韓立強(qiáng)，郭豫杰，魯維飛，張　欣，褚貝貝，王　江，楊國(guó)宇，3*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，教育部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070； 3.河南省現(xiàn)代畜牧業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450002)

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豬MC4R基因突變體真核表達(dá)載體的構(gòu)建及功能研究

韓立強(qiáng)1，郭豫杰1，魯維飛1，張欣2，褚貝貝1，王江1，楊國(guó)宇1，3*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，教育部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070； 3.河南省現(xiàn)代畜牧業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450002)

摘要：為研究MC4R基因不同突變體的功能差異，本研究從豬肌肉組織中克隆得到MC4R基因的編碼序列，將克隆片段與pcDNA3.1真核表達(dá)載體進(jìn)行KpnⅠ 和EcoR Ⅰ雙酶切，連接形成重組表達(dá)載體MC4R1，將載體轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞后Western blotting 檢測(cè)蛋白表達(dá)。通過(guò)點(diǎn)突變法得到MC4R基因在707/892位點(diǎn)的3個(gè)突變載體，將突變載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到BHK細(xì)胞，采用免疫熒光對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞檢測(cè)熒光表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，克隆的MC4R1基因序列長(zhǎng)度大約1 000 bp，在707/892位點(diǎn)序列為G/G，將構(gòu)建的真核表達(dá)載體MC4R1轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，經(jīng)過(guò)Western blotting 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MC4R1蛋白正常表達(dá)；通過(guò)點(diǎn)突變法得到在707/892位點(diǎn)突變的突變載體MC4R2(G/A)、MC4R3(A/G)、MC4R4 (A/A)，經(jīng)過(guò)激光共聚焦觀察熒光表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，突變受體在細(xì)胞膜上均有正常表達(dá)，流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)4個(gè)突變受體表達(dá)的熒光平均強(qiáng)度并沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。通過(guò)構(gòu)建MC4R基因突變載體后發(fā)現(xiàn)，707/892位點(diǎn)突變對(duì)于MC4R受體在細(xì)胞膜的表達(dá)沒(méi)有顯著影響，其具體機(jī)制作用還需深入研究。

關(guān)鍵詞：豬；黑素皮質(zhì)素受體-4；突變體；表達(dá)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇和全基因選擇育種方式越來(lái)越受關(guān)注，而對(duì)于控制動(dòng)物性狀的功能基因的篩選和深入研究也成為熱點(diǎn)，黑素皮質(zhì)素受體-4 (MC4R)基因是豬育種的重要候選基因[1]。MC4R是下丘腦腹內(nèi)側(cè)核分泌的一類(lèi)肽類(lèi)物質(zhì)，屬于含7個(gè)跨膜區(qū)的G蛋白偶聯(lián)受體。MC4R是一個(gè)單拷貝基因，僅含有一個(gè)外顯子，其編碼序列長(zhǎng)度為996 bp，編碼322個(gè)氨基酸，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中黑皮素支路的傳導(dǎo)途徑，在機(jī)體內(nèi)通過(guò)與內(nèi)源性激動(dòng)劑α-MSH及拮抗劑Agouti蛋白的相互作用，調(diào)控機(jī)體的能量代謝和食欲[2-3]。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，MC4R基因的突變與機(jī)體的肥胖癥、胰島素水平及脂代謝水平相關(guān)。人MC4R基因突變與肥胖癥和II型糖尿病發(fā)生存在關(guān)聯(lián)[4]。敲除MC4R基因的小鼠出現(xiàn)遺傳性肥胖，表現(xiàn)多食、肥胖、胰島素分泌多等癥狀[5]；有研究發(fā)現(xiàn)，豬MC4R基因序列中892位點(diǎn)的錯(cuò)義突變A/G(Asp298Asn)能夠?qū)е率荏w與α-MSH親和力下降，與豬脂肪沉積(如背膘厚)和生長(zhǎng)速度(如測(cè)定期平均日增重)具有顯著關(guān)聯(lián)[6]。這種效應(yīng)在多個(gè)不同遺傳背景的豬群中得以驗(yàn)證，但在其他一些豬群中尚未確證[7]，因此它是否為真正的QTN仍處于爭(zhēng)論之中。B.Fan等在豬MC4R基因內(nèi)識(shí)別出5個(gè)新的SNPs，新發(fā)現(xiàn)的SNPs亦與脂肪沉積、平均日增重存在顯著關(guān)聯(lián)[8]。這些基因突變特別是其中的707位點(diǎn)的錯(cuò)義突變(Arg236His)對(duì)于MC4R受體的功能又具有什么樣的作用目前還不清楚。

本研究針對(duì)MC4R核酸序列的707/892位點(diǎn)的突變，構(gòu)建MC4R突變真核表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后研究突變載體的功能差異，對(duì)于揭示MC4R在豬的基因育種方面的機(jī)制具有一定的意義。

1材料與方法

1.1材料

Lipofectamine2000(Invitrogen)，Star XL擴(kuò)增 酶、DNA A-Tailing 試劑盒(TaKaRa)，DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(Tigen)，DPNⅠ、KpnⅠ、EcoR Ⅰ內(nèi)切酶(Thermo)，pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體(實(shí)驗(yàn)室自有)，DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)，胎牛血清(杭州四季青)，Opti-mem無(wú)血清培養(yǎng)基(Gibco)，0.25%胰酶(上海吉泰)，c-MYC Antibody(9E10)(Santa Cruz)，Alexa Fluor?488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)(Invitrogen)，抗熒光封片淬滅液(碧云天)，細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning)，二氧化碳培養(yǎng)箱、PCR儀(Thermo)，ImageQuantLAS4000生物分子成像儀(GE)，激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss LSM 5 PASCAL)，流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)。

1.2方法

1.2.1豬MC4R基因的克隆采用DNA提取試劑盒從成年大白豬的肌肉組織中提取總DNA，設(shè)計(jì)引物(表1)，引物序列中含有c-Myc標(biāo)簽蛋白的核酸序列及KpnⅠ和EcoR Ⅰ的酶切位點(diǎn)，用高保真Star XL擴(kuò)增酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收，將回收核酸片段采用加A試劑盒加polyA尾巴后，連接到pMD18T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，進(jìn)行篩選，獲得陽(yáng)性克隆，送上海生工測(cè)序，獲得MC4R序列。

1.2.2MC4R基因真核載體的構(gòu)建將測(cè)序正確的MC4R質(zhì)粒分別進(jìn)行KpnⅠ、EcoR Ⅰ雙酶切，酶切體系為酶各0.5 U，質(zhì)粒1 μg，Buffer 1 μL，超純水6 μL，在37 ℃酶切過(guò)夜，切膠回收，同時(shí)將pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體進(jìn)行同樣的雙酶切回收，將目的基因的回收片段與載體回收片段在T4 連接酶的作用下進(jìn)行連接，將連接片段轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后篩選陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒測(cè)序，獲得序列正確的重組載體MC4R1，準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)。

表1MC4R基因克隆引物及點(diǎn)突變引物

Table 1Primers for theMC4Rgene clone and mutation

基因Gene引物(5'-3')PrimerMC4R-cloneF-GGGGGTACCGCCACCATGGAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAGGATCTGAACTCAACCCATCACR-CCGGAATTCTTAATATCTGCTAGACAAATCMC4R-muta-tion(707)F-GGCACTGGCACCATCCACCAAGGTGCCAACATGR-CATGTTGGCACCTTGGTGGATGGTGCCAGTGCCMC4R-muta-tion(892)F-GTAATTCCATCATCAATCCCCTGATTTATGCACTCR-GAGTGCATAAATCAGGGGATTGATGATGGAATTAC

引物序列中酶切位點(diǎn)用方框表示，c-Myc標(biāo)簽序列用下劃線(xiàn)表示

In primer sequences，the boxes represent restriction sites and underlines represent c-Myc tag sequences

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染將培養(yǎng)好的BHK細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，按比例分散培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)板中，等到細(xì)胞達(dá)到80%的融合度時(shí)，棄去培養(yǎng)基，配置轉(zhuǎn)染試劑(Opti-mem+質(zhì)粒+Lipofectamine2000)，室溫孵育20 min后，加入24孔板，轉(zhuǎn)染6 h后，棄去轉(zhuǎn)染試劑，更換新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)以空載體作為對(duì)照組，培養(yǎng)過(guò)夜后進(jìn)行Western blotting 檢測(cè)。

1.2.4Western blotting 檢測(cè)MC4R蛋白表達(dá)將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞板中細(xì)胞用PBS洗 3遍，然后每孔加入裂解液150 μL RIPA(1%PMSF)，吹打細(xì)胞，收集到離心管中，冰浴30 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清加入20%的蛋白上樣buffer在100 ℃煮10 min，得到細(xì)胞蛋白提取液，進(jìn)行Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參，ECL顯影后在生物分子成像儀內(nèi)成像分析。

1.2.5MC4R基因4個(gè)不同突變體真核載體的構(gòu)建針對(duì)MC4R克隆序列，分別在707、892位點(diǎn)處設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物(表1)，以克隆質(zhì)粒20倍稀釋為模板進(jìn)行PCR，Star XL 0.4 μL，buffer 4 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各0.2 μL，模板1 μL，加水體積到20 μL，PCR循環(huán)數(shù)為15，同時(shí)做陰性對(duì)照(加模板不加引物)，反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物1 μL，加入DpnⅠ酶1 μL，37 ℃酶切過(guò)夜，將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鋪板挑選陽(yáng)性菌(陰性對(duì)照板上不長(zhǎng)菌)。將陽(yáng)性菌送上海生工測(cè)序，驗(yàn)證突變效果。將測(cè)序突變正確的序列分別進(jìn)行KpnⅠ、EcoRⅠ雙酶切，切膠回收后與pcDNA3.1載體回收片段在T4 連接酶的作用下進(jìn)行連接，形成不同突變序列的MC4R真核表達(dá)載體，將連接片段轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后篩選陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證序列的正確性，獲得正確的突變序列，準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)和免疫熒光觀察。

1.2.6MC4R基因不同突變載體的免疫熒光觀察在24孔板中加入細(xì)胞爬片，接種BHK細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜后，將4種突變載體質(zhì)粒MC4R1～MC4R4分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24 h后將細(xì)胞用PBS洗3次，每次5 min；棄去PBS，4%多聚甲醛固定10 min；PBS洗3次，每次5 min；棄去PBS，對(duì)細(xì)胞直接用封閉液(90%PBS+10%胎牛血清)封閉1 h；棄封閉液，一抗c-MYC Antibody(9E10)(1∶250)4 ℃過(guò)夜，PBS洗3次，加入熒光標(biāo)記二抗Alexa Fluor?488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)(1∶500)室溫避光孵育1 h；PBS洗3次，在熒光顯微鏡下檢測(cè)是否有熒光表達(dá)；暗室中將細(xì)胞爬片夾出，在載玻片上滴加一滴抗熒光封片淬滅液，將細(xì)胞爬片有細(xì)胞一側(cè)扣在淬滅液上，爬片周?chē)梅馄瑒┻M(jìn)行封片，晾干放4 ℃，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光表達(dá)。1.2.7流式細(xì)胞法檢測(cè)不同突變載體的熒光表達(dá)將4種突變載體質(zhì)粒MC4R1～MC4R4分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以空載體作為對(duì)照，培養(yǎng)48 h后用胰酶消化，將細(xì)胞移入1.5 mL離心管中，1 000 r·min-1離心10 min，加入預(yù)冷的PBS洗滌1次，離心，1 mL 4%多聚甲醛室溫固定20 min，離心洗滌，加入封閉液室溫封閉1 h，離心洗滌，加入一抗c-MYC Antibody(9E10)，4 °C過(guò)夜孵化，離心洗滌細(xì)胞，標(biāo)記熒光二抗Alexa Fluor?488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)，輕輕吹打混勻，室溫避光孵育1 h，洗滌細(xì)胞，將細(xì)胞重新懸浮于500 μL PBS中，輕輕混勻，置流式管中上機(jī)檢測(cè)，試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度數(shù)值，利用SPSS軟件對(duì)各個(gè)突變體間的熒光強(qiáng)度差異進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1MC4R1基因的克隆

以提取的豬肌肉組織DNA作為模板進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳后發(fā)現(xiàn)，在大約1 000 bp處有明顯的目的條帶(圖1)，回收后經(jīng)測(cè)序確認(rèn)所得條帶的序列與MC4R1基因標(biāo)準(zhǔn)序列相符，其中在707/892位點(diǎn)的序列為G/G。

圖1　MC4R基因的PCR結(jié)果Fig.1　PCR amplification result of MC4R gene

2.2MC4R1基因真核載體的構(gòu)建

將獲得的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后篩選陽(yáng)性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗(yàn)證，形成大約5 400 bp 的pcDNA3.1載體片段和大約1 000 bp的MC4R1目的基因片段(圖2)，表明載體構(gòu)建成功。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.原質(zhì)粒；2.質(zhì)粒雙酶切M.Marker；1.MC4R1 vector；2.Digestion of MC4R1 vector by KpnⅠand EcoR Ⅰ圖2　MC4R1真核載體質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2　Double restriction enzyme digestion and identification of MC4R1 eukaryotic expression vector

+.MC4R1組；-.對(duì)照組+.Group of MC4R1 vector；-.Group of pcDNA3.1圖3　MC4R1蛋白表達(dá)的Western blotting檢測(cè)Fig.3　The protein expression of MC4R1 by Western blotting

2.3Western blotting 檢測(cè)MC4R1蛋白表達(dá)

對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞提取蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)參GAPDH在試驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)都有正常表達(dá)，MC4R1蛋白在試驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)，在對(duì)照組細(xì)胞(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體)內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)到MC4R1蛋白的表達(dá)(圖3)，結(jié)果表明真核載體MC4R1構(gòu)建成功。

2.4MC4R基因突變真核載體的構(gòu)建

將T載體上的MC4R序列經(jīng)過(guò)點(diǎn)突變后，用KpnⅠ、EcoR Ⅰ進(jìn)行雙酶切，獲得大約1 000 bp的目的片段和大約2 600 bp的T載體片段(圖4)，然后分別將目的片段回收后與pcDNA3.1真核表達(dá)載體酶切片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后得到陽(yáng)性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證后獲得在707/892位點(diǎn)突變的3個(gè)突變載體MC4R2 (G/A)、MC4R3 (A/G)、MC4R4 (A/A)。

2.5MC4R基因不同突變載體的免疫熒光觀察

將構(gòu)建好的MC4R基因4個(gè)突變真核載體分別轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞后，進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，標(biāo)記后采用激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)熒光主要在細(xì)胞膜上顯示(圖5)，表明此時(shí)MC4R受體基因在細(xì)胞膜上正常表達(dá)。

2.6流式細(xì)胞法檢測(cè)不同突變載體的熒光表達(dá)

通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)MC4R1～MC4R4載體染后陽(yáng)性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(圖6)，與MC4R1、MC4R2和MC4R4相比，MC4R3的陽(yáng)性細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度有所增加，但通過(guò)顯著性檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)4種受體的陽(yáng)性細(xì)胞熒光強(qiáng)度之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.突變體MC4R2；2.突變體MC4R3；3.突變體MC4R4M.Marker；1.Mutations of MC4R2；2.Mutations of MC4R3；3.Mutations of MC4R4圖4　MC4R不同突變體雙酶切鑒定圖Fig.4　Double restriction enzyme digestion and identification of MC4R mutations by KpnⅠ and EcoR Ⅰ

3討論

自從I.Gantz在1993年克隆了人的MC4R基因[9]，MC4R已經(jīng)分別從大鼠、小鼠、豬、羊、牛和一些其他的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物組織中克隆到序列，比對(duì)發(fā)現(xiàn)氨基酸序列在這些物種間是高度保守的[10]。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有5種黑皮質(zhì)素受體(MCRs)介導(dǎo)黑皮質(zhì)素的作用，根據(jù)它們的序列被發(fā)現(xiàn)的次序，分別命名為MC1R、MC2R、MC3R、MC4R和MC5R[11]，MC4R主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，能夠調(diào)控能量平衡和攝食[12]。本研究中，通過(guò)設(shè)計(jì)引物對(duì)豬MC4R基因進(jìn)行克隆，經(jīng)測(cè)序獲得正確的豬MC4R基因序列，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后經(jīng)過(guò)Western blotting 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MC4R1蛋白表達(dá)正常，表明載體構(gòu)建成功。

圖5　MC4R1～MC4R4的免疫熒光觀察Fig.5　Fluorescence observation of MC4R1-MC4R4 vectors

A.陽(yáng)性細(xì)胞；B.平均熒光強(qiáng)度A.Positive cells;B.MFI圖6　MC4R1～MC4R4的熒光強(qiáng)度檢測(cè)Fig.6　Fluorescence intensity of MC4R1-MC4R4 vectors

真核細(xì)胞內(nèi)基因的編碼序列發(fā)生突變可能會(huì)引起基因功能的改變。MC4R作為一種膜蛋白受體，突變基因的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物可能通過(guò)以下幾種方式影響受體功能：①受體在細(xì)胞表面表達(dá)缺陷；②受體與配體親和力下降；③受體與配體結(jié)合后與G蛋白偶聯(lián)過(guò)程異常，無(wú)法產(chǎn)生相應(yīng)cAMP[13-14]。在本研究中，針對(duì)豬MC4R基因的主要突變位點(diǎn)，通過(guò)點(diǎn)突變的方法獲得4個(gè)MC4R的錯(cuò)義突變真核表達(dá)載體，這4個(gè)突變體在707/892位點(diǎn)的基因序列分別為G/G、G/A、A/G、A/A，相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列改變?yōu)锳rg/Asp、Arg/Asn、His/Asp、His/Asn。本研究對(duì)這4種突變體在細(xì)胞上的表達(dá)進(jìn)行了功能鑒定。MC4R作為一種膜受體，抗體主要對(duì)細(xì)胞膜上的表達(dá)蛋白進(jìn)行標(biāo)記，所以當(dāng)細(xì)胞膜顯示綠色熒光(圖5)時(shí)，即表明載體表達(dá)出的MC4R蛋白受體在細(xì)胞膜上都能夠正常表達(dá)。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)受體的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)4種突變體轉(zhuǎn)染后的陽(yáng)性細(xì)胞在細(xì)胞膜上的熒光表達(dá)值沒(méi)有差異(圖6)，表明707/892位點(diǎn)突變沒(méi)有對(duì)細(xì)胞表面的受體表達(dá)產(chǎn)生缺陷，因此其引起的功能差異可能更傾向于與配體結(jié)合及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面。

其他研究中對(duì)人MC4R基因中20個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因突變，激光共聚焦檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其中很多位點(diǎn)在細(xì)胞膜上的表達(dá)正常，而在配體偶聯(lián)和信號(hào)傳導(dǎo)方面功能異常[15]。MC4R受體作為一種G蛋白偶聯(lián)受體，與其配體結(jié)合能夠啟動(dòng)G蛋白偶聯(lián)的信號(hào)系統(tǒng)，活化腺苷酸環(huán)化酶，引起細(xì)胞內(nèi)cAMP上升，介導(dǎo)細(xì)胞的一系列生理生化活動(dòng)，而突變MC4R蛋白此能力可能會(huì)有所變化。關(guān)于豬MC4R突變體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究，K.S.Kim等[6]采用I標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)豬MC4R在892位點(diǎn)的突變能夠減少M(fèi)C4R受體產(chǎn)生cAMP的功能，而其他研究在293細(xì)胞上分析了892位點(diǎn)的突變對(duì)于MC4R受體的結(jié)合性及與G蛋白偶聯(lián)產(chǎn)生cAMP的功能影響，發(fā)現(xiàn)這兩種突變對(duì)于MC4R受體的功能沒(méi)有影響[16]，這些相互矛盾的結(jié)果還需要后續(xù)的研究進(jìn)行辨別，特別是其中的差異是不是由于在707位點(diǎn)(Arg236His)的突變引起的連鎖變化，現(xiàn)在還不得而知。顯然，構(gòu)建707/892位點(diǎn)突變載體來(lái)研究這些突變對(duì)于MC4R受體與配體的結(jié)合及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，對(duì)于更加深入的理解豬MC4R基因突變?cè)诨蚪M和遺傳方面的功能差異具有一定的科學(xué)價(jià)值。

致謝：本研究在試驗(yàn)條件方面得到了華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的大力支持，在此表示感謝。

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(編輯郭云雁)

Construction and Function Confirmation of MC4R Gene Eukaryotic Expression Vector with Different Mutations

HAN Li-qiang1，GUO Yu-jie1，LU Wei-fei1，ZHANG Xin2，CHU Bei-bei1，WANG Jiang1，YANG Guo-yu1，3*

(1.KeyLaboratoryofAnimalBiochemistryandNutritionofMinistryofAgriculture，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China；2.KeyLaboratoryofAgriculturalAnimalGenetics，BreedingandReproductionofMinistryofEducation，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China；3.HenanCollaborativeInnovationCenterofModernAnimalHusbandry，Zhengzhou450002，China)

Abstract:To investigate the function difference of the different Melanocortin-4 receptor (MC4R) gene mutants，the complete coding sequence( CDS) ofMC4Rgene were cloned from pig muscle tissues.The CDS sequence was linked with pcDNA3.1 vector by digested with restriction endonuclease ofKpnⅠ andEcoR Ⅰ and the recombinant eukaryotic expression vectorMC4R1 was constructed.After recombinantMC4R1 plasmid transfected into BHK cells，the protein expression of MC4R1 was confirmed by Western blotting.Simultaneously，3 site-directedMC4RcDNA mutant (707/892 site) vectors were generated.The protein expression of MC4R mutations vector was observed in transiently transfected BHK cell by Laser Scanning Confocal Microscopy and Flow Cytometry ananlysis.The results indicated that the CDS sequence ofMC4R1 gene was about 1 000 bp and the sequence of 707/892 site was G/G.The protein expression of MC4R1 was confirmed in BHK cells using Western blotting.Three site-directed mutant eukaryotic vectorMC4R2，MC4R3，MC4R4 were constructed and the sequence of 707/892 site was G/A，A/G，A/A，respectively.Confocal microscopy showed that every mutant ofMC4Rreceptor were expressed well on the cell surface by the Immunofluorescence.There were no significant difference of the fluorescence intensity between mutants of MC4R receptors(P>0.05)by FCM.The construction and functional research ofMC4Rvector suggest that the mutants of 707/892 site has no significant impact on the expression of MC4R receptor on cell surface.This will provide technological platform for further research in the role ofMC4Rgene.

Key words:pig；MC4R；mutation；expression

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.006

收稿日期：2015-05-04

基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)部“引進(jìn)國(guó)際先進(jìn)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)”(948)重點(diǎn)項(xiàng)目(2011-G35)；國(guó)家轉(zhuǎn)基因重大專(zhuān)項(xiàng)(2014ZX0801015B)；鄭州市科技攻關(guān)項(xiàng)目(141PPTGG430)

作者簡(jiǎn)介：韓立強(qiáng)(1979-)，男，河南新鄉(xiāng)人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物基因功能的研究，Tel：0371-63558180，E-mail: qlahn2001@126.com *通信作者：楊國(guó)宇，教授，博士，主要從事動(dòng)物生物化學(xué)研究，E-mail：haubiochem@163.com

中圖分類(lèi)號(hào)：S828；S813.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)04-0679-07