馮艷琴, 敖金波, 楊 敏, 程建明, 陳德森(十堰市太和醫(yī)院 湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院. 骨科, . 康復(fù)中心, . 湖北醫(yī)藥學院, 十堰, 44000)

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鹿瓜多肽關(guān)節(jié)腔注射治療家兔類風濕性關(guān)節(jié)炎實驗研究

馮艷琴1, 敖金波2, 楊 敏1, 程建明2, 陳德森3
(十堰市太和醫(yī)院 湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院1. 骨科, 2. 康復(fù)中心, 3. 湖北醫(yī)藥學院, 十堰, 442000)

[摘要]目的 研究鹿瓜多肽治療家兔類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的機制。方法 用小牛軟骨II型膠原+弗氏完全佐劑0.1 mL于家兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)多點注射的方法制備RA模型，模型動物分為模型組及低、高劑量鹿瓜多肽(1 mg/d、2 mg/d)治療組(A、B組)，分別計算治療后1 d、7 d、14 d、21 d足腫脹度，測定關(guān)節(jié)積液中透明質(zhì)酸(HA)、白細胞介素-1b(IL-1b)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-3)及骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)含量。結(jié)果 與模型組比較，鹿瓜多肽低、高劑量組14 d、21 d時動物足腫脹度、MMP-3、IL-1b含量明顯降低，BMP、HA含量明顯升高(P<0.05)，低、高劑量組間無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論 鹿瓜多肽可提高家兔關(guān)節(jié)腔HA合成及BMP分泌，抑制MMP-3及IL-1b對關(guān)節(jié)滑膜的浸蝕而達到治療RA的目的。

[關(guān)鍵詞]家兔; 類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA); 鹿瓜多肽

類風濕關(guān)節(jié)炎 (rheumatoid arthritis，RA) 是以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯淖陨砻庖咝约膊?，由于關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥浸潤，臨床表現(xiàn)主要為小關(guān)節(jié)滑膜性關(guān)節(jié)腫痛，繼而關(guān)節(jié)軟骨破壞、關(guān)節(jié)間隙變窄，晚期由于骨質(zhì)嚴重破壞、吸收而導(dǎo)致關(guān)節(jié)僵直、畸形、功能障礙等，常累及心臟[1]。現(xiàn)代醫(yī)學證實，RA病理機制可能與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-3)活性增強、白細胞介素-1b(IL-1b)合成過多有關(guān), MMP-3可降解關(guān)節(jié)基質(zhì)，IL-1b作為炎癥介質(zhì)，與RA發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。有證據(jù)表明，在罹患RA后骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)作為高效成骨活性因子被大量激活，抑制關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)[3]。RA有反復(fù)發(fā)作、中青年女性好發(fā)且致殘率較高、預(yù)后不良等特點，目前尚無根治方法。為尋找RA的有效治療藥物，本實驗在建立家兔RA模型的基礎(chǔ)上，采取關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射鹿瓜多肽來觀察其對RA兔足腫脹度及關(guān)節(jié)積液中HA、IL-1b、BMP及MMP-3含量等的影響，試圖分析藥物治療機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組與飼養(yǎng)

2～3 月齡普通級雄性日本大耳白家兔40 只，體質(zhì)量2.0～2.2 kg, 由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供[ SCXK(鄂)2011-000], 均用普通飼料喂養(yǎng)(每日50 g/kg), 每籠1只, 自由飲水[SYXK(鄂)2011-0031]。

1.2 藥品與試劑

注射用鹿瓜多肽(黑龍江迪龍制藥有限公司，批號: H20060625), 小牛軟骨Ⅱ型膠原(徐州宗耀堂生物科技有限公司, 批號: QS371006014996)，弗氏完全佐劑[華中海威(北京)基因科技有限公司, 批號: F5881], MMP-3 ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司, 批號: SBJ-T0005)。透明質(zhì)酸(HA)試劑盒(批號: B-E13398)、IL-1b ELISA試劑盒(批號:QY-R95200)和兔BMP ELISA試劑盒(批號：96T/ 48T)均由上海鈺博生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 類風濕性模型制備與分組

參照文獻[4]，剃去家兔左膝關(guān)節(jié)處被毛，碘伏消毒皮膚，于左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射小牛軟骨Ⅱ型膠原加弗氏完全佐劑0.1 mL造模，2周后將兔分成模型組、鹿瓜多肽低劑量組(A組)及高劑量組(B組)。

1.4 治療方法

將鹿瓜多肽干凍粉用滅菌注射用水溶解稀釋成質(zhì)量分數(shù)1%的溶液備用，兔的用藥量可根據(jù)人與動物體表面積換算公式[(兔用藥劑量(mg/kg)=W(人與兔體表面積換算系數(shù))×A(人用藥劑量)]計算[5]，鹿瓜多肽人的用藥量是8～16 mg/d, 兔用量以1%鹿瓜多肽藥量換算后，每日關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射鹿瓜多肽一次進行治療, A組1 mg/d(0.1 mL)、B組為2 mg/d (0.2 mL), 模型組注入(0.1 mL)生理鹽水作為對照, 連續(xù)治療21 d。每日強迫動物活動30 min。

1.5 檢測指標及方法

于治療1 d、7 d、14 d、21 d測量左足體積并分別計算足腫脹度，參照文獻[6]分別抽取不同治療時間點膝關(guān)節(jié)腔積液并編號，-4℃暫存，檢測時取關(guān)節(jié)腔積液，加入底物，以5 000 r/min離心20 min, 取上清液，嚴格按照說明書操作，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)確定HA、IL-1b、BMP及MMP-3值。足腫脹度的測定：測量左足趾關(guān)節(jié)以下部位的容積，連續(xù)3次，取平均值為左足容積，計算各組動物足腫脹度%=(造模后容積-造模前容積)/造模前容積×100%。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，不同治療時間BMP、MMP-3、HA、IL-1b采用球形檢驗分析，不同組間比較應(yīng)用方差分析，實驗數(shù)據(jù)以± s表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

造模動物出現(xiàn)左膝關(guān)節(jié)僵硬、活動受限; 關(guān)節(jié)紅腫、表皮發(fā)熱、觸摸時動物因疼痛躲避、關(guān)節(jié)軟組織腫脹, 可感覺關(guān)節(jié)腔大量滲出液或關(guān)節(jié)腔積液。

2.2 足腫脹度比較

A組、B組兔在治療7 d時開始消腫，但與模型組比較無顯著差異(P>0.05)，14 d足腫脹度明顯下降(P<0.05)。21 d后基本恢復(fù)正常，足腫脹度明顯低于模型組(P<0.05)，但A、B組間無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組兔足腫脹度 %

2.2 不同治療時間相關(guān)指標比較

模型組各指標在各時間點各無明顯變化。 A、B組兔關(guān)節(jié)腔積液BMP 、HA在治療14 d、21 d明顯升高(P<0.05)，A、B組MMP-3、IL-1b在治療14 d、21 d明顯降低(P<0.05)，但A組與B組間均無顯著差異(P>0.05)(表2)。

3 討論

鹿瓜多肽由葫蘆科植物甜瓜(Cucumis melo L.)的干燥成熟種子及梅花鹿(Cervus nippon Temmick)的骨骼中提取的復(fù)方滅菌干凍粉[7]， 屬于多肽類生物活性復(fù)合物，內(nèi)含豐富成纖維細胞生長因子(FGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-b)及BMP等多種骨誘導(dǎo)多肽類因子。由于其甜瓜籽提取物富含多種游離氨基酸和有機鈣、磷等多種成分[8]，可調(diào)節(jié)骨鈣、磷代謝, 刺激成骨細胞增殖、促進新骨形成, 防止骨質(zhì)疏松, 并具有較強的鎮(zhèn)痛抗炎抗風濕等作用[9]。故該藥常用于治療骨質(zhì)疏松、骨折及RA等疾病。中醫(yī)認為類風濕性關(guān)節(jié)炎屬“痹證”，由“風、寒、濕”合而成痹，此類患者常挾濕氣下注于關(guān)節(jié)[10]。由于軟骨分解及合成代謝失衡及筋絡(luò)脈隧痹阻不通，多繼發(fā)滑膜與滑液炎，其病理改變多以膝關(guān)節(jié)滑膜受損及關(guān)節(jié)腔積液為主[11]。

表2 鹿瓜多肽不同治療時間兔關(guān)節(jié)腔積液中各指標比較

實驗數(shù)據(jù)顯示, 治療14 d及21 d時, A、B組MMP-3陽性表達明顯降低，在治療7 d、14 d、21 d顯示，A、B組BMP及HA明顯升高， IL-1b含量明顯降低，足腫脹度明顯低于模型組，提示鹿瓜多肽治療風濕性關(guān)節(jié)炎時，能有效降低IL-1b分泌、抑制MMP-3陽性表達，降低模型動物足腫脹度，升高BMP、HA。這可能是鹿瓜多肽通過抑制IL-1b產(chǎn)生，減輕炎癥介質(zhì)IL-1b對關(guān)節(jié)軟骨及滑膜的炎癥刺激，降低了對軟骨細胞正常結(jié)構(gòu)和功能的破壞、MMP-3對基質(zhì)的降解，減輕關(guān)節(jié)軟骨周圍骨贅的形成, 從而緩解關(guān)節(jié)疼痛的臨床癥狀，改善關(guān)節(jié)功能。正常的關(guān)節(jié)滑液中僅含有微量的IL-1b，但在類風濕性關(guān)節(jié)液中IL-1b的含量則異常增高[12]。IL-1b作為重要的炎性介質(zhì)具有細胞破壞能力, 其在退行性骨關(guān)節(jié)病中發(fā)揮重要作用[13]。HA是由 d葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖胺二糖單位有規(guī)律重復(fù)構(gòu)成的大分子鏈狀多糖，化學本質(zhì)為糖胺多糖，廣泛分布于機體的結(jié)締組織、關(guān)節(jié)軟骨、關(guān)節(jié)腔的滑液中，是關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)及關(guān)節(jié)滑液重要成分[14]。關(guān)節(jié)腔中適量的HA可減少風濕性關(guān)節(jié)類風濕因子及IL-1b等炎性介質(zhì)的擴散，降低關(guān)節(jié)滑膜通透性而減少關(guān)節(jié)內(nèi)滲液暨關(guān)節(jié)積液的形成[15]。本實驗數(shù)據(jù)顯示，關(guān)節(jié)積液中HA含量升高可能是鹿瓜多肽關(guān)節(jié)炎腔內(nèi)注射吸收后促使單核吞噬細胞及滑膜內(nèi)襯B型滑膜細胞分泌HA，從而起到潤滑關(guān)節(jié)、保護關(guān)節(jié)軟骨、延緩軟骨退變的作用。而BMP作為一種骨誘導(dǎo)因子，是間充質(zhì)細胞向骨系細胞轉(zhuǎn)化的信號傳導(dǎo)介質(zhì)，具有誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為成骨細胞和軟骨細胞的作用。BMP能夠誘導(dǎo)動物或人體間充質(zhì)細胞分化為骨、軟骨、韌帶、肌腱和神經(jīng)組織。同時，BMP還可通過調(diào)節(jié)TGF-b和FGF而誘導(dǎo)新骨形成，從而促進鈣、磷代謝，增加骨鈣沉積，防治和改善骨質(zhì)疏松的發(fā)生[16]。鹿瓜多肽干凍粉中富含多種游離氨基酸，為成骨細胞合成BMP骨源性生物因子提供能量和原料，可促進骨源性生物因子的合成。實驗證實鹿瓜多肽增加BMP的合成, 抑制了MMP-3過度表達。這可能是鹿瓜多肽關(guān)節(jié)炎腔內(nèi)注射吸收后促進BMP的合成, 促進成骨細胞有絲分裂及趨化作用[17]。同時，鹿瓜多肽在關(guān)節(jié)炎腔內(nèi)注射吸收后降低關(guān)節(jié)局部毛細血管通透性，減少IL-1b合成及炎性滲出，降低因炎癥刺激而造成MMP-3細胞陽性表達，促進局部炎癥及組織粘連時血運障礙的恢復(fù)，改善關(guān)節(jié)局部的血液循環(huán)。

綜上所述，鹿瓜多肽關(guān)節(jié)炎腔內(nèi)注射吸收后，通過增強RA模型兔關(guān)節(jié)積液中HA及滑膜BMP，降低關(guān)節(jié)液中IL-1b分泌及其對關(guān)節(jié)的炎性刺激，減少MMP-3對關(guān)節(jié)及節(jié)軟骨滑膜、骨質(zhì)降解而影響關(guān)節(jié)及骨代謝，修復(fù)已遭類風濕因子及IL-1b等炎性介質(zhì)破壞的關(guān)節(jié)滑膜，對RA具有明確的治療作用。

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Experimental Study on Treatment of Rheumatoid Arthritis in Rabbits by Injection of Deer Melon Polypeptide

FENG Yan-qin1, AO Ji-bo2, YANG Min1, CHEN Jian-ming2, CHEN De-sen3
(Taihe Hospital, Affiliated Hospital of Hubei Medical College, 1. Orthopedics, 2. Rrehabilitation Center, 3. Hubei Medical College, Shiyan, 442000, China)

[Abstract]Objective To study the mechanism of the treatment on rheumatoid arthrist (RA) in rabbits by deer melon polypeptide. Methods Calf cartilage II collagen+Freund’s complete adjuvant (0.1 mL) was injected intra-articular in right knee of rabbits to prepare RA model. The model rabbits were randomly divided into model group, low and high dosage deer melon polypeptide group (Group A and B) with 1 mg/d or 2 mg/d. The paw swelling were calculated at 1, 7, 14, 21 days after treatment, the hyaluronic acid (HA), interleukin-1b (IL-1b), matrix metalloproteinase (MMP-3) and bone morphogenetic protein (BMP) content in joint effusion were measured. Results Compared with the model group, paw swelling were occurred in the rabbits of group A and B, MMP-3 and IL-1b were significantly decreased, BMP and HA significantly increased(P<0.05), but no difference between groups A and B (P<0.05). Conclusion The deer melon polypeptide had the treatment effects on RA in rabbit by improving the RA synthesis and BMP secretion in articular, and inhibiting the erosion of MMP-3 and IL-1b on synovial.

[Key words]Rabbit; Rheumatoid arthritis (RA); Deer melon polypeptide

[中圖分類號]Q95-33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1674-5817(2016)03-0204-04

doi:10.3969/j.issn.1674-5817.2016.03.009

[收稿日期]2015-10-09

[基金項目]湖北省教育廳重點項目(B20122406)

[作者簡介]馮艷琴(1977-), 女, 主管護師。E-mail: cdscds1226@126.com

[通訊作者]陳德森(1970-), 男, 副教授, 主要從事專業(yè): 病理與生理學。E-mail: chends1226@163.com