陳獻花, 方 麗, 李雪來, 余陳歡, 應(yīng)華忠(. 浙江省醫(yī)療器械檢驗院, 浙江省醫(yī)療器械安全性評價研究重點實驗室, 杭州 3008; . 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 浙江省實驗動物與安全性評價重點實驗室, 杭州 3003)

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偏苯三酸三辛酯對肝細胞的毒性作用及其機制

陳獻花1, 方 麗1, 李雪來1, 余陳歡2, 應(yīng)華忠2
(1. 浙江省醫(yī)療器械檢驗院, 浙江省醫(yī)療器械安全性評價研究重點實驗室, 杭州 310018; 2. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 浙江省實驗動物與安全性評價重點實驗室, 杭州 310013)

[摘要]目的 研究偏苯三酸三辛酯(TOTM)的肝細胞毒性作用及其毒性機制。方法 將TOTM 0.062 5～1.0 mg/mL分別與HepG2、LO2、Hep1-6肝細胞作用48 h。采用MTT法檢測細胞存活率并計算半抑制濃度(IC50)值; 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化; 采用試劑盒檢測細胞培養(yǎng)液中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和乳酸脫氫酶(LDH)含量; 采用流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡情況。結(jié)果 TOTM對肝細胞增殖有明顯的抑制作用，MTT檢測顯示TOTM對HepG2、LO2、Hep1-6肝細胞的IC50分別為1.74 mg/mL、0.34 mg/mL和0.23 mg/mL。隨著TOTM劑量的增加，TOTM能升高肝細胞上清中AST、ALT含量, 促進LDH釋放和細胞凋亡。結(jié)論 TOTM對肝細胞具有一定的毒性作用。

[關(guān)鍵詞]偏苯三酸三辛酯; 肝細胞; 細胞凋亡

偏苯三酸三辛酯(TOTM)是目前常用的新型塑化劑之一，目前被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)耐熱和耐壓的輸注類醫(yī)療器械等產(chǎn)品[1]?，F(xiàn)有文獻[2,3]報道，由于部分藥物、輔料的助溶作用，微量TOTM可從聚氯乙烯、硝酸纖維素等材料制成的輸液軟管中滲出并伴隨注射液進入體內(nèi)。雖然TOTM較其他塑化劑具有生物體內(nèi)代謝快、毒性低、低浸出等優(yōu)點，但其潛在的遺傳和生殖毒性仍不可忽視[4]。肝臟是體內(nèi)最主要的藥物代謝器官，靜脈輸送藥物進入體內(nèi)后大部分在肝臟代謝、分解。項目組前期研究顯示, 每日給小鼠尾靜脈注射100mg/kg, TOTM[歐洲化學(xué)品管理局(ECHA)標(biāo)示的無可見有害作用水平(NOAEL)劑量]可引起小鼠肝組織細胞脂質(zhì)堆積和部分細胞壞死，并可導(dǎo)致丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血脂等生化指標(biāo)升高。但目前關(guān)于TOTM對肝細胞的半數(shù)抑制劑量及其作用機制尚不清楚[5]。因此，本實驗通過體外實驗，對TOTM的肝細胞毒性進行深入評價，以完善TOTM的安全評估體系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

TOTM購自上海阿拉丁試劑有限公司; RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自杭州四季青生物制品有限公司; AST、ALT檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所; AnnexinV /PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)股份有限公司。FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司。Thermo311二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱為美國熱電公司產(chǎn)品。

1.2 細胞

HepG2人肝癌細胞、LO2人正常肝細胞、Hep1-6小鼠肝癌細胞均購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所細胞庫。

1.3 細胞培養(yǎng)

HepG2、LO2和Hep1-6細胞分別獨立培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中, 置 37 ℃、體積分數(shù)5% CO2及飽和濕度下細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶液消化、傳代，取狀態(tài)良好、增殖旺盛的細胞用于本試驗。

1.4 TOTM供試樣品的制備

取TOTM 500 mL溶解在484 mL 二甲基亞砜(DMSO)中配制成 500 mg/mL的儲存液。將儲存液用培養(yǎng)基配制成不同濃度(即培養(yǎng)基中TOTM的終濃度為0.062 5 mg/mL、0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL)，其中DMSO的最終質(zhì)量分數(shù)均小于1‰。

1.5 MTT 法檢測細胞增殖活性

選對數(shù)生長期細胞, 用質(zhì)量分數(shù)0.25%胰蛋白酶消化、收集, 將細胞濃度調(diào)整為1.0×104/mL。將細胞懸液接種于96孔板, CO2孵育箱中培養(yǎng)12 h, 加入TOTM使其終濃度為0.062 5 mg/mL、0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL。平行設(shè)置對照孔(不加藥)，置37 ℃、體積分數(shù)5%CO2孵育箱中培養(yǎng)48 h。取出培養(yǎng)板，每孔加入5 mg/mL的MTT 10mL, 混勻, 繼續(xù)培養(yǎng)2 h, 棄去上清液，每孔加入100 mL DMSO，震蕩10 min使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀于波長490 nm測每孔吸光度OD值，檢測細胞增殖情況。

1.6 細胞凋亡率測定

將濃度為1×105/mL的LO2細胞, 接種于6孔板中。加TOTM至各孔(終濃度為0.34 mg/mL)。平行設(shè)置對照組, 藥物作用48 h, 收集、消化后，加 PBS, 800 r/min離心5 min 洗 2 次, 計數(shù); 稀釋成每毫升約1×105細胞, 轉(zhuǎn)入流式細胞管, 加入Annexin V- FITC和Propidium Iodide各5 mL，混勻，室溫避光孵育 15 min，用流式細胞儀測量細胞凋亡率。

1.7 細胞形態(tài)學(xué)觀察

取滅菌后的蓋玻片放入無菌6孔板中，接種LO2細胞，待細胞生長至70%時，棄去舊的培養(yǎng)液，將不同濃度的含藥培養(yǎng)液加到相應(yīng)的孔中，培養(yǎng)48 h后，取出蓋玻片，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄細胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.8 乳酸脫氫酶(LDH)、AST及ALT含量測定

調(diào)整為1.0×105/mL的LO2細胞懸液，于CO2孵育箱中培養(yǎng)24 h，棄上清液，加TOTM(終濃度為0.34 mg/mL)。平行設(shè)置對照組，培養(yǎng)48 h，收集細胞。按照試劑盒說明書，用酶標(biāo)儀測定LDH、AST及ALT含量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，各組定量檢測數(shù)據(jù)以x-± s表示，組間比較用LSD 檢驗, P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TOTM對肝細胞增殖的抑制作用

TOTM對HepG2、LO2、Hep1-6細胞增殖有明顯抑制作用，并呈現(xiàn)量效關(guān)系(圖1)。經(jīng)計算，TOTM對HepG2、LO2、Hep1-6肝細胞的半抑制濃度 (IC50) 分別為1.74 mg/mL、0.34 mg/mL和0.23 mg/mL。提示Hep1-6小鼠肝癌細胞和LO2人正常肝細胞對TOTM相對HepG2人肝癌細胞較為敏感。故后續(xù)實驗以LO2細胞為研究對象。

圖1 TOTM對肝細胞增殖的抑制作用

2.2 TOTM對LO2細胞形態(tài)學(xué)的影響

倒置顯微鏡下，對照組細胞分界清楚、表面光滑, 細胞形態(tài)未見明顯異常。0.25 mg/mL TOTM組，開始有少部分細胞失去正常的形態(tài)，出現(xiàn)細胞變圓現(xiàn)象; 0.5 mg/mL TOTM組部分細胞變圓，出現(xiàn)形態(tài)模糊、分界不清; 1.0 mg/mL TOTM組明顯可見大量細胞變圓，皺縮，表面粗糙。提示高劑量TOTM可明顯導(dǎo)致肝細胞形態(tài)改變。

2.3 TOTM對LO2細胞凋亡的影響

由流式細胞分析結(jié)果可知，0.25～1.0 mg/mL 的TOTM可誘導(dǎo)細胞凋亡，凋亡率分別為7.4% ± 1.0%，11.6%±1.5%和18.5%±1.9%，明顯高于對照組(2.4%±0.3%)(P<0.05)。并隨著TOTM濃度的增加，細胞凋亡率越高。

2.4 TOTM對LO2細胞培養(yǎng)液AST、ALT和LDH含量的影響

由表1可知, TOTM與LO2肝細胞作用48 h后，與對照組相比，細胞培養(yǎng)液中ALT和AST活性明顯升高; TOTM 0.062 5～1.0 mg/mL劑量組AST活性顯著升高(P<0.05)，而TOTM 0.125～1.0 mg/mL劑量組ALT活性顯著升高(P<0.05)，具有一定的量效關(guān)系。另一方面，TOTM 0.062 5～1.0 mg/mL劑量作用LO2肝細胞作用48 h后，細胞培養(yǎng)液中LDH水平顯著增加, 與對照組比較有顯著性差異(P<0.05),提示TOTM可造成肝細胞膜損傷，膜通透性增加，進而增加LDH釋放。

圖2 TOTM對LO2細胞形態(tài)的影響

表1 TOTM對LO2細胞培養(yǎng)液AST、ALT和LDH含量的影響

3 討論

醫(yī)用塑料用于制造人工臟器或輸血袋、輸液袋等醫(yī)療器械，由于要與人體、血液或藥液接觸，要求塑料材料中的組分不能析出進入藥液或人體，不會引起組織器官的毒性和損傷。目前，有約1/3的醫(yī)療器械由聚氯乙烯(PVC)材料制成。PVC類材料在醫(yī)療器械中應(yīng)用廣泛，最主要原因是其具有柔軟性和易彎曲性等良好的物理性質(zhì)。此外，這類材料與靜脈注射液和血液之間具有良好的相容性[6]。常見的PVC類產(chǎn)品中都含有增塑劑如鄰苯二甲酸酯(DEHP)、TOTM等，用以改進材料的柔軟性、延伸性和加工性。這種增塑劑與 PVC的結(jié)合是一種物理過程，會隨著時間的增長而緩慢逸出，進入到與之接觸的介質(zhì)中; 同時，部分藥物或藥用輔料的助溶作用促進了增塑劑從材料中的釋放，增加了患者暴露于增塑劑中的可能性[7]。現(xiàn)有文獻[2]報道，醫(yī)療器械塑料制品中DEHP的24～72 h溶出率為1.27%～1.34%，對苯二甲酸二辛酯(DEPT) 為0.11%～0.46%，而TOTM為0.07%～0.17%; 相較于其它種類的增塑劑，TOTM溶出率具有更明顯的時間依賴性。我國《食品容器、包裝材料用添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準》嚴格規(guī)定了DEHP從食品包裝材料遷移到食品的遷移量為1.5 mg/kg，與世界發(fā)達國家的規(guī)定一致。因此，人們對增塑劑的生物安全性評估頗為關(guān)注[8-10]。現(xiàn)已明確DEHP的成人每日攝入限定量為25 mg/kg[2]，但目前有關(guān)TOTM的毒性研究及成人每日攝入限定量尚不明確。

本實驗通過體外實驗，評估了TOTM對多種肝細胞的毒性作用，結(jié)果顯示TOTM對HepG2、LO2、Hep1-6肝細胞的IC50分別為1.74 mg/mL、0.34 mg/mL和0.23 mg/mL。隨著TOTM濃度劑量的增加, 0.125～1.0 mg/mL劑量的TOTM能升高人正常肝細胞上清中AST、ALT含量, 促進LDH釋放,并可誘導(dǎo)細胞凋亡。項目組前期研究表明，TOTM可引起小鼠肝組織細胞壞死和脂滴堆積，這一結(jié)果亦佐證了本實驗結(jié)果。證明了TOTM具有潛在的肝毒性，但其具體的毒性機制急需進一步的研究。參考文獻:

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[中圖分類號]Q95-33

[文獻標(biāo)識碼]B

[文章編號]1674-5817(2016)02-0212-04

doi:10.3969/j.issn.1674-5817.2016.03.011

[收稿日期]2015-12-28

[基金項目]浙江省食品藥品監(jiān)管系統(tǒng)科技計劃項目(2014001),浙江省衛(wèi)生高層次人才項目(014)

[作者簡介]陳獻花。E-mail: 919940015@qq.com

[通訊作者]應(yīng)華忠。E-mail: YHZ0101@126.com