王 爽 張毅強 蘭曉瑜 程牛亮 李美寧（山西醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，山西 太原 030001）

?

設計VEGF的G四鏈體誘導結腸癌細胞凋亡的研究

王 爽 張毅強 蘭曉瑜 程牛亮 李美寧*
（山西醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，山西 太原 030001）

【摘要】目的 pu22寡核苷酸序列作用于VEGF基因使VEGF啟動子區(qū)形成G-四鏈體，干擾VEGF基因的表達從而促進HCT116細胞和SW480細胞的凋亡。方法 設計合成的pu22和mutpu22攝取到細胞后，在pu22不同濃度作用下，通過實時定量PCR實驗檢測VEGF基因的表達情況，利用免疫印跡實驗檢測VEGF蛋白表達水平；通過細胞凋亡實驗檢測兩種結腸癌細胞凋亡的情況。結果 熒光實時定量PCR與免疫印跡實驗結果顯示處理組的兩種結腸癌細胞株HCT116與SW480用8 μL/L的PU22處理48 h后VEGF的表達最低，其相對表達值均顯著低于正常細胞組及空白對照組。細胞凋亡實驗結果表明兩種細胞處理組凋亡率均大于相應的正常組與對照組。結論 寡核苷酸序列PU22對殺傷結腸癌細胞起著顯著的作用。

【關鍵詞】VEGF；G-四鏈體；pu22

結直腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一。抑制血管生成是阻遏腫瘤生長的一種策略，Vegf是控制血管生成的主要基因之一。本實驗設計了針對VEGF啟動子區(qū)域的G四鏈體PU22，在結腸癌細胞攝取PU22后檢測VEGF基因RNA和蛋白質的表達，分析細胞增殖和凋亡的情況，從而探討PU22對VEGF基因表達的影響與結腸癌增殖與凋亡的關系，研究PU22對結腸癌細胞的影響。為尋找結腸癌新藥的研發(fā)和治療方法奠定了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 PU22與mutPU22：PU22序列5'-CGGGGCGGGCCGGGGGCGGGG T-3'［1-5］，mutPU22序列5'-CGAGTCGCGCCGAGTGCGAGAT-3'。人工合成的PU22與mutPU22用培養(yǎng)基溶解，95 ℃煮沸5 min，-20 ℃保存。

1.2 分析細胞攝取寡核苷酸PU22實驗：用8 mmol/L帶有FITC熒光的PU22作用已經爬好片的細胞中，培養(yǎng)72 h后取出去上清，依次進行固定，染色，封片，照相，結果分析。

1.3 熒光實時定量PCR分析：用TriZol法提取經不同處理的細胞總RNA，將其反轉錄成CDNA，進行熒光實時定量PCR。

圖1 2種細胞攝取PU22的情況

圖2 實時定量檢測PU22作用前后結腸癌細胞VEGF基因RNA表達情況

圖3 Western blotting檢測經不同條件作用后結腸癌細胞VEGF蛋白表達情況

圖4 PU22作用48 h后結腸癌細胞凋亡情況

1.4 western blotting分析：不同處理的細胞，提取細胞總蛋白。后測量蛋白濃度。將所提的蛋白依次進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、封閉、免疫學反應、顯影與結果分析。

1.5 流式細胞儀（FCM）檢測細胞凋亡：通過PU22作用后的細胞去培養(yǎng)液，收集細胞，過濾細胞，1000rpm離心5 min，去多余上清，混勻細胞，5 μL Annexin V-FITC和10 μL 20 μg/mL的碘化丙錠溶液，混勻后室溫避光孵育20 min，加250 μL PBS，流式細胞儀分析。

2 結 果

2.1 人工合成的PU22被攝入人結腸癌細胞中：見圖1顯示，圖1中藍色熒光為細胞核所在的位置。用帶有綠色熒光標記的PU22處理細胞72 h后觀察結果。結果表明HCT116和SW480細胞內可觀察到綠色熒光，且攝取率為90%以上。說明細胞可以高效地攝取寡核苷酸PU22。

2.2 PU22抑制結腸癌細胞VEGF基因RNA表達：PU22作用后結腸癌細胞中VEGF的RNA表達情況，用熒光實時定量PCR技術檢測。本實驗分為正常組（細胞未經過處理）、mut組（細胞用mutPU22處理）、6 μL/L組（細胞用6 μL/L PU22處理）、8 μL/L組（細胞用8 μL/L PU22處理）、10 μL/L組（細胞用10 μL/L PU22處理）。將正常組細胞的VEGF的RNA表達量設為1。實驗結果顯示人結腸癌細胞株HCT116和SW480經不同濃度PU22作用后細胞中VEGF基因RNA的表達量皆有降低，其中作用最明顯的濃度為8 μL/L，最佳時間為48 h。而經mutPU22作用的細胞中VEGF基因RNA的表達無明顯變化，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見圖2。

2.3 PU22抑制結腸癌細胞VEGF基因蛋白表達比較：PU22作用后結腸癌細胞中VEGF的蛋白表達情況用Western blotting技術檢測。本實驗將8 μL/L PU22處理過細胞設為處理組；未經處理過的細胞設為正常組；用mutPU22處理過的細胞設為對照組。結果表明人結腸癌細胞株HCT116和SW480經不同條件作用后，細胞中VEGF蛋白的表達量皆有降低，且皆有統(tǒng)計學差異。48 h SW480蛋白表達量降低最顯著。見圖3。

2.4 PU22作用48 h后促進結腸癌細胞凋亡：Annexin V-FITC/PI法檢測細胞在不同條件下處理48 h后細胞凋亡情況。見圖4顯示，HCT116細胞的處理組、正常組、對照組，其細胞凋亡率分別為42.46%、11.06%、28.78%。其中處理組細胞凋亡率大于正常組和對照組。SW480細胞的處理組、正常組、對照組，其細胞凋亡率分別為69.14%、14.31%、32.95%。其中處理組細胞凋亡率大于正常組和對照組。結果表明PU22促進HCT116與SW480細胞凋亡。

3 討 論

結直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。在世界癌癥研究基金會報告（WCRF/AICR 2007）［6］中，大腸癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第3位，其病死率在全世界排名第2位［7］。因此結腸癌的治療方法的研究已成為腫瘤研究的重要課題。

VEGF是癌癥中強效的促進血管生長因子，腫瘤細胞通過VEGF誘導血管生成，使其提供充分的氧氣和營養(yǎng)物質［8］。近年來通過抑制VEGF從而達到殺傷結腸癌細胞的研究很多，如節(jié)律卡培他濱也是通過調節(jié)VEGF基因從而達到抗腫瘤的作用［9］。然而節(jié)律卡培他濱作用人體時易產生骨髓抑制、消化系統(tǒng)反應和手足綜合征等不良反應。G-四鏈體是一種指依靠鳥嘌呤連接起來的四鏈DNA螺旋結構。由于癌細胞分裂非常迅速，染色體容易出現缺失，所以G-四鏈體分子可能唯一存在于癌細胞中。如果這樣的話，G-四鏈體的任何癌癥治療都不會傷害健康細胞，這為癌癥治療開起了的新的研究與治療的方向。

VEGF等幾種癌癥相關基因的啟動子內含有一個能夠形成G-四鏈體的核酸酶超敏感區(qū)域［11］。我們研究顯示，體外寡核苷酸鏈形成的G-四鏈體也可以下調VEGF基因，從而誘導結腸癌細胞凋亡。確定結腸癌細胞攝取PU22寡核苷酸后，我們研究發(fā)現，用PU22處理過的SW480和HCT116細胞，其RNA與蛋白表達量皆低于正常組與對照組，且最佳濃度為8 μL/L最佳作用時間為48 h，HCT116細胞VEGF基因的抑制率低于SW480細胞，出現此現象的原因可能由于PU22濃度過高或作用時間長從而誘導細胞分泌大量的解G-四鏈體的解旋酶，HCT116細胞的惡性程度比SW480高等原因產生的。PU22作用SW480和HCT116細胞48 h后，兩種細胞處理組凋亡率皆大于相應的正常組與對照組。表明PU22可以通過抑制VEGF基因，達到提高細胞凋亡的作用。

本研究是將體外合成的寡核苷酸PU22形成的G-四鏈體攝入結腸癌細胞內，促進細胞內VEGF基因的啟動子中PU22序列形成G-四鏈體，抑制VEGF基因的表達，從而促使結腸癌細胞凋亡，抑制結腸癌細胞的生長與增殖。綜上所述，本研究可以選擇性的殺傷結腸癌細胞，為治療結腸癌帶來了一個新希望。本實驗為結腸癌新藥材的研發(fā)和治療提供了新的手段。

參考文獻

［1］Agrawal P，Hatzakis E，Guo K，et al.Solution structure of the major G-quadruplex formed in the human VEGF promoter in K+: insights into loop interactions of the parallel G-quadruplexes［J］. Nucleic Acids Res，2013，41（22）:10584-10592.

［2］Sun D，Guo K，Rusche JJ，et al.Facilitation of a structural transition in the polypurine/polypyrimidine tract within the proximal promoter region of the human VEGF gene by the presence of potassium and G-quadruplex-interactive agents［J］.Nucleic Acids Res，2005，33（18）: 6070-6080.

［3］Sun D，Guo K，Shin YJ.Evidence of the formation of G-quadruplex structures in the promoter region of the human vascular endothelial growth factor gene［J］.Nucleic Acids Res，2011，39（4）:1256-1265.

［4］Biff1 G，Tannahill D，Balasubramanian S.Quantitative visualization of DNA G-quadruplex structures in human cells［J］.Nat Chemistry，2013，5（3）:182-186.

［5］Marusic M，Rakesh NV，Wengel J，et al.G-rich VEGF aptamer with locked and unlocked nucleic acid modifcations exhibits a unique G-quadruplex fold［J］.Nucleic Acids Res，2013，41（20）:9524-9536.

［6］Wiseman M.The second World Cancer Research Fund/American Institute for Cancer Research expert report.Food，nutrition，physical activity，and the prevention of cancer:a global perspective［J］.Proc Nutr Soc，2008，67（3）:253-256.

［7］Siegel R，Ward E，Brawley O，et al.Cancer statistics，2011:The impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（4）:212-236.

［8］Carmeliet P.VEGF as a key mediator of angiogenesis in cancer［J］. Oncology，2005，69（3）:4-10.

［9］Rak J，Mitsuhashi Y，Bayko L.Mutant ras Oncogenes Upregulate VEGF/VPF Expression:Implications for Induction and Inhibition of Tumor Angiogenesis［J］.Cancer Res，1995，55（20）:4575-4580.

［10］Huppert JL，Balasubramanian S.G-quadruplexes in promoters throughout the human genome［J］.Nucleic Acids Res，2007，35（2）:406-413.

［11］Bochman ML，Paeschke K，et al.DNA secondary structures: stability and function of G quadruplex structures［J］.Reviews，2012，13（11）:770-780.

· 臨床研究 ·

中圖分類號：R735.3+5

文獻標識碼：B

文章編號：1671-8194（2016）13-0039-03

基金項目：山西省青年科技基金（2011021035-1）