王桂君，　姚玉勝，　王洪新

(遼寧醫(yī)學院 1附屬第一醫(yī)院， 2附屬第三醫(yī)院， 3藥理學教研室，遼寧 錦州 121000)

腫瘤壞死因子α通過PI3K-IP3R-Ca2+途徑誘導乳鼠心肌肥大*

王桂君1，姚玉勝2△，王洪新3

(遼寧醫(yī)學院1附屬第一醫(yī)院，2附屬第三醫(yī)院，3藥理學教研室，遼寧 錦州 121000)

[摘要]目的： 探討腫瘤壞死因子α(TNF-α)是否通過PI3K-IP3R-Ca2+信號途徑誘導心肌肥大。方法: 以培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞為模型，采用Lowry法測心肌細胞蛋白含量；[3H]-亮氨酸摻入法測定心肌細胞蛋白合成；計算機圖像分析系統(tǒng)測心肌細胞體積；Till陽離子測定系統(tǒng)測定心肌細胞內(nèi)Ca2+濃度。結果: PI3K阻斷劑LY294002(50 μmol/L)明顯抑制TNF-α(100 μg/L)誘導的心肌 [Ca2+]i增高(P<0.01)，對正常心肌[Ca2+]i無明顯影響；其抑制程度與合用2-氨基乙基二苯硼酸鹽(2-APB)組相近，但小于與蘭尼堿(RYA)合用組(P<0.05)。PI3K阻斷劑LY294002(50 μmol/L)明顯抑制TNF-α(100 μg/L)誘導的心肌細胞蛋白含量、蛋白合成及細胞體積的增加；其抑制程度與合用2-APB組無差異，但明顯大于單用2-APB組，小于合用RYA組(P<0.05)。PI3K阻斷劑LY294002(50 μmol/L)對正常心肌細胞蛋白含量、蛋白合成及細胞體積無明顯影響。結論: TNF-α通過PI3K-IP3R-Ca2+途徑誘導心肌肥大。

[關鍵詞]心肌肥大； 腫瘤壞死因子α； PI3K-IP3R-Ca2+通路

心肌肥大的信號轉導機制非常復雜，啟動心肌肥大的信號轉導通路一直是心血管疾病研究領域的重要問題。目前已了解到若干條細胞內(nèi)信號通路包括磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)途徑參與了心肌肥大的病理過程[1]。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt/PKB途徑的激活在腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)誘導培養(yǎng)乳鼠心肌細胞蛋白合成增加中起到重要作用[2]，但對于其上、下游元素尚未確定。

近幾年研究表明，PI3K參與心肌細胞Ca2+信號的調(diào)節(jié)[3]。有文獻報道PI3K通過激活心肌細胞L型Ca2+通道增加心肌細胞內(nèi)Ca2+水平，而與肌漿網(wǎng)鈣泵[sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase 2a，SERCA2a]、蘭尼堿受體(ryanodine receptor，RyR)以及Na+/Ca2+交換體(Na+/Ca2+exchanger，NCX)無關[4]。也有研究表明心肌特定性PI3Kα過表達誘導Ca2+調(diào)節(jié)蛋白RyR、小窩蛋白(caveolin，Cav)1/2和SERCA2a的表達上調(diào)[5]。目前大量研究表明，PI3K的激活是磷脂酶C(phospholipase C，PLC)激活所必需的[6]。PI3K通過其產(chǎn)物磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PI-3,4,5-P3)激活PLC，PLC水解4,5二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PI-4,5-P2)產(chǎn)生第二信使三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate，IP3)和二酰甘油(diacylglycerol，DAG)，誘導心肌細胞內(nèi)Ca2+釋放，增加心肌[Ca2+]i[7-8]。

心肌[Ca2+]i升高是導致心肌肥大的最基本信號，是心肌肥大的各種信號通路的匯集點，在心肌肥大的病理過程中起著重要作用。我們的研究[9-10]已證明TNF-α通過作用RyR和IP3R誘導心肌[Ca2+]i升高從而誘導心肌肥大。那么在TNF-α誘導心肌肥大過程中激活的PI3K是否參與了[Ca2+]i的調(diào)節(jié)？我們的研究[11]已表明TNF-α誘導心肌[Ca2+]i升高與L型Ca2+通道無關，故可以排除PI3K通過打開L型Ca2+通道參與調(diào)節(jié)TNF-α誘導的心肌[Ca2+]i升高的可能性。我們進一步探討PI3K能否通過作用RyR或IP3R參與調(diào)節(jié)TNF-α誘導的心肌細胞內(nèi)Ca2+濃度，從而誘導心肌肥大。

材料和方法

1動物

出生1～3 d的SD大鼠，雌雄兼用，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供。動物合格證號為SCXK(遼)20030007。

2主要試劑

低糖DMEM和胰蛋白酶(Gibco)；5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2′-deoxyuridine,BrdU)、維生素B12、轉鐵蛋白、SDS、牛血清白蛋白、IP3R阻斷劑二苯硼酸2-氨基乙酯(2-aminoethoxydiphenyl borate，2-APB)和Fura-2/AM(Sigma)；胎牛血清(杭州四季青生物材料有限公司)； [3H]-亮氨酸(上海原子核研究所)；TNF-α(R&D)； RyR阻斷劑蘭尼堿(ryano-dine，RYA)購自Merck；PI3K阻斷劑LY294002(Biosource)。

3主要方法

3.1體外乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)無菌條件下迅速取出心臟。Hanks液沖洗3次后剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小碎塊。加入0.08%胰蛋白酶消化細胞，將消化完畢細胞調(diào)至1×109/L(含84%DMEM培養(yǎng)基，15%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素)接種于24孔培養(yǎng)板，于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。最初72 h用0.1 mmol/L BrdU抑制非心肌細胞生長。培養(yǎng)2～3 d換無血清DMEM培養(yǎng)基(內(nèi)含5 mg/L胰島素，5 μmol/L維生素B12，10 mg/L轉鐵蛋白)培養(yǎng)24 h。

3.2分組及給藥心肌細胞培養(yǎng)分為7組：對照組；TNF-α組；2-APB+TNF-α組；LY294002+ TNF-α組；LY294002+2-APB+TNF-α組；LY294002+RYA+TNF-α組；LY294002組。2-APB、LY294002及RYA濃度分別為30、50、50 μmol/L，均在TNF-α(100 μg/L)加入前30 min加入。給藥72 h后進行肥大指標包括心肌細胞蛋白含量、蛋白合成和細胞體積的測定。

3.3Fura-2/AM負載培養(yǎng)心肌細胞后采用Till陽離子測定系統(tǒng)測定心肌細胞[Ca2+]i瞬變共設9組：對照組；TNF-α組；2-APB+TNF-α組；RYA+TNF-α組；2-APB+RYA+TNF-α組；LY294002+TNF-α組；LY294002+2-APB+TNF-α組； LY294002+RYA+TNF-α組；LY294002組。上述阻斷劑及TNF-α濃度同前所述。預孵育30 min后上機測定。先記錄一段基礎值，觀察各阻斷劑對正常心肌細胞[Ca2+]i瞬變有無影響；再加入TNF-α(100 μg/L)，觀察TNF-α刺激前后鈣瞬變的變化。

3.4培養(yǎng)心肌細胞蛋白質(zhì)含量的測定吸去培養(yǎng)板各孔中的培養(yǎng)液，用D-Hanks液快速沖洗3次后，加入1% SDS 0.5 mL溶解細胞，Lowrys法測每孔細胞蛋白質(zhì)含量。

3.5培養(yǎng)心肌細胞蛋白質(zhì)合成的測定將生長在24孔培養(yǎng)板上無血清靜止培養(yǎng)了48 h的細胞培養(yǎng)液倒掉，代之以含有3.7×104Bq[3H]-leucine及各種濃度的試劑，另備一組無任何細胞的單純培養(yǎng)基組，同樣加入3.7×104Bq [3H]-leucine與其它組一起培養(yǎng)72 h。用1 mL 1%的SDS溶解細胞，用液閃儀測量[3H]-leucine的摻入量，進行蛋白合成的分析。

3.6培養(yǎng)心肌細胞體積的測定收集消化下的細胞注入一細胞室內(nèi)，在放大400倍的倒置顯微鏡下觀察細胞，幾乎均呈球形，用計算機CIAS大恒細胞圖象分析系統(tǒng)測量單個細胞的直徑，進而計算出細胞體積。每孔隨機選擇4個視野，每個視野測20個細胞。

3.7培養(yǎng)心肌細胞[Ca2+]i瞬間變化的測定將長有自發(fā)性搏動的心肌細胞的蓋玻片從培養(yǎng)皿中取出，置于含有Fura-2/AM(3 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)基中，其中含有白蛋白0.2%，在37 ℃水浴中孵育30 min。取出蓋玻片，用HEPES緩沖液沖洗后，放于熒光顯微鏡下的灌流槽中，恒溫37 ℃，用HEPES緩沖液灌流，灌流速度為1 mL/min，所有藥物均在指定時間加入灌流液中。所用的測定儀器為Till陽離子測定系統(tǒng)。激發(fā)光波長分別為340及380 nm，發(fā)射光波長為505 nm，采樣間隙為300 ms。每次選取5～10個細胞測量心肌[Ca2+]i的瞬變，連續(xù)記錄給藥前后的熒光強度。根據(jù)文獻[12]方法計算心肌細胞[Ca2+]i，計算前應減去細胞自身的熒光。

4統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析和析因設計的方差分析進行統(tǒng)計學檢驗，各組間均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1PI3K對TNF-α誘導的心肌細胞內(nèi)鈣離子瞬變的影響

PI3K阻斷劑LY294002并不明顯改變正常培養(yǎng)心肌細胞的 [Ca2+]i瞬變幅度、靜息水平及搏動頻率。LY294002明顯抑制由TNF-α誘導的心肌細胞內(nèi)鈣離子瞬變幅度增高，但不影響基線水平及心肌細胞自發(fā)搏動頻率。其抑制程度與2-APB或RYA的抑制作用相近，但較二者合用作用小(P<0.01)。LY294002與2-APB合用組對TNF-α誘導的心肌細胞內(nèi)Ca2+瞬變增高的抑制作用與LY294002單用組差異無統(tǒng)計學意義，提示TNF-α激活PI3K誘導的心肌細胞內(nèi)Ca2+瞬變增高與IP3R有關。LY294002與RYA合用組對TNF-α誘導的心肌細胞內(nèi)Ca2+瞬變增高的抑制作用明顯大于LY294002單用組(P<0.01)，提示TNF-α激活PI3K誘導的心肌細胞Ca2+瞬變升高與RyR無關，見圖1。

Figure 1.The effects of PI3K on the spontaneous [Ca2+]itransient and rest/peak amplitude in cultured ventricular myocytes from the neonatal rats treated with TNF-α. LY: LY294002. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsTNF-α;△△P<0.01vsLY+TNF-α.

圖1PI3K對TNF-α誘導的心肌細胞內(nèi)鈣離子瞬變的幅度、靜息值和頻率的影響

2LY294002在有或無2-APB/RYA存在時對TNF-α誘導的心肌細胞蛋白含量增加的影響

與對照組相比，TNF-α組的心肌細胞蛋白含量增加了48.87%(P<0.01)；LY294002組的心肌細胞蛋白含量未見明顯改變，說明LY294002對正常心肌細胞蛋白含量無明顯影響。與TNF-α組相比，TNF-α+2-APB組、TNF-α+LY294002組和TNF-α+LY294002+2-APB組的心肌細胞蛋白含量明顯降低(P<0.01)，分別降低了19.29%、33.47%和35.26%，說明TNF-α通過激活PI3K或IP3R誘導心肌細胞蛋白含量增加。其抑制程度LY294002組與LY294002+2-APB組接近，但明顯大于2-APB組(P<0.05)；提示TNF-α激活的PI3K通過作用IP3R誘導心肌細胞蛋白含量增加，但除此可能尚存在其它途徑。LY294002+RYA組顯著抑制TNF-α誘導的心肌細胞蛋白含量增加(P<0.01)，降低了49%，與TNF-α+LY294002組相比有顯著差異(P<0.05)，說明TNF-α激活的PI3K不是通過作用于RyR來參與誘導心肌蛋白含量增加的，見圖2。

Figure 2.The effects of LY294002, RYA and/or 2-APB on protein content of cultured ventricular myocytes from neonatal rats treated with TNF-α. LY: LY294002. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsTNF-α;△P<0.05vsLY+TNF-α.

圖2LY294002在有或無2-APB/RYA時對TNF-α誘導的心肌細胞蛋白含量增加的影響

3LY294002在有或無2-APB/RYA存在時對TNF-α誘導的心肌細胞蛋白合成增加的影響

與對照組相比，TNF-α組的心肌細胞蛋白合成增加了33.97%(P<0.01)；LY294002組的心肌細胞蛋白合成量未見明顯改變，說明LY294002對正常心肌細胞蛋白合成無明顯影響。與TNF-α組相比，TNF-α+2-APB組、TNF-α+LY294002組、TNF-α+LY294002+2-APB組的心肌細胞蛋白合成明顯降低(P<0.01)，分別降低了13.31%、23.40%和24.05%，說明TNF-α通過激活PI3K或IP3R誘導心肌細胞蛋白合成增加；其抑制作用LY294002組與LY294002+2-APB組接近，但明顯大于2-APB組(P<0.05)，說明PI3K通過作用IP3R調(diào)節(jié)TNF-α誘導的心肌細胞蛋白合成增加，但除此PI3K可能還存在其它途徑參與TNF-α誘導的心肌蛋白合成增加。TNF-α+LY294002+ RYA組顯著抑制TNF-α誘導的心肌細胞蛋白合成增加(P<0.01)，降低了約32.98%，與TNF-α+LY294002組相比差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，說明PI3K不是通過作用于RyR來調(diào)節(jié)TNF-α誘導的心肌蛋白合成增加的，見圖3。

4LY294002在有或無2-APB/RYA存在時對TNF-α誘導的心肌細胞體積增加的影響

與對照組相比，TNF-α組的心肌細胞體積增加了47.57% (P<0.01)；LY294002組的心肌細胞體積未見明顯改變，說明LY294002對正常心肌細胞體積無明顯影響。與TNF-α組相比，TNF-α+ 2-APB組、TNF-α+LY294002組和TNF-α+ LY294002+2-APB組的心肌細胞體積明顯降低(P<0.01)，分別降低了13.94%、25.06%和31.51%，說明TNF-α通過激活PI3K或IP3R誘導心肌細胞體積增加。LY294002的抑制作用與LY294002+2-APB合用組接近，但顯著大于單用2-APB組(P<0.01)，說明PI3K通過作用IP3R調(diào)節(jié)TNF-α誘導的心肌細胞體積增大，但除此尚存在其它途徑。LY294002+RYA組顯著抑制TNF-α誘導的心肌細胞體積增大(P<0.01)，降低了約40.33%，與TNF-α+LY294002組相比有顯著差異(P<0.01)，說明PI3K不是通過作用于RyR來調(diào)節(jié)TNF-α誘導的心肌細胞體積增大的，見圖4。

Figure 3.The effects of LY294002, RYA and/or 2-APB on [3H]-leucine incorporation of cultured ventricular myocytes from neonatal rats treated with TNF-α. LY: LY294002. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsTNF-α;△P<0.05vsLY+TNF-α.

圖3LY294002在有或無2-APB/RYA存在時對TNF-α誘導的心肌細胞蛋白合成增加的影響

Figure 4.The effects of LY294002, RYA and/or 2-APB on the cell size of cultured ventricular myocytes from neonatal rats treated with TNF-α. LY: LY294002. Mean±SD.n=80.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsTNF-α;△△P<0.01vsLY+TNF-α.

圖4LY294002在有或無2-APB/RYA存在時對TNF-α誘導的心肌細胞體積增加的影響

討論

心肌肥大是心臟對多種因素長期刺激所發(fā)生的適應性改變，早期的代償性心肌肥大和心功能適應性改變對機體是有利的，但若長期得不到糾正將逐漸演變?yōu)樾牧λソ遊13]。由心衰而死亡是臨床病人的主要死因之一?，F(xiàn)在研究認為，在心肌肥大發(fā)生發(fā)展過程中，胞內(nèi)鈣信號途徑是最重要信號轉導通路之一。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PI3K抑制劑有LY294002和wortmannin兩種。我們之所以選擇LY294002，主要是因為與wortmanni相比，LY294002對PI3K的選擇性要更專一[14]。本研究顯示，PI3K阻斷劑LY294002(50 μmol/L)顯著抑制TNF-α誘導的心肌內(nèi)鈣離子瞬變幅度增高，但不影響基線水平及心肌細胞自發(fā)搏動頻率。我們之前的研究[15]已證明L型Ca2+通道與TNF-α誘導的幅度增高無關，故可以排除PI3K通過打開L型Ca2+通道促使TNF-α誘導心肌細胞內(nèi)鈣離子瞬變幅度增高的可能。基于我們先前的研究[9, 16]：TNF-α誘導心肌細胞內(nèi)鈣離子瞬變幅度增高與IP3R和RyR有關，我們進一步觀察在用IP3R阻斷劑2-APB(30 μmol/L)或RyR阻斷劑RYA(50 μmol/L)分別阻斷IP3R或RyR后LY294002對TNF-α誘導的心肌細胞內(nèi)鈣離子瞬變的影響。結果發(fā)現(xiàn)PI3K阻斷劑LY294002明顯抑制了TNF-α誘導的[Ca2+]i升高，提示PI3K激活參與調(diào)節(jié)TNF-α誘導的心肌細胞[Ca2+]i升高。LY294002與2-APB合用組對TNF-α誘導的心肌細胞內(nèi)Ca2+瞬變增高的抑制作用與LY294002單用組比較差異無統(tǒng)計學意義，提示TNF-α激活PI3K誘導的心肌細胞內(nèi)Ca2+瞬變增高與IP3R有關。LY294002與RYA合用組對TNF-α誘導的心肌細胞內(nèi)Ca2+瞬變增高的抑制作用明顯大于LY294002單用組，提示TNF-α激活PI3K誘導的心肌細胞Ca2+瞬變升高與RyR無關。

為了明確[Ca2+]i升高在TNF-α誘導心肌肥大PI3K通路中的作用，我們通過檢測心肌細胞蛋白含量、蛋白合成量以及心肌細胞體積等指標，進一步觀察在有或無2-APB、RYA存在時LY294002對TNF-α誘導的心肌細胞肥大的影響。結果表明PI3K阻斷劑LY294002顯著抑制TNF-α誘導的心肌細胞蛋白含量、蛋白合成量以及細胞體積的增加，其抑制程度與LY294002+2-APB無顯著差異。基于我們先前的研究已經(jīng)表明2-APB對TNF-α誘導的心肌肥大的抑制作用是由于2-APB阻斷IP3R導致TNF-α誘導的[Ca2+]i升高受到抑制，故目前研究提示TNF-α激活的PI3K可能是通過作用IP3R引起心肌細胞[Ca2+]i增加，從而誘導心肌細胞肥大的。但LY294002的抑制程度明顯大于2-APB，提示TNF-α激活的PI3K不完全通過調(diào)節(jié)[Ca2+]i參與誘導肥大，除此之外可能尚存在其它途徑。LY294002與RYA合用對TNF-α誘導心肌肥大的抑制作用與LY294002單用組相比有顯著差異，說明PI3K不是通過作用于RyR調(diào)節(jié)[Ca2+]i，從而參與TNF-α誘導心肌肥大的。這與我們前面結果所表明的PI3K通過作用IP3R而非RyR調(diào)節(jié)TNF-α誘導的心肌[Ca2+]i增加相一致，進一步支持[Ca2+]i增加在TNF-α誘導心肌肥大PI3K通路中起作用。

本研究結果說明TNF-α通過PI3K-IP3R-Ca2+途徑誘導心肌肥大。TNF-α激活PI3K誘導的心肌肥大僅部分通過IP3R-Ca2+信號途徑，除此可能尚存在其它途徑參與TNF-α誘導的心肌肥大。據(jù)此可以推測，在TNF-α誘導心肌肥大的PI3K通路中，Ca2+信號通路與先前文獻報道的PI3K-Akt/PKB途徑不是一路，至少在Ca2+水平上是這樣。至于其后兩路是否會有交叉或交互，尚待進一步研究。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

Neonatal rat cardiomyocyte hypertrophy is induced by tumor necrosis factor-α through PI3K-IP3R-Ca2+pathways

WANG Gui-jun1, YAO Yu-sheng2, WANG Hong-xin3

(1TheFirstAffiliatedHospital,2TheThirdAffiliatedHospital,3DepartmentofPharmacology,LiaoningMedicalCollege,Jinzhou121000,China.E-mail:wgj-april@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of PI3K-IP3R-Ca2+pathways in cardiomyocyte hypertrophy induced by tumor necrosis factor-α (TNF-α). METHODS: Myocardial cells of neonatal rats were cultured in vitro. The hypertrophic model was induced by TNF-α. The protein content was assayed with Lowry’s method. The volumes of the cardiomyocytes were detected by computer photograph analysis system. The protein synthesis was determined by the method of [3H]-leucine incorporation. [Ca2+]i transient was measured by Till image system with cell-loading Fura-2/AM. RESULTS: LY294002, a PI3K inhibitor, significantly suppressed the amplitude elevation of the spontaneous [Ca2+]i transients induced by TNF-α in cultured ventricular myocytes from neonatal rats. The effect was similar to that of LY294002+2-APB (P>0.05), but lower than that in LY294002+ryanodine group (P<0.05). LY294002 significantly reduced the enhancements of protein content, [3H]-leucine incorporation and cell size induced by TNF-α. The effect was similar to that in 2-APB+LY294002 group, but higher than that in 2-APB group and lower than that in ryanodine+LY294002 group. CONCLUSION: TNF-α induces cardiac hypertrophy through PI3K-IP3R-Ca2+pathways.

[KEY WORDS]Cardiomyocyte hypertrophy; Tumor necrosis factor-α; PI3K-IP3R-Ca2+pathway

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0021- 06

[收稿日期]2015- 05- 20[修回日期] 2015- 10- 23

*[基金項目]遼寧省科技廳計劃(No. 2013225305)；遼寧醫(yī)學院校長基金資助項目(No. xzjj20130232)

通訊作者△Tel: 0416-4197472； E-mail: wgj-april@163.com

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.004