王雪銀，　李宜培，　程相樹，　趙昆朋△

(1河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州 451191； 2河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南 開封 475004)

過表達miR-132改善阿爾茨海默病樣學(xué)習(xí)記憶障礙*

王雪銀1，李宜培1，程相樹2，趙昆朋2△

(1河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州 451191；2河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南 開封 475004)

[摘要]目的： 獲得過表達微小RNA-132(microRNA-132，miR-132)的慢病毒，并檢測對Tg2576小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的改善。方法: 從小鼠腦組織中克隆miR-132成熟序列上下游各100 bp的基因，將基因克隆至慢病毒表達載體pLenti7.3，酶切鑒定并且DNA序列測定正確。 pLenti7.3-miR-132和ViraPower Packaging Mix 共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞。72 h后收獲上請，采用超速離心和聚乙二醇法純化病毒顆粒并分裝保存。分別以病毒顆粒感染細(xì)胞系和小鼠海馬組織驗證病毒的感染能力。Tg2576小鼠海馬區(qū)注射病毒，Western blot和Morris水迷宮分別檢測記憶相關(guān)蛋白水平和空間學(xué)習(xí)記憶能力。 結(jié)果: 所包裝的miR-132病毒顆粒能夠高效地感染細(xì)胞系，并且在體內(nèi)也有理想的感染效率。和對照組相比，過表達miR-132的Tg2576小鼠PSD95和GluR1明顯升高，并且空間依賴的學(xué)習(xí)記憶能力明顯提高。結(jié)論: 過表達miR-132通過影響突觸相關(guān)蛋白PSD95和GluR1的水平改善Tg2576小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力障礙。

[關(guān)鍵詞]微小RNA-132； 病毒包裝； Tg2576小鼠； 學(xué)習(xí)； 記憶

微小RNA(microRNA，miRNA)是在1993年被發(fā)現(xiàn)的一類在進化上非常保守，短的(大約21～22 nt)，非編碼的RNA分子[1]。人源miR-132定位于染色體17p13.3，富含于腦組織，尤其是在海馬區(qū)高表達。miR-132在多種神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病或者模型動物中表達下調(diào)，包括阿爾茨海默病(Alzheimer di-sease，AD)[1-2]、胎兒無腦畸形[3]、亨廷頓疾病[4-5]、精神分裂癥和雙相情感障礙[6]、帕金森病[7]。miR-132還能影響一些突觸相關(guān)蛋白的表達，研究證實體外過表達miR-132會引起谷氨酸受體NR2A、NR2B和GluR1的表達上調(diào)[8]。最新研究揭示在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中敲除miR-132導(dǎo)致FOXO3a的表達升高而誘導(dǎo)大量的神經(jīng)元凋亡[9]。miR-132由于參與了眾多的神經(jīng)生理和病理過程而被稱為“NeurimmiR”。以上的研究結(jié)果也說明miR-132涉及到了突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶的過程，但是具體的分子機制現(xiàn)在還不清楚。因此，探索miR-132調(diào)控學(xué)習(xí)記憶的機制對于一些神經(jīng)退行性疾病的理解和治療有重要意義。為了探討miR-132在神經(jīng)系統(tǒng)的作用機制，本研究構(gòu)建和純化了表達帶有EGFP標(biāo)簽蛋白的miR-132慢病毒顆粒并探討了miR-132對阿爾茨海默病模型小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的影響。

材料和方法

1材料和試劑

用于包裝病毒的載體系統(tǒng)的pLenti7.3/V5-TOPO TA Cloning Kit試劑盒購自Invitrogen；293FT細(xì)胞購自ATCC；Pyrobest高保真酶購自TaKaRa；T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶購自BioLab；質(zhì)粒提取試劑盒、miRNA提取試劑盒和DNA回收試劑盒購自北京天根生物公司；聚乙二醇[poly(ethylene glycol)，PEG]-8000購自Sigma；阿爾茨海默病模型小鼠Tg2576(轉(zhuǎn)人突變APP)由本室飼養(yǎng)保存。

2方法

2.1miRNA的提取小心分離小鼠腦組織，按照miRNA提取試劑盒說明書操作miRNA, 1.5%的瓊脂糖電泳和A260/A280比值鑒定其純度和濃度。

2.2反轉(zhuǎn)錄PCR克隆pri-miR-132取1 μL mi-RNA, 按照第1鏈cDNA合成試劑盒說明書操作合成第1鏈cDNA。以cDNA為模板，用特異性克隆pri-miR-132的上、下游引物(上游引物為5’-CCCTGTGGGTTGCGGTGGGCGCAG-3’，下游引物為5’-CATCGAATGTTGCGTCGCCG-3’)擴增pri-miR-132序列，1%的瓊脂糖凝膠鑒定PCR產(chǎn)物，DNA回收試劑盒回收目的基因。

2.3病毒表達載體的構(gòu)建將純化后的pri-miR-132基因用T4 DNA連接酶連接至病毒表達載體pLenti7.3，轉(zhuǎn)化JM109，菌落PCR及酶切鑒定并獲得陽性克隆。提取質(zhì)粒，測定純度和濃度并分裝保存。

2.4病毒包裝轉(zhuǎn)染前1 d，在10 cm直徑的培養(yǎng)皿內(nèi)種植處于對數(shù)生長期的293FT細(xì)胞。于第2天當(dāng)細(xì)胞融合度達到90%時進行轉(zhuǎn)染。利用脂質(zhì)體2000把miR-132的表達載體pLenti7.3-miR-132和病毒支持載體ViraPower? Packaging Mix共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，具體操作見Lippo2000說明書。轉(zhuǎn)染24 h后，更換新鮮的無抗生素的完全培養(yǎng)基。72 h和5 d后，各收獲1次細(xì)胞培養(yǎng)上清，0.45 μm的濾膜過濾初步純化病毒。PEG-8000濃縮病毒后分裝保存于-80 ℃。

2.5病毒感染小鼠海馬組織選取3～4月齡的雄性C57/BL小鼠，采用腦立體定位技術(shù)，將4 μL濃縮后的病毒懸液注射至小鼠兩側(cè)海馬齒狀回區(qū)。2周后，一組小鼠常規(guī)灌流，腦組織冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察miR-132表達情況。同時另一組小鼠提取海馬組織的miRNA, 定量PCR法檢測miR-132的表達水平。

2.6Western blot實驗感染Tg2576小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元，設(shè)置空載體為陰性對照。2周后提取2組小鼠海馬組織蛋白，12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，常規(guī)轉(zhuǎn)膜，抗PSD95和GluR1抗體作為 I 抗進行孵育，常規(guī) II 抗孵育，洗膜。Odensey激光紅外掃描儀掃膜檢測蛋白水平。

2.7Morris水迷宮實驗由于本實驗采用的是Tg2576小鼠，所以圓桶水內(nèi)添加有鈦白粉便于記錄小鼠運動軌跡。設(shè)定潛伏期為90秒。如果小鼠在潛伏期內(nèi)找到并停留在平臺上5 s，則記錄實際潛伏期。定位航行實驗時將圓桶目標(biāo)象限內(nèi)放置有隱藏的平臺，任選圓桶平面4個象限中的1個作為小鼠入水點，將小鼠沿著桶壁面朝實驗者輕輕放入水中，同時軟件記錄小時游泳軌跡。如果在潛伏期內(nèi)小鼠找不到平臺，則引導(dǎo)至平臺上，停留15 s。每只小鼠每天進行1個象限的訓(xùn)練，每個象限完成后休息10 min，固定時間連續(xù)訓(xùn)練6 d。每只小鼠每個象限的潛伏期均被記錄。如果室內(nèi)溫度過低，每只小鼠完成一輪實驗后迅速擦干身上水跡，并注意保暖。經(jīng)過連續(xù)6 d的訓(xùn)練后，休息24 h后行空間搜索實驗。撤去圓桶內(nèi)的平臺，其余條件同定位航行實驗。任選一象限(避免目標(biāo)象限)輕輕放入小鼠，同時開始記錄90 s內(nèi)小鼠在目標(biāo)象限的停留時間和穿越原有平臺位置的次數(shù)以及運動軌跡。實驗動物分為2組，每組15只。實驗組為Tg2576小鼠海馬區(qū)注射pLenti7.3-miR132病毒；對照組為Tg2576小鼠注射空載體對照病毒。

3統(tǒng)計學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，運用SPSS 12.0統(tǒng)計學(xué)軟件對以上所有實驗數(shù)據(jù)進行分析處理統(tǒng)計，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用Student’sttest，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1Pri-miR-132基因的克隆和pLenti7.3-miR-132載體的構(gòu)建

以小鼠腦組織cDNA為模板，特異性的上、下游引物擴增獲得了pri-miR-132的基因。從圖1中可以看到大小為250 bp的條帶被特異性擴增。純化后的pri-miR-132基因直接連至病毒表達載體pLenti7.3, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，菌液PCR和雙酶切鑒定結(jié)果見圖2。

Figure 1.Cloning the pri-miR-132 gene from mouse brain. Lane 1, 2: pri-miR-132 gene.

圖1從小鼠腦組織中擴增pri-miR-132基因

Figure 2.Construction and identification of pLenti7.3-pri-miR-132 vector. A: lane 1～6: the production of PCR; B: lane 1～5: the pLenti7.3-pri-miR132 plasmid were treated by dual restriction enzymes.

圖2構(gòu)建并鑒定pLenti7.3-pri-miR-132載體

2病毒感染小鼠海馬組織

為了檢測獲得病毒的體內(nèi)感染能力，我們分別利用定量PCR和腦片免疫熒光檢測了病毒感染后小鼠海馬組織的miR-132的表達水平。定量PCR結(jié)果示同生理鹽水組比較，注射pLenti7.3-pri-miR-132病毒顆粒組的小鼠海馬區(qū)miR-132的表達水平明顯增高。同時腦片熒光結(jié)果也提示了病毒感染后的小鼠海馬區(qū)miR-132的表達水平也顯著上調(diào)。以上的結(jié)果說明了我們獲得的miR-132過表達慢病毒顆粒在體內(nèi)可以有效地感染組織細(xì)胞，見圖3。

Figure 3.Detection of pLenti7.3-miR-132 virus infection efficiency. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol.

圖3miR-132慢病毒感染效率的檢測

3過表達miR-132增加PSD95和GluR1蛋白水平

我們利用Western blot檢測了過表達miR-132對突觸蛋白的影響，結(jié)果顯示同對照組相比，過表達miR-132后，海馬區(qū)PSD95和GluR1的蛋白水平明顯增加，說明miR-132可能通過調(diào)控突觸相關(guān)蛋白的水平影響學(xué)習(xí)記憶的能力，見圖4。

4過表達miR-132改善Tg2576小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷

為了確認(rèn)miR-132對于AD樣學(xué)習(xí)記憶損傷的影響，我們利用Morris水迷宮的方法分別檢測病毒感染后和空載體病毒感染后的Tg2576發(fā)病小鼠海馬依賴的空間學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果提示同空載體對照相比，經(jīng)過病毒介導(dǎo)的miR-132過表達后，Tg2576小鼠在訓(xùn)練階段即學(xué)習(xí)的能力明顯增強，潛伏期顯著縮短，而在訓(xùn)練結(jié)束后的記憶檢測證實過表達miR-132后的Tg2576小鼠的記憶能力顯著增強，撤去平臺后穿越平臺的次數(shù)明顯增加，見圖5。

討論

MicroRNA是近年來出現(xiàn)的一種新的蛋白調(diào)控因子，通常是和靶蛋白3’UTR端互補結(jié)合導(dǎo)致蛋白表達抑制或者mRNA降解[10-11]。miR-132是一種富含于腦內(nèi)海馬組織的miRNA，更是特異性表達在神經(jīng)元上[12]。過表達miR-132可以通過下調(diào)p250GAP增加突觸的分支和樹突棘的數(shù)目[13]。敲除齒狀回的miR-132損傷樹突的發(fā)育[14]。嗅球區(qū)過表達miR-132在遷移期保護神經(jīng)元的存活，這種保護會引起遷移增加而改善學(xué)習(xí)記憶[15]。所以我們有理由推測miR-132參與了學(xué)習(xí)記憶的調(diào)控，而且這種調(diào)控機制現(xiàn)在還不清楚。

Figure 4.The levels of the synapse-related proteins regulated by miR-132. pLenti7.3 vector was empty control vector, and pLenti7.3-miR-132 was miR-132 over-expression virus. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspLenti7.3 vector.

圖4過表達miR132顯著影響PSD95、GluR1蛋白的表達水平

Figure 5.Overexpression of miR-132 attenuated Tg2576 mouse hippocampus-dependent spatial leanimg and memory impairment. Mean±SD.n=12.*P<0.05 ,**P<0.01vspLenti7.3 vector.

圖5過表達miR132改善Tg2576小鼠海馬依賴的空間學(xué)習(xí)記憶障礙

慢病毒具有可以感染非分裂期和分裂期細(xì)胞、容納外源性基因片段大、可以長期表達等顯著優(yōu)點已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[16]。為了更好地研究miR-132在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能，本研究利用Invitrogen最新的慢病毒表達系統(tǒng)ViraPowerTMHiPerformTMLentiviral Expression System，該系統(tǒng)具有更高的表達水平，更好的感染效率，而且能夠有效地感染體內(nèi)組織。我們利用分子生物學(xué)方法克隆了miR-132的前體序列，構(gòu)建了表達載體pLenti7.3-pri-miR-132,通過和病毒支持載體ViraPowerTMPackaging Mix共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞獲得了病毒顆粒。采用PEG-8000濃縮病毒后，體內(nèi)實驗證實了該病毒具有很好的感染效率和有效提升miR-132的表達水平。在阿爾茨海默疾病模型Tg2576小鼠海馬區(qū)注射該病毒過表達miR-132能夠顯著增加海馬區(qū)突觸相關(guān)蛋白PSD95和GluR1的水平。長時程增強(long-term potentiation，LTP)是學(xué)習(xí)記憶的分子基礎(chǔ)，GluR1屬于谷氨酸受體家族成員，PSD95(突觸后致密蛋白)可以整合谷氨酸受體家族成員之間的相互作用，促進Ca2+內(nèi)流，進而增強LTP。Morris水迷宮結(jié)果表明過表達miR-132的Tg2576小鼠在定位航行階段的潛伏期明顯縮短，而在空間搜索階段穿越平臺位置的次數(shù)也顯著增加，說明了其空間依賴的學(xué)習(xí)和記憶能力都得到了明顯改善。綜上所述，我們的研究結(jié)果初步證實了miR-132上調(diào)PSD95和GluR1的表達，可能通過增強LTP從而改善AD鼠的學(xué)習(xí)記能力，為進一步的研究提供一定的理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Overexpression of miR-132 attenuates Alzheimer disease-like learning and memory impairment

WANG Xue-yin1, LI Yi-pei1, CHENG Xiang-shu2, ZHAO Kun-peng2

(1HenanMedicalCollege,Zhengzhou451191,China;2MedicalCollegeofHenanUniversity,Kaifeng475004,China.E-mail:zhaokp@henu.edu.cn)

[ABSTRACT]AIM: To obtain miR-132 lentivirus and to detect the effect of miR-132 overexpression on the improvement of learning and memory impairment in Tg2576 mice. METHODS: The pri-miR-132 gene was purified from mouse brain and cloned into lentivirus vector pLenti7.3-miR-132. The miR-132 lentivirus was packaged by co-transfected pLenti7.3-miR-132 with ViraPower Packaging Mix into 293FT cells. The miR-132 lentivirus was purified 72 h later from the supernatant by ultracentrifugation and poly(ethylene glycol) method. The efficiency of miR-132 lentivirus was identified by transfection into N2A cells and mouse hippocampus region. Tg2576 mice were injected with miR-132 virus in the hippocampus region and the expression of learning- and memory-related proteins and functions were determined. RESULTS: miR-132 lentivirus expression vector was constructed successfully. The purified virus was obtained with transfection activity. Tg2576 mice with overexpression of miR-132 had a significant improvement in learning and memory abilities. CONCLUSION: miR-132 lentivirus with biological activity was obtained. Overexpression of miR-132 in the hippocampus region of Tg2576 mice attenuates the learning and memory impairment.

[KEY WORDS]MicroRNA-132; Virus package; Tg2576 mouse; Learning; memory

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0041- 05

[收稿日期]2015- 04- 15[修回日期] 2015- 11- 03

*[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81401062；No. U1504809)

通訊作者△Tel: 0371-23880585; E-mail: zhaokp@henu.edu.cn

[中圖分類號]R363.1+4

[文獻標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.007