是否受脂肪代謝相關(guān)因子的調(diào)控，分別用不同濃度葡萄糖、脂肪酸(油酸和亞油酸)和胰島素處理鵝原代肝細(xì)胞。結(jié)果顯示，葡萄糖(100和200 mmol·L-1)對(duì)ACAA2基因的表達(dá)沒(méi)有顯著影響(圖8)，0.5 mmol·L-1的油酸能使ACAA2的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)(圖9)，0.25 mmol·L-1的棕櫚酸能顯著下調(diào)ACAA2基因的表達(dá) (P<0.05)(圖10)，而胰島素(100和200 nmol·L-1)都能使ACAA2的表達(dá)量降低，且差異顯著(P<0.05)，尤其是100 nmol·L-1胰島素處理的肝細(xì)胞，ACAA2的下調(diào)幅度較大(圖11)。

GAPDH為內(nèi)參基因；數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示；n=3。下同GAPDH was used as internal reference gene；all data are presented as” means ± SEM”；n=3.The same as below圖8　葡萄糖對(duì)鵝原代肝細(xì)胞中ACAA2基因表達(dá)的影響Fig.8　The influence of glucose on the mRNA abundance of ACAA2 in goose primary hepatocytes

*.P<0.05 。下同P<0.05.The same as below圖9　油酸對(duì)鵝原代肝細(xì)胞中ACAA2基因表達(dá)的影響Fig.9　The influence of oleate on the mRNA abundance of ACAA2 in goose primary hepatocytes

圖10　棕櫚酸對(duì)鵝原代肝細(xì)胞中ACAA2基因表達(dá)的影響Fig.10　The influence of palmitate on the mRNA abundance of ACAA2 in goose primary hepatocytes

圖11　胰島素對(duì)鵝原代肝細(xì)胞中ACAA2基因表達(dá)的影響Fig.11　The influence of insulin on the mRNA abundance of ACAA2 in goose primary hepatocytes

3討論

乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶2(ACAA2)在脂肪代謝中起著重要的作用。多種與脂肪代謝有關(guān)的藥物通過(guò)影響ACAA2 mRNA的合成調(diào)節(jié)脂類代謝[16-17]。此外，M.Doi 等研究表明，LPL受體基因可以激活A(yù)CAA2 基因的表達(dá)，從而降低動(dòng)物的肥胖癥狀[17]。然而，有關(guān)鵝ACAA2基因的研究至今未見報(bào)道。鑒于此，本研究利用ACAA2基因在物種間的保守性，設(shè)計(jì)了能特異擴(kuò)增鵝ACAA2的引物，擴(kuò)增所獲得的產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序，獲得了鵝ACAA2基因全長(zhǎng)編碼序列，共1 194 bp，編碼397個(gè)氨基酸。經(jīng)氨基酸比對(duì)分析，證實(shí)了所獲得的序列為鵝ACAA2的完整編碼序列。

關(guān)于鵝肥肝形成機(jī)理人們已有了初步的認(rèn)識(shí)，一般認(rèn)為是肝中脂肪合成和脂蛋白運(yùn)輸脂肪及脂肪酸β-氧化平衡的破壞，使得肝中脂肪異常沉積，繼而形成肥肝。通過(guò)對(duì)不同填飼階段肝中ACAA2的表達(dá)情況研究，發(fā)現(xiàn)填飼可顯著誘導(dǎo)ACAA2的表達(dá)，填飼初期其表達(dá)水平顯著升高，但隨著填飼時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)水平顯著下降。已知ACAA2分布于線粒體，參與脂肪酸的β-氧化和膽固醇的生物合成過(guò)程，填飼后肝合成甘油三脂(Triglyceride，TG)的速度會(huì)急劇增加，也使得肝中脂肪酸β氧化代償性增加，因而ACAA2基因的表達(dá)顯著升高，當(dāng)TG合成超過(guò)其輸出時(shí)，便會(huì)沉積在肝。隨著填飼時(shí)間的延長(zhǎng)，TG在肝中聚集增多，游離脂肪酸也增加，大量的游離脂肪酸在線粒體內(nèi)被氧化，產(chǎn)生過(guò)多的活性自由氧(ROS)，從而導(dǎo)致線粒體損傷，位于線粒體上的ACAA2基因表達(dá)下降，這意味著肝脂肪酸的β氧化減少，進(jìn)而導(dǎo)致脂肪在肝中沉積增多，促進(jìn)肥肝的形成。

肝脂肪合成受多種因子調(diào)節(jié)，胰島素是脂肪生成的主要調(diào)節(jié)因素，葡萄糖也是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子，胰島素可以促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)葡萄糖合成糖原，加快糖原轉(zhuǎn)變成脂肪，過(guò)量葡萄糖會(huì)在肝中轉(zhuǎn)化為以甘油三脂為主的脂肪，而脂肪酸能影響脂肪合成基因的表達(dá)。有研究表明填飼可使鵝血漿中葡萄糖、胰島素和脂肪酸的水平增加[18-19]。為了進(jìn)一步了解ACAA2與脂肪肝形成的關(guān)系，本研究用高葡萄糖、脂肪酸和胰島素處理鵝原代肝細(xì)胞，確定這些因子對(duì)該基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，脂肪酸和胰島素均可顯著影響ACAA2的表達(dá)，但葡萄糖對(duì)該基因表達(dá)的影響甚少。有趣的是，不飽和脂肪酸(即油酸)和飽和脂肪酸(即棕櫚酸)對(duì)ACAA2的表達(dá)存在差別調(diào)控，這與以往報(bào)道的研究結(jié)果一致，即不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸具有不同的生物學(xué)效應(yīng)[20]。而添加油酸可使ACAA2基因的表達(dá)量上調(diào)說(shuō)明在油酸誘導(dǎo)的脂肪變性模型中，脂肪酸線粒體氧化功能沒(méi)有受損，進(jìn)一步促進(jìn)了脂肪在肝中沉積。這些細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明ACAA2的表達(dá)調(diào)控與鵝脂肪肝的形成密切相關(guān)。

綜上所述，本研究克隆并測(cè)定了鵝ACAA2基因全長(zhǎng)CDS區(qū)，填飼可顯著誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，而且脂肪肝相關(guān)因子如高血脂和高胰島素血癥可調(diào)節(jié)其表達(dá)水平。這些結(jié)果表明，ACAA2基因在鵝肥肝形成中發(fā)揮重要作用，然而，其作用機(jī)制以及脂肪肝相關(guān)因子對(duì)該基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制還有待深入研究。

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(編輯郭云雁)

Cloning of Goose Acetyl-Coenzyme A Acyltransferase 2 and Its Expression Pattern in the Development of Fatty Liver

WANG Qian-qian，YANG Biao，XIA Li-li，SUN Xiao-xian，GENG Tuo-yu，GONG Dao-qing*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

Abstract:To explore the relationship betweenACAA2 gene and liver fatty metabolism in goose，35 Landes geese were divided into overfeeding group(15) and control group(20)，the overfeeding group included 3 periods：overfeeding 7，14 and 19 days.The full coding sequence (CDS) ofACAA2 was cloned by RT-PCR and analyzed，its expression levels at different stages of overfeeding were determined in both normal and fatty liver by qRT-PCR in Landes geese.In addition，goose primary hepatocytes were treated with glucose，fatty acids or insulin to determine how its expression was regulated during fatty liver formation.Data indicated that the complete CDS of gooseACAA2 was 1 194 bp and encoded 397 amino acids.TheACAA2 expression level in the livers of the overfed geese was significantly higher (P<0.05) than the control at every stage，and presented a declining trend with the extension of overfeeding time.Moreover，compared to the control，the expression ofACAA2 gene was significantly increased in the goose primary hepatocytes treated with 0.5 mmol·L-1oleate，but was decreased in the primary hepatocytes treated with 0.25 mmol·L-1palmitate and insulin with different concentrations (P<0.05).The results suggeste thatACAA2 expression is closely related to the development of goose fatty liver，which will provide a basis for further study the role ofACAA2 gene in the formation of goose fatty liver.

Key words:goose；Acetyl-coenzyme A acyltransferase 2；fatty liver；gene cloning

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.009

收稿日期：2015-08-24

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372298；31472086)；江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新項(xiàng)目(CX(12)2033)

作者簡(jiǎn)介：王倩倩(1988-)，女，山東棲霞人，碩士生，主要從事家禽分子營(yíng)養(yǎng)研究，E-mail：xiaoxiaoqian_qian@126.com *通信作者：龔道清，博士，教授，博士生導(dǎo)師， E-mail：yzgong@163.com

中圖分類號(hào)：S835；S813.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)04-0700-09