王桂君，　姚玉勝，　王洪新

(遼寧醫(yī)學(xué)院 1附屬第一醫(yī)院， 2附屬第三醫(yī)院， 3藥理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000)

腫瘤壞死因子α通過(guò)PI3K-IP3R-Ca2+途徑誘導(dǎo)乳鼠心肌肥大*

王桂君1，姚玉勝2△，王洪新3

(遼寧醫(yī)學(xué)院1附屬第一醫(yī)院，2附屬第三醫(yī)院，3藥理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000)

[摘要]目的： 探討腫瘤壞死因子α(TNF-α)是否通過(guò)PI3K-IP3R-Ca2+信號(hào)途徑誘導(dǎo)心肌肥大。方法: 以培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞為模型，采用Lowry法測(cè)心肌細(xì)胞蛋白含量；[3H]-亮氨酸摻入法測(cè)定心肌細(xì)胞蛋白合成；計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測(cè)心肌細(xì)胞體積；Till陽(yáng)離子測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。結(jié)果: PI3K阻斷劑LY294002(50 μmol/L)明顯抑制TNF-α(100 μg/L)誘導(dǎo)的心肌 [Ca2+]i增高(P<0.01)，對(duì)正常心肌[Ca2+]i無(wú)明顯影響；其抑制程度與合用2-氨基乙基二苯硼酸鹽(2-APB)組相近，但小于與蘭尼堿(RYA)合用組(P<0.05)。PI3K阻斷劑LY294002(50 μmol/L)明顯抑制TNF-α(100 μg/L)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白含量、蛋白合成及細(xì)胞體積的增加；其抑制程度與合用2-APB組無(wú)差異，但明顯大于單用2-APB組，小于合用RYA組(P<0.05)。PI3K阻斷劑LY294002(50 μmol/L)對(duì)正常心肌細(xì)胞蛋白含量、蛋白合成及細(xì)胞體積無(wú)明顯影響。結(jié)論: TNF-α通過(guò)PI3K-IP3R-Ca2+途徑誘導(dǎo)心肌肥大。

[關(guān)鍵詞]心肌肥大； 腫瘤壞死因子α； PI3K-IP3R-Ca2+通路

心肌肥大的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制非常復(fù)雜，啟動(dòng)心肌肥大的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路一直是心血管疾病研究領(lǐng)域的重要問(wèn)題。目前已了解到若干條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路包括磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)途徑參與了心肌肥大的病理過(guò)程[1]。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt/PKB途徑的激活在腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)誘導(dǎo)培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞蛋白合成增加中起到重要作用[2]，但對(duì)于其上、下游元素尚未確定。

近幾年研究表明，PI3K參與心肌細(xì)胞Ca2+信號(hào)的調(diào)節(jié)[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道PI3K通過(guò)激活心肌細(xì)胞L型Ca2+通道增加心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，而與肌漿網(wǎng)鈣泵[sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase 2a，SERCA2a]、蘭尼堿受體(ryanodine receptor，RyR)以及Na+/Ca2+交換體(Na+/Ca2+exchanger，NCX)無(wú)關(guān)[4]。也有研究表明心肌特定性PI3Kα過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)Ca2+調(diào)節(jié)蛋白R(shí)yR、小窩蛋白(caveolin，Cav)1/2和SERCA2a的表達(dá)上調(diào)[5]。目前大量研究表明，PI3K的激活是磷脂酶C(phospholipase C，PLC)激活所必需的[6]。PI3K通過(guò)其產(chǎn)物磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PI-3,4,5-P3)激活PLC，PLC水解4,5二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PI-4,5-P2)產(chǎn)生第二信使三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate，IP3)和二酰甘油(diacylglycerol，DAG)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，增加心肌[Ca2+]i[7-8]。

心肌[Ca2+]i升高是導(dǎo)致心肌肥大的最基本信號(hào)，是心肌肥大的各種信號(hào)通路的匯集點(diǎn)，在心肌肥大的病理過(guò)程中起著重要作用。我們的研究[9-10]已證明TNF-α通過(guò)作用RyR和IP3R誘導(dǎo)心肌[Ca2+]i升高從而誘導(dǎo)心肌肥大。那么在TNF-α誘導(dǎo)心肌肥大過(guò)程中激活的PI3K是否參與了[Ca2+]i的調(diào)節(jié)？我們的研究[11]已表明TNF-α誘導(dǎo)心肌[Ca2+]i升高與L型Ca2+通道無(wú)關(guān)，故可以排除PI3K通過(guò)打開L型Ca2+通道參與調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)的心肌[Ca2+]i升高的可能性。我們進(jìn)一步探討PI3K能否通過(guò)作用RyR或IP3R參與調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，從而誘導(dǎo)心肌肥大。

材料和方法

1動(dòng)物

出生1～3 d的SD大鼠，雌雄兼用，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(遼)20030007。

2主要試劑

低糖DMEM和胰蛋白酶(Gibco)；5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2′-deoxyuridine,BrdU)、維生素B12、轉(zhuǎn)鐵蛋白、SDS、牛血清白蛋白、IP3R阻斷劑二苯硼酸2-氨基乙酯(2-aminoethoxydiphenyl borate，2-APB)和Fura-2/AM(Sigma)；胎牛血清(杭州四季青生物材料有限公司)； [3H]-亮氨酸(上海原子核研究所)；TNF-α(R&D)； RyR阻斷劑蘭尼堿(ryano-dine，RYA)購(gòu)自Merck；PI3K阻斷劑LY294002(Biosource)。

3主要方法

3.1體外乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)無(wú)菌條件下迅速取出心臟。Hanks液沖洗3次后剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小碎塊。加入0.08%胰蛋白酶消化細(xì)胞，將消化完畢細(xì)胞調(diào)至1×109/L(含84%DMEM培養(yǎng)基，15%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素)接種于24孔培養(yǎng)板，于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。最初72 h用0.1 mmol/L BrdU抑制非心肌細(xì)胞生長(zhǎng)。培養(yǎng)2～3 d換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基(內(nèi)含5 mg/L胰島素，5 μmol/L維生素B12，10 mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白)培養(yǎng)24 h。

3.2分組及給藥心肌細(xì)胞培養(yǎng)分為7組：對(duì)照組；TNF-α組；2-APB+TNF-α組；LY294002+ TNF-α組；LY294002+2-APB+TNF-α組；LY294002+RYA+TNF-α組；LY294002組。2-APB、LY294002及RYA濃度分別為30、50、50 μmol/L，均在TNF-α(100 μg/L)加入前30 min加入。給藥72 h后進(jìn)行肥大指標(biāo)包括心肌細(xì)胞蛋白含量、蛋白合成和細(xì)胞體積的測(cè)定。

3.3Fura-2/AM負(fù)載培養(yǎng)心肌細(xì)胞后采用Till陽(yáng)離子測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定心肌細(xì)胞[Ca2+]i瞬變共設(shè)9組：對(duì)照組；TNF-α組；2-APB+TNF-α組；RYA+TNF-α組；2-APB+RYA+TNF-α組；LY294002+TNF-α組；LY294002+2-APB+TNF-α組； LY294002+RYA+TNF-α組；LY294002組。上述阻斷劑及TNF-α濃度同前所述。預(yù)孵育30 min后上機(jī)測(cè)定。先記錄一段基礎(chǔ)值，觀察各阻斷劑對(duì)正常心肌細(xì)胞[Ca2+]i瞬變有無(wú)影響；再加入TNF-α(100 μg/L)，觀察TNF-α刺激前后鈣瞬變的變化。

3.4培養(yǎng)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的測(cè)定吸去培養(yǎng)板各孔中的培養(yǎng)液，用D-Hanks液快速?zèng)_洗3次后，加入1% SDS 0.5 mL溶解細(xì)胞，Lowrys法測(cè)每孔細(xì)胞蛋白質(zhì)含量。

3.5培養(yǎng)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的測(cè)定將生長(zhǎng)在24孔培養(yǎng)板上無(wú)血清靜止培養(yǎng)了48 h的細(xì)胞培養(yǎng)液倒掉，代之以含有3.7×104Bq[3H]-leucine及各種濃度的試劑，另備一組無(wú)任何細(xì)胞的單純培養(yǎng)基組，同樣加入3.7×104Bq [3H]-leucine與其它組一起培養(yǎng)72 h。用1 mL 1%的SDS溶解細(xì)胞，用液閃儀測(cè)量[3H]-leucine的摻入量，進(jìn)行蛋白合成的分析。

3.6培養(yǎng)心肌細(xì)胞體積的測(cè)定收集消化下的細(xì)胞注入一細(xì)胞室內(nèi)，在放大400倍的倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，幾乎均呈球形，用計(jì)算機(jī)CIAS大恒細(xì)胞圖象分析系統(tǒng)測(cè)量單個(gè)細(xì)胞的直徑，進(jìn)而計(jì)算出細(xì)胞體積。每孔隨機(jī)選擇4個(gè)視野，每個(gè)視野測(cè)20個(gè)細(xì)胞。

3.7培養(yǎng)心肌細(xì)胞[Ca2+]i瞬間變化的測(cè)定將長(zhǎng)有自發(fā)性搏動(dòng)的心肌細(xì)胞的蓋玻片從培養(yǎng)皿中取出，置于含有Fura-2/AM(3 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)基中，其中含有白蛋白0.2%，在37 ℃水浴中孵育30 min。取出蓋玻片，用HEPES緩沖液沖洗后，放于熒光顯微鏡下的灌流槽中，恒溫37 ℃，用HEPES緩沖液灌流，灌流速度為1 mL/min，所有藥物均在指定時(shí)間加入灌流液中。所用的測(cè)定儀器為Till陽(yáng)離子測(cè)定系統(tǒng)。激發(fā)光波長(zhǎng)分別為340及380 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為505 nm，采樣間隙為300 ms。每次選取5～10個(gè)細(xì)胞測(cè)量心肌[Ca2+]i的瞬變，連續(xù)記錄給藥前后的熒光強(qiáng)度。根據(jù)文獻(xiàn)[12]方法計(jì)算心肌細(xì)胞[Ca2+]i，計(jì)算前應(yīng)減去細(xì)胞自身的熒光。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析和析因設(shè)計(jì)的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，各組間均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1PI3K對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子瞬變的影響

PI3K阻斷劑LY294002并不明顯改變正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞的 [Ca2+]i瞬變幅度、靜息水平及搏動(dòng)頻率。LY294002明顯抑制由TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子瞬變幅度增高，但不影響基線水平及心肌細(xì)胞自發(fā)搏動(dòng)頻率。其抑制程度與2-APB或RYA的抑制作用相近，但較二者合用作用小(P<0.01)。LY294002與2-APB合用組對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變?cè)龈叩囊种谱饔门cLY294002單用組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TNF-α激活PI3K誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變?cè)龈吲cIP3R有關(guān)。LY294002與RYA合用組對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變?cè)龈叩囊种谱饔妹黠@大于LY294002單用組(P<0.01)，提示TNF-α激活PI3K誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Ca2+瞬變升高與RyR無(wú)關(guān)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The effects of PI3K on the spontaneous [Ca2+]itransient and rest/peak amplitude in cultured ventricular myocytes from the neonatal rats treated with TNF-α. LY: LY294002. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsTNF-α;△△P<0.01vsLY+TNF-α.

圖1PI3K對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子瞬變的幅度、靜息值和頻率的影響

2LY294002在有或無(wú)2-APB/RYA存在時(shí)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白含量增加的影響

與對(duì)照組相比，TNF-α組的心肌細(xì)胞蛋白含量增加了48.87%(P<0.01)；LY294002組的心肌細(xì)胞蛋白含量未見(jiàn)明顯改變，說(shuō)明LY294002對(duì)正常心肌細(xì)胞蛋白含量無(wú)明顯影響。與TNF-α組相比，TNF-α+2-APB組、TNF-α+LY294002組和TNF-α+LY294002+2-APB組的心肌細(xì)胞蛋白含量明顯降低(P<0.01)，分別降低了19.29%、33.47%和35.26%，說(shuō)明TNF-α通過(guò)激活PI3K或IP3R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞蛋白含量增加。其抑制程度LY294002組與LY294002+2-APB組接近，但明顯大于2-APB組(P<0.05)；提示TNF-α激活的PI3K通過(guò)作用IP3R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞蛋白含量增加，但除此可能尚存在其它途徑。LY294002+RYA組顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白含量增加(P<0.01)，降低了49%，與TNF-α+LY294002組相比有顯著差異(P<0.05)，說(shuō)明TNF-α激活的PI3K不是通過(guò)作用于RyR來(lái)參與誘導(dǎo)心肌蛋白含量增加的，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The effects of LY294002, RYA and/or 2-APB on protein content of cultured ventricular myocytes from neonatal rats treated with TNF-α. LY: LY294002. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsTNF-α;△P<0.05vsLY+TNF-α.

圖2LY294002在有或無(wú)2-APB/RYA時(shí)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白含量增加的影響

3LY294002在有或無(wú)2-APB/RYA存在時(shí)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白合成增加的影響

與對(duì)照組相比，TNF-α組的心肌細(xì)胞蛋白合成增加了33.97%(P<0.01)；LY294002組的心肌細(xì)胞蛋白合成量未見(jiàn)明顯改變，說(shuō)明LY294002對(duì)正常心肌細(xì)胞蛋白合成無(wú)明顯影響。與TNF-α組相比，TNF-α+2-APB組、TNF-α+LY294002組、TNF-α+LY294002+2-APB組的心肌細(xì)胞蛋白合成明顯降低(P<0.01)，分別降低了13.31%、23.40%和24.05%，說(shuō)明TNF-α通過(guò)激活PI3K或IP3R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞蛋白合成增加；其抑制作用LY294002組與LY294002+2-APB組接近，但明顯大于2-APB組(P<0.05)，說(shuō)明PI3K通過(guò)作用IP3R調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白合成增加，但除此PI3K可能還存在其它途徑參與TNF-α誘導(dǎo)的心肌蛋白合成增加。TNF-α+LY294002+ RYA組顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白合成增加(P<0.01)，降低了約32.98%，與TNF-α+LY294002組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，說(shuō)明PI3K不是通過(guò)作用于RyR來(lái)調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)的心肌蛋白合成增加的，見(jiàn)圖3。

4LY294002在有或無(wú)2-APB/RYA存在時(shí)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞體積增加的影響

與對(duì)照組相比，TNF-α組的心肌細(xì)胞體積增加了47.57% (P<0.01)；LY294002組的心肌細(xì)胞體積未見(jiàn)明顯改變，說(shuō)明LY294002對(duì)正常心肌細(xì)胞體積無(wú)明顯影響。與TNF-α組相比，TNF-α+ 2-APB組、TNF-α+LY294002組和TNF-α+ LY294002+2-APB組的心肌細(xì)胞體積明顯降低(P<0.01)，分別降低了13.94%、25.06%和31.51%，說(shuō)明TNF-α通過(guò)激活PI3K或IP3R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞體積增加。LY294002的抑制作用與LY294002+2-APB合用組接近，但顯著大于單用2-APB組(P<0.01)，說(shuō)明PI3K通過(guò)作用IP3R調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞體積增大，但除此尚存在其它途徑。LY294002+RYA組顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞體積增大(P<0.01)，降低了約40.33%，與TNF-α+LY294002組相比有顯著差異(P<0.01)，說(shuō)明PI3K不是通過(guò)作用于RyR來(lái)調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞體積增大的，見(jiàn)圖4。

Figure 3.The effects of LY294002, RYA and/or 2-APB on [3H]-leucine incorporation of cultured ventricular myocytes from neonatal rats treated with TNF-α. LY: LY294002. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsTNF-α;△P<0.05vsLY+TNF-α.

圖3LY294002在有或無(wú)2-APB/RYA存在時(shí)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白合成增加的影響

Figure 4.The effects of LY294002, RYA and/or 2-APB on the cell size of cultured ventricular myocytes from neonatal rats treated with TNF-α. LY: LY294002. Mean±SD.n=80.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsTNF-α;△△P<0.01vsLY+TNF-α.

圖4LY294002在有或無(wú)2-APB/RYA存在時(shí)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞體積增加的影響

討論

心肌肥大是心臟對(duì)多種因素長(zhǎng)期刺激所發(fā)生的適應(yīng)性改變，早期的代償性心肌肥大和心功能適應(yīng)性改變對(duì)機(jī)體是有利的，但若長(zhǎng)期得不到糾正將逐漸演變?yōu)樾牧λソ遊13]。由心衰而死亡是臨床病人的主要死因之一。現(xiàn)在研究認(rèn)為，在心肌肥大發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，胞內(nèi)鈣信號(hào)途徑是最重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PI3K抑制劑有LY294002和wortmannin兩種。我們之所以選擇LY294002，主要是因?yàn)榕cwortmanni相比，LY294002對(duì)PI3K的選擇性要更專一[14]。本研究顯示，PI3K阻斷劑LY294002(50 μmol/L)顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的心肌內(nèi)鈣離子瞬變幅度增高，但不影響基線水平及心肌細(xì)胞自發(fā)搏動(dòng)頻率。我們之前的研究[15]已證明L型Ca2+通道與TNF-α誘導(dǎo)的幅度增高無(wú)關(guān)，故可以排除PI3K通過(guò)打開L型Ca2+通道促使TNF-α誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子瞬變幅度增高的可能?；谖覀兿惹暗难芯縖9, 16]：TNF-α誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子瞬變幅度增高與IP3R和RyR有關(guān)，我們進(jìn)一步觀察在用IP3R阻斷劑2-APB(30 μmol/L)或RyR阻斷劑RYA(50 μmol/L)分別阻斷IP3R或RyR后LY294002對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子瞬變的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PI3K阻斷劑LY294002明顯抑制了TNF-α誘導(dǎo)的[Ca2+]i升高，提示PI3K激活參與調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞[Ca2+]i升高。LY294002與2-APB合用組對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變?cè)龈叩囊种谱饔门cLY294002單用組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TNF-α激活PI3K誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變?cè)龈吲cIP3R有關(guān)。LY294002與RYA合用組對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變?cè)龈叩囊种谱饔妹黠@大于LY294002單用組，提示TNF-α激活PI3K誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Ca2+瞬變升高與RyR無(wú)關(guān)。

為了明確[Ca2+]i升高在TNF-α誘導(dǎo)心肌肥大PI3K通路中的作用，我們通過(guò)檢測(cè)心肌細(xì)胞蛋白含量、蛋白合成量以及心肌細(xì)胞體積等指標(biāo)，進(jìn)一步觀察在有或無(wú)2-APB、RYA存在時(shí)LY294002對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的影響。結(jié)果表明PI3K阻斷劑LY294002顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白含量、蛋白合成量以及細(xì)胞體積的增加，其抑制程度與LY294002+2-APB無(wú)顯著差異。基于我們先前的研究已經(jīng)表明2-APB對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌肥大的抑制作用是由于2-APB阻斷IP3R導(dǎo)致TNF-α誘導(dǎo)的[Ca2+]i升高受到抑制，故目前研究提示TNF-α激活的PI3K可能是通過(guò)作用IP3R引起心肌細(xì)胞[Ca2+]i增加，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的。但LY294002的抑制程度明顯大于2-APB，提示TNF-α激活的PI3K不完全通過(guò)調(diào)節(jié)[Ca2+]i參與誘導(dǎo)肥大，除此之外可能尚存在其它途徑。LY294002與RYA合用對(duì)TNF-α誘導(dǎo)心肌肥大的抑制作用與LY294002單用組相比有顯著差異，說(shuō)明PI3K不是通過(guò)作用于RyR調(diào)節(jié)[Ca2+]i，從而參與TNF-α誘導(dǎo)心肌肥大的。這與我們前面結(jié)果所表明的PI3K通過(guò)作用IP3R而非RyR調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)的心肌[Ca2+]i增加相一致，進(jìn)一步支持[Ca2+]i增加在TNF-α誘導(dǎo)心肌肥大PI3K通路中起作用。

本研究結(jié)果說(shuō)明TNF-α通過(guò)PI3K-IP3R-Ca2+途徑誘導(dǎo)心肌肥大。TNF-α激活PI3K誘導(dǎo)的心肌肥大僅部分通過(guò)IP3R-Ca2+信號(hào)途徑，除此可能尚存在其它途徑參與TNF-α誘導(dǎo)的心肌肥大。據(jù)此可以推測(cè)，在TNF-α誘導(dǎo)心肌肥大的PI3K通路中，Ca2+信號(hào)通路與先前文獻(xiàn)報(bào)道的PI3K-Akt/PKB途徑不是一路，至少在Ca2+水平上是這樣。至于其后兩路是否會(huì)有交叉或交互，尚待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

Neonatal rat cardiomyocyte hypertrophy is induced by tumor necrosis factor-α through PI3K-IP3R-Ca2+pathways

WANG Gui-jun1, YAO Yu-sheng2, WANG Hong-xin3

(1TheFirstAffiliatedHospital,2TheThirdAffiliatedHospital,3DepartmentofPharmacology,LiaoningMedicalCollege,Jinzhou121000,China.E-mail:wgj-april@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of PI3K-IP3R-Ca2+pathways in cardiomyocyte hypertrophy induced by tumor necrosis factor-α (TNF-α). METHODS: Myocardial cells of neonatal rats were cultured in vitro. The hypertrophic model was induced by TNF-α. The protein content was assayed with Lowry’s method. The volumes of the cardiomyocytes were detected by computer photograph analysis system. The protein synthesis was determined by the method of [3H]-leucine incorporation. [Ca2+]i transient was measured by Till image system with cell-loading Fura-2/AM. RESULTS: LY294002, a PI3K inhibitor, significantly suppressed the amplitude elevation of the spontaneous [Ca2+]i transients induced by TNF-α in cultured ventricular myocytes from neonatal rats. The effect was similar to that of LY294002+2-APB (P>0.05), but lower than that in LY294002+ryanodine group (P<0.05). LY294002 significantly reduced the enhancements of protein content, [3H]-leucine incorporation and cell size induced by TNF-α. The effect was similar to that in 2-APB+LY294002 group, but higher than that in 2-APB group and lower than that in ryanodine+LY294002 group. CONCLUSION: TNF-α induces cardiac hypertrophy through PI3K-IP3R-Ca2+pathways.

[KEY WORDS]Cardiomyocyte hypertrophy; Tumor necrosis factor-α; PI3K-IP3R-Ca2+pathway

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)01- 0021- 06

[收稿日期]2015- 05- 20[修回日期] 2015- 10- 23

*[基金項(xiàng)目]遼寧省科技廳計(jì)劃(No. 2013225305)；遼寧醫(yī)學(xué)院校長(zhǎng)基金資助項(xiàng)目(No. xzjj20130232)

通訊作者△Tel: 0416-4197472； E-mail: wgj-april@163.com

[中圖分類號(hào)]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.004