陳俊??李姬梅??李偉??胡紅梅.井岡山大學附屬醫(yī)院口腔科，吉安?4000；.江西省吉水縣人民醫(yī)院婦產科，吉水?600 .井岡山大學醫(yī)學院解剖學與組織胚胎學教研室，吉安?4000

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中期因子和微血管密度在涎腺腺樣囊性癌組織中的表達

陳俊1李姬梅2李偉1胡紅梅3
1.井岡山大學附屬醫(yī)院口腔科，吉安?343000；2.江西省吉水縣人民醫(yī)院婦產科，吉水?331600 3.井岡山大學醫(yī)學院解剖學與組織胚胎學教研室，吉安?343000

[摘要]目的 探討中期因子（MK）、微血管密度（MVD）在涎腺腺樣囊性癌（SACC）組織中的表達和意義，以及兩者之間表達的相關性。方法 采用免疫組織化學方法（SP法）檢測60例SACC組織及26例正常涎腺組織中MK、MVD的表達狀況及兩者之間的相關性。結果 MK在SACC組織中高表達，陽性表達率為70.0%（42/60），正常組織中未見MK表達，二者間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。SACC中MVD計數(shù)為38.73±8.96，正常涎腺組織中MVD計數(shù)為11.15±3.33，二者間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。MK、MVD的表達與年齡、性別、分型無關（P＞0.05）；與腫瘤的大小、淋巴結轉移、TNM分期有關（P＜0.05）。MK和MVD在SACC中的表達具有正相關性（r=0.560，P＜0.05）。結論 MK蛋白的表達、MVD計數(shù)的增加與SACC的發(fā)生有關，可能是SACC早期診斷指標之一。

[關鍵詞]涎腺腺樣囊性癌； 中期因子； 微血管密度； 免疫組織化學； 涎腺

涎腺腫瘤（salivary?gland?tumors，SGT）是口腔頜面部常見的腫瘤，以中老年居多，在全球范圍內涎腺腫瘤的發(fā)病率居全身腫瘤的1%~4%[1-2]。涎腺腺樣囊性癌（salivary?adenoid?cystic?carcinoma，SACC）過去曾稱“圓柱瘤”（cylindroma），是最常見的唾液腺惡性腫瘤之一，臨床病理已證實，此腫瘤浸潤性極強，易沿神經擴散，易侵入血管，常造成血行性轉移。中期因子（midkine，MK）是近來新發(fā)現(xiàn)的一種自分泌型肝素結合生長因子，在乳腺癌、肺癌、胃癌、宮頸癌、骨髓瘤、口腔鱗狀細胞癌等多種惡性腫瘤中，MK均呈高表達，并且證實與腫瘤血管新生有密切關系。微血管密度（microvessel?density，MVD）1992年由Weidner等[3]報道，它是用來計數(shù)腫瘤內血管生成的數(shù)量。但MK和MVD在SACC中的相關報道較少。本研究旨在通過研究MK與MVD 在SACC中的表達是否具有相關性，來探討MK在促進腫瘤血管生成中的作用以及腫瘤微血管與腫瘤本身的關系。

1??材料和方法

1.1??標本來源

標本來源于南昌大學附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科2001年1月—2011年8月手術切除并經病理證實的60例SACC組織和26例正常涎腺組織。SACC患者中男性25例，女性35例，年齡17~80歲，平均年齡為50.4歲；根據(jù)腫瘤生長部位，其中舌下腺16例，腭腺14例，下頜下腺6例，腮腺13例，磨牙后腺11例；有淋巴結轉移9例，無淋巴結轉移有51例。根據(jù)2005年世界衛(wèi)生組織（World?Health?Organization，WHO）唾液腺腫瘤組織病理學分類標準，對60例SACC進行病理分類，其中篩狀型20例，管狀型21例，實性型19例；通過病理分級檢測瘤組織的成熟程度，其中高分化20例，中分化25例，低分化15例；按2002年國際抗癌聯(lián)盟（Union?for?International?Cancer?Control，UICC）涎腺癌國際標準，對60例SACC作TNM分期，其中T1為17例，T2為22例，T3+T4為21例。所有患者術前均未接受放化療。

1.2??試劑

MK兔抗人多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；MVD鼠抗人單克隆抗體、SP試劑盒及DAB（福建邁新生物技術有限公司）。

1.3??方法

所有標本均經4%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片4張，MK蛋白和由CD34標記的MVD均采用免疫組織化學SP法，MK的工作濃度1︰500，DAB染色，實驗程序按試劑盒說明進行，PBS代替一抗空白對照。

1.4??結果判定

1.4.1???MK的結果判定標準 ??MK蛋白在腫瘤細胞漿和（或）細胞膜中表達，判定陽性反應依據(jù)以下兩個方面：1）按顯色強度：細胞無染色記0分，呈黃色記1分，呈棕黃色記2分，呈棕褐色記3分；2）按陽性細胞百分比評分：按光鏡下（×400）隨機選10個視野，每個視野計數(shù)100個細胞。計數(shù)細胞若＜25% 為1分，25%~50%為2分，＞50%為3分；兩個方面的乘積＞3分計為陽性，≤3分計為陰性。

1.4.2??CD34的結果判定及血管計數(shù)方法 ?用Weidner 等[3]報道的方法，陽性標準為：1）每1個染成棕黃色的，可以與周圍血管、腫瘤細胞及其他結締組織相分離的血管內皮細胞或內皮細胞簇，認定為1個單一的計數(shù)的微血管。2）可能源于同一微血管的內皮細胞，如染色清晰且相互分離，也可作為單獨的微血管計數(shù)。3）血管腔內有無紅細胞不是確認微血管的必備條件。4）對腫瘤細胞稀疏區(qū)及鄰近良性組織區(qū)域內的血管不進行計數(shù)。5）對管腔直徑＞10個紅細胞的血管不進行計數(shù)。計數(shù)方法：先在低倍鏡下（×40）觀察整個切片，尋找高血管密度區(qū)，即“熱點”，然后在高倍鏡下（×200）計數(shù)被染成棕黃色的血管數(shù)目，再計數(shù)4個高倍鏡視野下血管的數(shù)目，此操作由兩個人采用雙盲法執(zhí)行，取兩人計數(shù)結果的平均值作為MVD列入分析。

1.5??統(tǒng)計學方法

采用SPSS?17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，對實驗結果采用卡方檢驗和（或）精確概率計算法，對相關性采用Spearman相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2??結果

在60例SACC中，MK陽性表達者42例，陽性表達率為70.0%（42/60）；正常涎腺組織中未見MK陽性表達，二者間差異有統(tǒng)計學意義（χ2=51，P= 0.00）。在癌細胞中，MK主要位于細胞漿及核膜，呈黃色或棕黃色顆粒狀物質（圖1）。

圖 ?1??MK在SACC組織中呈陽性表達 ?SP??×?400Fig?1??The?positive?expression?of?MK?in?SACC??SP??×?400

CD34標記的MVD染色主要是定位于新形成血管的內皮上，呈黃色或棕黃色，腫瘤灶的邊緣處為染色最密集的區(qū)域，顯微鏡下觀察，有些SACC的新生血管已經形成了管腔樣結構，有些新生的血管的內皮細胞只是呈星點狀或線條狀分布，MVD在SACC組織中呈陽性表達（圖2、3）。SACC中MVD計數(shù)（38.73±8.96）明顯高于正常涎腺組織（11.15± 3.33），二者間差異有統(tǒng)計學意義（t=15.920，P= 0.00）。

圖 ?2??MVD在SACC組織中呈陽性表達 ?SP??×?400Fig?2??The?positive?expression?of?MVD?in?SACC??SP??×?400

圖 ?3??新生血管的形態(tài)與結構 ?SP??×?400Fig?3??The?morphology?and?structure?of?neovascularization??SP??×?400

MK在SACC組織中的陽性表達與患者的年齡、性別、分型及腫瘤分布的部位無關（P＞0.05），而與腫瘤范圍大小、淋巴結轉移、TNM分期有關（均P＜0.05）；CD34標記的MVD計數(shù)與患者的年齡、性別、分型及腫瘤分布的部位無關（P＞0.05），而與腫瘤的大小、淋巴結轉移、TNM分期有關（均P＜0.05）（表1）。

表 ?1 ?MK、MVD與SACC臨床病理特征的關系Tab 1 Relationship between the expression of MK and MVD and clinical and pathological parameters of SACC

SACC組織中，MVD與MK的表達水平間存在正相關關系，相關系數(shù)r=0.560，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。MK陽性表達病例為42例，MVD計數(shù)為40.23±6.67；MK陰性表達病例為18例，MVD計數(shù)為38.22±6.89，二者間的差異有統(tǒng)計學意義（t=36.459，P＜0.05）。

3 ?討論

MK是近來新發(fā)現(xiàn)的一種肝素結合性生長因子家族成員之一，其功能首先被定位于神經系統(tǒng)中神經細胞的發(fā)育及分化[4]，以后人們發(fā)現(xiàn)在消化、呼吸、血液、生殖等諸多系統(tǒng)中都存在MK[5]，MK不僅與正常的生理有關，還與炎癥、創(chuàng)傷及腫瘤等病態(tài)生理有關[6]。生理情況下，MK基因表達隨個體發(fā)育而變化，在胚胎期高表達，出生后逐漸降低；在成年組織中，除腎臟和小腸上皮外，其他部位幾乎不表達。近來許多研究[7-11]表明，MK?mRNA在多種癌組織中呈高頻率、高強度表達，這可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉移有關。超過60%的成人實體瘤患者的血清中均可檢測到高水平的MK，當腫瘤切除后，再檢測發(fā)現(xiàn)患者血清中MK濃度呈明顯的下降。隨后Ikematsu等[12]又報道，在膀胱癌、結腸癌、肝癌、胰腺癌、胃癌等惡性腫瘤患者的尿液中MK的質量濃度也明顯升高。本實驗發(fā)現(xiàn)，在SACC組織中MK呈高表達，而正常涎腺組織中未見MK的表達，MK可能作為SACC的一個診斷指標。MK的表達與臨床分期和分化類型及淋巴結轉移密切相關，表明隨著臨床分期和淋巴結的轉移，MK的表達增強，提示MK的表達可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及淋巴結轉移有關，所以，MK可能成為臨床上評估SACC發(fā)展的指標之一。此外，本實驗還分析了MK與SACC臨床病理特征的關系，結果發(fā)現(xiàn)MK蛋白的表達與患者的年齡、性別、SACC的病理分型無相關性（P＞0.05）。本課題通過觀察SACC的免疫組織化學染色切片發(fā)現(xiàn)，在SACC組織中癌細胞的胞漿及核膜是MK蛋白主要的分布區(qū)域，在核膜上高表達MK有可能進入到細胞核內，通過某些信號通路來調節(jié)細胞的增殖與分化功能，從而腫瘤的產生。

目前大多數(shù)研究認為，血管的新生有利于腫瘤的生長、浸潤及轉移。腫瘤組織中新生的血管基底膜較薄并且易斷裂，腫瘤細胞很容易侵入血管內，繼而通過血液途徑而向遠處轉移。近年來，在研究腫瘤血管新生的報道中，所采用的血管內皮細胞標記物[13]中以CD34最具代表，CD34通常在增殖的血管內皮細胞和腫瘤組織內血管生成旺盛的血管內皮細胞中呈過表達，而在正常成熟的血管內皮細胞中通常呈弱表達或不表達[14]。本研究結果顯示，SACC和正常涎腺組織比較，前者MVD值顯著高于后者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在顯微鏡下可觀察到，腫瘤組織中不僅有血管數(shù)目增加，而且新生血管的形態(tài)和結構也有明顯變化，主要表現(xiàn)在：新生血管大部分為發(fā)育不完善，管壁僅為一層內皮細胞，有些地方呈點隙裂狀，缺乏基底膜。因此，可以推測SACC中血管新生的這些情況給腫瘤細胞的浸潤及轉移提供了阻力最小的通道，給SACC易發(fā)生血行性轉移提供了有力的證據(jù)。此外，SACC的MVD值與淋巴結狀態(tài)有關，淋巴結陰性組（36.41±4.32）高于陽性組（33.88±4.75），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示腫瘤細胞轉移依賴于腫瘤血管的生成。本研究結果還發(fā)現(xiàn)，MK在SACC細胞外間質中的纖維組織、血管內彈力膜層及內皮細胞也有表達，提示MK可能具有刺激內皮細胞增殖、促進血管生成的作用，與Mashour等[15]報道相一致。另外，MK與MVD在SACC中的表達具有相關性，說明MK具有促進腫瘤血管生成的作用，也說明腫瘤微血管與腫瘤本身有密切關系。

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（本文編輯 ?杜冰）

[中圖分類號]R?739.87

[文獻標志碼]A???[doi] ??10.7518/hxkq.2016.02.017

[收稿日期]2015-07-13；?[修回日期] ?2015-11-03

[作者簡介]陳俊，主治醫(yī)師，碩士，E-mail：huhongmei1218@126.com

[通信作者]胡紅梅，副教授，碩士，E-mail：huhongmei503@126.com

Expression of midkine and microvessel density in salivary adenoid cystic carcinoma

Chen Jun1, Li Jimei2, Li Wei1, Hu Hongmei3. (1. Dept. of Stomatology, The Affiliated Hospital of Jinggangshan University, Ji’an 343000, China; 2. Dept. of Gynaecology and Obstetrics, People’s Hospital of Jishui County, Jiangxi Province, Jishui 331600, China; 3. Dept. of Histology and Embryology, Medical College of Jinggangshan University, Ji’an 343000, China)
Correspondence: Hu Hongmei, E-mail: huhongmei503@126.com.

[Abstract]Objective This?study?aimed?to?investigate?the?expression?of?midkine?(MK)?and?microvessel?density?(MVD)?in?patients?with?salivary?adenoid?cystic?carcinoma?(SACC)?and?its?clinical?significance,?as?well?as?detect?the?correlation?between?the?expression?of?MK?and?MVD?in?SACC.?Methods??Immunohistochemistry?analysis?(SP?method)?for?MK?and?MVD?were?performed?on?60?cases?of?SACC?and?26?cases?of?normal?salivary?gland?tissue.?The?expression?of?MK?and?MVD,?as?well?as?the?correlation?between?the?expression?of?MK?and?MVD?in?SACC?were?detected.?Results???In?SACC,?the?MK?expression?rate?was?70.0%?(42/60),?and?MK?was?not?expressed?in?normal?tissue.?Statistical?significance?was?found?between?SACC?and?normal?tissue?(P<0.05).?The?MVD?values?in?SACC?and?normal?salivary?gland?tissues?were?38.73±8.96?and?11.15±3.33,?respectively.?These?values?were?statistically?significant?(P<0.05).?The?expression?levels?of?MK?and?MVD?were?unrelated?to?age,?gender,?and?type?in?SACC?(P>0.05),?but?correlated?with?tumor?size,?lymph?node?metastasis,?and?tumor–node–metastasis?in?SACC?(P<0.05).?The?expression?of?MK?and?MVD?was?positively?correlated?with?SACC?(r=0.560,?P<0.05).?Conclusion?SACC?is?correlated?with?the?expression?of?MK?protein?and?the?increase?in?MVD,?which?may?be?some?of?the?early?diagnostic?markers?in?SACC.

[Key words]salivary?adenoid?cystic?carcinoma;??midkine;??microvessel?density;??immunohistochemistry;??salivary?gland