王傳凱，　陸愛珍，　祁媛媛，　錢莉玲

(復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院，上海 201102)

內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)高氧暴露下Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增殖和分化的影響*

王傳凱，陸愛珍，祁媛媛，錢莉玲△

(復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院，上海 201102)

[摘要]目的： 研究高氧暴露對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)旁分泌功能的影響，并探索EPCs旁分泌因子對(duì)高氧暴露下Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(AECⅡ)功能的影響。方法: 分離大鼠骨髓來源的單個(gè)核細(xì)胞，EGM-2MV培養(yǎng)基培養(yǎng)7～10 d獲取EPCs，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。分別在空氣條件下及60%的氧濃度條件下培養(yǎng)EPCs，收集空氣組EPCs培養(yǎng)上清(E-CM-RA)和高氧組EPCs培養(yǎng)上清(E-CM-O2)，ELISA法檢測(cè)2組上清中VEGF、FGF10、EGF及PDGF-BB的表達(dá)水平。分離純化培養(yǎng)成年大鼠的AECⅡ，常規(guī)培養(yǎng)至第2 天，分為4組：(1)RA組：空氣條件下培養(yǎng)；(2) O2組：60%的氧濃度條件下培養(yǎng)；(3) O2+E-CM-RA組：在O2組的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)基中加入E-CM-RA；(4) O2+E-CM-O2組：在O2組的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)基中加入E-CM-O2。分別在干預(yù)12 h、24 h、2 d和3 d，用MTT法及細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)4組AECⅡ的增殖情況；在24 h、2 d和3 d用real-time PCR法檢測(cè)4組AECⅡ中SP-C和AQP5的mRNA表達(dá)量。結(jié)果: E-CM-RA中VEGF及FGF10的表達(dá)水平明顯高于E-CM-O2(P<0.05)。干預(yù)不同時(shí)間，各組間AECⅡ的活力及數(shù)量均有明顯差異(P<0.01)。與RA組相比，O2組AECⅡ各時(shí)點(diǎn)的活力明顯下降，數(shù)量明顯減少(P<0.05)；與O2組相比，各時(shí)點(diǎn)O2+E-CM-RA組AECⅡ的活力明顯增高，數(shù)量明顯增加(P<0.05)；但O2+E-CM-O2組與O2組AECⅡ的活力及數(shù)量均無顯著差異。干預(yù)24 h、2 d及3 d，4組間AECⅡ的SP-C與AQP5 mRNA的表達(dá)量均具有明顯差異(P<0.01)。與RA組相比，O2組AECⅡ中SP-C的mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，AQP5的mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.01)。與O2組相比，在24 h、2 d及3 d時(shí)， O2+E-CM-RA組和O2+E-CM-O2組AECⅡ中SP-C的mRNA表達(dá)量顯著增高(P<0.05)，而在2 d及3 d時(shí)，AQP5的mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。結(jié)論: EPCs可分泌肺發(fā)育相關(guān)生長(zhǎng)因子VEGF和FGF10，高氧暴露抑制EPCs表達(dá) VEGF和FGF10。高氧暴露抑制AECⅡ的增殖，降低AECⅡ表達(dá)SP-C mRNA，促進(jìn)AECⅡ表達(dá)AQP5 mRNA。EPCs培養(yǎng)上清能夠改善高氧暴露對(duì)AECⅡ增殖的抑制作用，維持AECⅡ本身特性，抑制AECⅡ向AECⅠ分化。而高氧暴露部分削弱了EPCs培養(yǎng)上清的這種作用，這可能與高氧暴露抑制EPCs表達(dá)肺發(fā)育相關(guān)因子VEGF和FGF10有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]內(nèi)皮祖細(xì)胞； 旁分泌功能； 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞； 高氧損傷

支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)在早產(chǎn)兒表現(xiàn)為肺發(fā)育停滯，病理表現(xiàn)為肺血管異常和肺泡簡(jiǎn)化[1]。研究顯示肺內(nèi)血管是肺泡化的“源動(dòng)力”，血管生成機(jī)制的破壞削弱了肺泡化[2]。內(nèi)皮祖細(xì)胞(epithelial progenitor cells，EPCs)是影響血管發(fā)育的關(guān)鍵細(xì)胞之一，具有很強(qiáng)的自我更新和高度增殖能力，并能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞參與血管生成[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒循環(huán)EPCs的數(shù)量和功能與BPD發(fā)生相關(guān)[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，高氧暴露降低了新生小鼠骨髓、循環(huán)和肺組織EPCs數(shù)目，破壞了肺血管發(fā)育和肺泡化，而給予外源性EPCs可促進(jìn)肺部血管的形成，增加肺泡數(shù)量[5]。然而，單純?cè)黾右浦睧PCs的數(shù)目對(duì)高氧肺損傷的療效有限[6]。近來研究發(fā)現(xiàn)EPCs具有旁分泌功能[7]，旁分泌因子包括血管內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、血小板源性生長(zhǎng)因子BB(platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)、角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(keratinocyte growth factor，KGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)等。EPCs旁分泌因子能促進(jìn)血管形成，維持血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)的完整[8-9]；在促進(jìn)血管生成方面，EPCs旁分泌因子與EPCs移植療效相當(dāng)[10]。

Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(type Ⅱ alveolar epithelial cells，AECⅡ)是肺組織中的干細(xì)胞，能分化為Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞(type Ⅰ alveolar epithelial cells，AECⅠ)，參與肺損傷修復(fù)，并分泌肺泡表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant, PS)維持肺泡穩(wěn)定。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)切除小鼠單側(cè)肺可誘導(dǎo)EPCs分泌MMP14，使EGF樣配體增加，刺激AEC Ⅱ增殖，促進(jìn)再生性肺泡化[11]。在高氧肺損傷的研究方面，目前鮮有研究EPCs旁分泌功能對(duì)AECⅡ作用的報(bào)道。大量研究表明高濃度氧氣抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡[12]。本研究設(shè)想在體外建立高氧環(huán)境，研究高氧暴露對(duì)EPCs旁分泌功能的影響，以及EPCs旁分泌因子對(duì)高氧暴露下AECⅡ的增殖分化的影響。

材料和方法

1EPCs原代培養(yǎng)及免疫熒光染色鑒定

分離大鼠骨髓來源的單個(gè)核細(xì)胞，用EGM-2MV培養(yǎng)基(LONZA)重懸，以每孔2×106的密度接種于纖連蛋白(Sigma)包被過夜的6孔板中。培養(yǎng)3 d后棄去懸液，已貼壁細(xì)胞換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)變化。培養(yǎng)7～10 d，消化收獲細(xì)胞進(jìn)行EPCs鑒定。培養(yǎng)所得的爬片細(xì)胞分別加入DiI-acLDL(Biomedical Technologies)37 ℃孵育4 h和FITC-UEA-1(Sigma)37 ℃孵育1 h，經(jīng)4%多聚甲醛固定，0.3% Triton Χ-100破膜，DAPI染核后，免疫熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)雙陽性細(xì)胞比例。

2AECⅡ原代培養(yǎng)及細(xì)胞鑒定

取大鼠肺組織，采用彈力蛋白酶/胰酶混合消化獲得混合細(xì)胞，進(jìn)一步采用免疫黏附法純化AECⅡ。純化后細(xì)胞用含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，以每孔4×106的密度接種于6孔板內(nèi)，每天換液。純化培養(yǎng)2 d的細(xì)胞，采用BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)染色，普通顯微鏡下計(jì)數(shù)藍(lán)紫色深染細(xì)胞的比例，計(jì)算細(xì)胞純度。純化培養(yǎng)2 d的細(xì)胞離心后，加2.5%戊二醛固定細(xì)胞沉淀過夜，依次進(jìn)行固定、脫水、包埋及超薄切片后，在透射電鏡下觀察AECⅡ特征性結(jié)構(gòu)板層小體和微絨毛。

3實(shí)驗(yàn)分組

3.1EPCs分組培養(yǎng)7～10 d的EPCs，以4×105的密度接種于6 cm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%融合時(shí)開始干預(yù)，分為空氣組和高氧組干預(yù)EPCs?？諝饨M直接置于普通CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，高氧組則置于自制培養(yǎng)器皿中(10 cm×15 cm×25 cm)，持續(xù)通入含有60% O2和5% CO2的混合氣體。培養(yǎng)2 d后2組均更換培養(yǎng)基為3 mL無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于普通CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后收集上清，空氣組EPCs培養(yǎng)上清(EPC-conditioned medium-room air,E-CM-RA)和高氧組EPCs培養(yǎng)上清(EPC-conditioned medium-O2,E-CM-O2)，-80 ℃保存?zhèn)溆肹13]。

3.2AECⅡ分組置于6孔板中原代培養(yǎng)第2 天的AECⅡ，分為正常室內(nèi)空氣(room air, RA)組、O2組、O2+E-CM-RA組和O2+E-CM-O2組。RA組置于普通CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為1 mL完全培養(yǎng)基+1 mL無血清培養(yǎng)基； O2組置于自制培養(yǎng)器皿中，持續(xù)通入含有60% O2和5% CO2的混合氣體，培養(yǎng)液為1 mL完全培養(yǎng)基+1 mL無血清培養(yǎng)基； O2+E-CM-RA組高氧干預(yù)同O2組，培養(yǎng)液為1 mL完全培養(yǎng)基+1 mL E-CM-RA；O2+E-CM-O2組高氧干預(yù)同O2組，培養(yǎng)液為1 mL完全培養(yǎng)基+1 mL E-CM-O2。

4方法

4.1ELISA檢測(cè)EPCs培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子ELISA法檢測(cè)2組上清中VEGF、EGF(Maibio)、HGF10(Mybiosource)及PDGF-BB(R&D)的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

4.2MTT法測(cè)量AECⅡ的細(xì)胞活力在各組AECⅡ培養(yǎng)12 h、24 h、2 d和3 d時(shí)加入MTS工作液(Biovision)，2 h后492 nm處檢測(cè)各孔的吸光度(A)值。

4.3血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)AECⅡ細(xì)胞數(shù)量的變化在各組AECⅡ培養(yǎng)12 h、24 h、2 d、3 d時(shí)，棄去培養(yǎng)基，0.25%的胰酶完全消化、重懸后，取2 μL加入血球計(jì)數(shù)板，計(jì)數(shù)各組AECⅡ的細(xì)胞數(shù)目。

4.4Real-time PCR實(shí)驗(yàn)分別在培養(yǎng)24 h、2 d和3 d，收集ACEⅡ，采用TRIzol試劑提取總RNA，將1 μg的RNA用PrimeScript? RT試劑盒(TaKaRa)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。每個(gè)生物學(xué)指標(biāo)用2 μL 的cDNA 采用SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ 試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40循環(huán)。GAPDH 作為內(nèi)參照。各生物學(xué)指標(biāo)的引物見表1。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行半定量分析。

表1　各基因的引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

F: forword; R: reverse.

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。正態(tài)分布的兩組計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni方法進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1EPCs培養(yǎng)與鑒定

倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)3 d，EPCs未貼壁，細(xì)胞多為小圓形；培養(yǎng)4 d，細(xì)胞開始貼壁，并逐漸由小圓形細(xì)胞向梭形細(xì)胞轉(zhuǎn)化；培養(yǎng)至7～10 d，梭形細(xì)胞不斷增多，呈典型的鵝卵石鋪路樣改變。在熒光顯微鏡下，胞膜結(jié)合FITC-UEA-1顯示為綠色，胞漿攝取DiI-acLDL顯示為紅色，雙染色陽性細(xì)胞為橙色，為正在分化的EPCs，約占總細(xì)胞數(shù)的80%，見圖1。

Figure 1.Characterization and identification by fluorescent staining of isolated EPCs. A: bone marrow-derived mononuclear cells cultured for 7～10 d, under inverted microscope; B: EPCs-uptaking DiI-acLDL was red; C: EPC-binding FITC-UEA-1 was green; D: double DiI-acLDL/FITC-UEA-1 positive cells were EPCs.

圖1EPCs培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)特征及熒光染色鑒定

2AECⅡ的培養(yǎng)與鑒定

倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)24 h，AECⅡ貼壁，呈圓形、多角形，島狀分布。培養(yǎng)2 d，細(xì)胞島狀分布典型，胞漿內(nèi)有大量反差明顯的小顆粒，細(xì)胞核明顯。堿性磷酸酶染色，藍(lán)紫色陽性細(xì)胞達(dá)75%。透射電鏡下觀察到AEC Ⅱ特征性結(jié)構(gòu)微絨毛及板層小體結(jié)構(gòu)，見圖2。

Figure 2.Characterization and identification of isolated AECⅡ. A: AECⅡ cultured for 2 d was observed under inver-ted microscope; B: AKP staining; C～D: microvilli and lamellar body were observed under transmission electron microscope.

圖2AECⅡ培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)特征及細(xì)胞鑒定

3高氧暴露對(duì)EPCs旁分泌功能的影響

ELISA法檢測(cè)顯示空氣組EPCs培養(yǎng)上清中VEGF及FGF10的水平顯著高于高氧組。ELISA法在兩組EPCs培養(yǎng)上清中均未檢測(cè)到PDGF-bb及EGF的表達(dá)，見表2。

4EPCs培養(yǎng)上清對(duì)高氧暴露下AECⅡ功能的影響

4.1EPCs培養(yǎng)上清對(duì)高氧暴露下AECⅡ細(xì)胞增殖的影響在培養(yǎng)12 h、24 h、2 d及3 d時(shí)，4組AECⅡ的細(xì)胞活力及細(xì)胞計(jì)數(shù)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與RA組相比， O2組AECⅡ的細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)；與O2組相比，O2+E-CM-RA組AECⅡ的細(xì)胞活力增高，細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)。與O2+E-CM-O2組相比，在培養(yǎng)24 h、2 d及3 d時(shí)，O2+E-CM-RA組AECⅡ的細(xì)胞活力顯著增高，細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)。O2+E-CM-O2組與O2組間AECⅡ的細(xì)胞活力和細(xì)胞數(shù)無顯著差異，見圖3及表3。

表2ELISA檢測(cè)EPCs培養(yǎng)上清中VEGF、FGF10的表達(dá)水平

Table 2.The levels of VEGF and FGF10 in EPCs CM measured by ELISA (ng/L. Mean±SD.n=3)

TreatmentVEGFFGF10Air293.62±53.74161.01±17.98Hyperoxia168.51±15.05*87.07±13.95**

*P<0.05,**P<0.01vsair group.

Figure 3.Effects of EPC-conditioned medium on the viability of AECⅡdetected by MTT assay. Mean±SD.n=3.△△P<0.01vsRA group;*P<0.05vsO2group;#P<0.05,##P<0.01vsO2+E-CM-O2group.

圖3MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EPCs培養(yǎng)上清對(duì)AECⅡ細(xì)胞活力的影響

表3細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)EPCs培養(yǎng)上清對(duì)AECⅡ細(xì)胞增殖的影響

Table 3.Effects of EPC-conditioned medium on the proliferation of AECⅡ determined by cell counting (108cells/L. Mean±SD.n=3)

Group12h24h2d3dRA3.43±0.155.02±0.095.77±0.417.67±0.45O22.87±0.45△△3.05±0.45△△3.24±0.45△△3.65±0.22△△O2+E-CM-RA3.30±0.14*4.20±0.30**#5.01±0.11**##5.27±0.21**##O2+E-CM-O22.90±0.143.47±0.294.03±0.144.26±0.24

△△P<0.01vsRA group;*P<0.05,**P<0.01vsO2group;#P<0.05,##P<0.01vsO2+E-CM-O2group.

4.24組AECⅡ中SP-C及AQP5 的mRNA表達(dá)情況在培養(yǎng)24 h、2 d及3 d時(shí)，4組AECⅡ的SP-C mRNA表達(dá)量均有顯著差異(P<0.01)。與RA組相比，O2組在培養(yǎng)24 h、2 d及3 d時(shí)，SP-C的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與O2組相比，在培養(yǎng)24 h、2 d及3 d時(shí)，O2+E-CM-RA組和O2+E-CM-O2組AECⅡ的SP-C mRNA顯著增高(P<0.05)。 與O2+E-CM-RA組相比，在培養(yǎng)24 h和2 d時(shí)，O2+E-CM-O2組AECⅡ的SP-C mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.Effects of EPC-conditioned mdeium on the mRNA expression of SP-C in AECⅡ. Mean±SD.n=3.△△P<0.01vsRA group;*P<0.05,**P<0.01vsO2group;#P<0.05vsO2+E-CM-O2group.

圖4EPCs培養(yǎng)上清對(duì)AECⅡ的SP-C mRNA表達(dá)的影響

在培養(yǎng)24 h、2 d及3 d時(shí)，4組AECⅡ中AQP5的mRNA表達(dá)量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與RA組相比，在培養(yǎng)24 h、2 d及3 d時(shí)，O2組AQP5的mRNA顯著增高(P<0.01)。與O2組相比，在培養(yǎng)2 d及3 d時(shí)，O2+E-CM-RA組和O2+E-CM-O2組AECⅡ的AQP5 mRNA顯著降低(P<0.01)。O2+E-CM-RA組和O2+E-CM-O2組間AQP5的mRNA表達(dá)無顯著差異，見圖5。

Figure 5.Effects of EPC-conditioned mdeium on the mRNA expression of AQP5 in AECⅡ. Mean±SD.n=3.△△P<0.01vsRA group;*P<0.05,**P<0.01vsO2group.

圖5EPCs培養(yǎng)上清對(duì)AECⅡ的AQP5 mRNA表達(dá)的影響

討論

早在2003年，Rehman等[7]就發(fā)現(xiàn)EPCs具有旁分泌功能，其旁分泌因子不僅能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管形成；同時(shí)也可作用于組織細(xì)胞，加速組織的損傷修復(fù)[ 8, 11, 14]。然而，迄今為止，鮮有研究報(bào)道EPCs旁分泌功能在高氧肺損傷修復(fù)方面的作用。本研究擬在體外條件下，探討高氧對(duì)EPCs旁分泌功能的影響以及EPCs旁分泌因子對(duì)高氧暴露下AECⅡ的影響。

本研究檢測(cè)了EPCs培養(yǎng)上清中促肺發(fā)育和肺損傷修復(fù)的幾種重要的生長(zhǎng)因子VEGF、EGF、HGF10及PDGF-BB。我們發(fā)現(xiàn)大鼠骨髓來源的EPCs可分泌VEGF及FGF10，這與Pula等[15]的研究結(jié)果一致。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞最有效的有絲分裂原，通過促血管生成作用從而促進(jìn)肺組織的發(fā)育[16]。FGF10表達(dá)于肺發(fā)育的整個(gè)過程中，可促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞的增殖及血管的發(fā)育[17]。有研究表明FGF10可改善高氧暴露對(duì)肺發(fā)育的阻滯[18]。本研究采用ELISA方法未檢測(cè)到EGF及PDGF-BB的表達(dá)，而Pula等[15]采用ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)人外周血來源EPCs高表達(dá)PDGF-BB；Lee等[19]采用Milliplex液相芯片檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)人臍帶血EPCs可分泌EGF、PDGF-AA、GM-CSF、IL-6等因子。這些研究結(jié)果不同可能與EPCs來源不同以及檢測(cè)技術(shù)精密性相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)高氧暴露抑制了EPCs分泌VEGF和FGF10， Baker等[9]也發(fā)現(xiàn)高氧暴露可抑制臍帶血來源EPCs的旁分泌功能，高氧暴露下，EPCs旁分泌因子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的促增殖作用明顯下降。

以往的研究表明AEC Ⅱ在原代培養(yǎng)24～96 h處于最佳狀態(tài)，此階段適合做體外實(shí)驗(yàn)研究[20]。故在實(shí)驗(yàn)中，我們采用原代培養(yǎng)第2天的細(xì)胞作為研究對(duì)象，進(jìn)行干預(yù)。我們發(fā)現(xiàn)在空氣條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，AECⅡ增殖趨緩，SP-C的mRNA表達(dá)下降，而AQP5的mRNA表達(dá)逐漸增高。AECⅡ在長(zhǎng)時(shí)間高氧暴露下增殖能力下降[12, 21]，本研究發(fā)現(xiàn)60%的高氧暴露下AECⅡ的增殖能力明顯降低；EPCs培養(yǎng)上清能改善高氧損傷，促進(jìn)AECⅡ增殖；而高氧暴露下的EPCs培養(yǎng)上清促AECⅡ增殖作用明顯降低。這可能與EPCs培養(yǎng)上清中VEGF及FGF10等肺組織發(fā)育相關(guān)的生長(zhǎng)因子濃度相關(guān)[22-23]。Baker等[9]也發(fā)現(xiàn)臍帶血來源EPCs的旁分泌因子可促進(jìn)高氧暴露下AECⅡ的增殖。

體外培養(yǎng)的AECⅡ具有向AECⅠ轉(zhuǎn)分化的特性[24]，高表達(dá)的SP-C是AECⅡ的特異性表型，高表達(dá)AQP5是AECⅠ的特異性表型[25-26]，SP-C和AQP5的檢測(cè)可以作為這2種細(xì)胞分化的標(biāo)志。我們的研究發(fā)現(xiàn)高氧暴露使AECⅡ的 SP-C mRNA表達(dá)量下降，失去AECⅡ表型，而AQP5 mRNA表達(dá)量均大幅上升，逐漸向AECⅠ轉(zhuǎn)分化。這與Lu等[27]的研究結(jié)果相似，Lu等發(fā)現(xiàn)90%的氧濃度條件可下調(diào)AECⅡ SP-C的mRNA表達(dá)量，上調(diào)AQP5的mRNA表達(dá)量，促進(jìn)AECⅡ分化。我們的研究還發(fā)現(xiàn)EPCs培養(yǎng)上清可維持高氧暴露下AECⅡ SP-C的mRNA高表達(dá)，抑制AQP5的mRNA表達(dá)，抑制高氧暴露下AECⅡ向AECⅠ分化；而高氧暴露部分削弱了EPCs培養(yǎng)上清的這種作用。這可能是高氧暴露抑制了EPCs分泌VEGF及FGF10的能力，從而削弱了EPCs培養(yǎng)上清維持ACEⅡ本身特性的能力。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓來源的EPCs可分泌VEGF、FGF10等肺發(fā)育相關(guān)生長(zhǎng)因子，而高氧暴露損害了EPCs的旁分泌功能，抑制VEGF和FGF10表達(dá)。高氧暴露可抑制AECⅡ的增殖，促進(jìn)AECⅡ向AECⅠ分化。EPCs培養(yǎng)上清能夠改善高氧暴露下AECⅡ增殖，維持AECⅡ本身特性，抑制AECⅡ向AECⅠ分化。而高氧暴露部分性削弱了EPCs培養(yǎng)上清的這種作用，這可能與高氧暴露損害EPCs的旁分泌功能，抑制肺發(fā)育相關(guān)因子VEGF和FGF10的表達(dá)相關(guān)。本研究存在以下不足之處，由于不同來源EPCs旁分泌功能存在差異加之EPCs旁分泌成分復(fù)雜，因此骨髓來源EPCs的旁分泌功能還有待蛋白芯片技術(shù)的進(jìn)一步檢測(cè)。

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

Effects of endothelial progenitor cell-conditioned medium on proliferation and differentiation of type Ⅱ alveolar epithelial cells exposed to hyperoxia

WANG Chuan-kai, LU Ai-zhen, QI Yuan-yuan, QIAN Li-ling

(Children’sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102,China.E-mail:llqian@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of hyperoxia exposure on the paracrine function of endothelial progenitor cells (EPCs), and to explore the effects of paracrine factors of EPCs on the proliferation and differentiation of type Ⅱ alveolar epithelial cells (AECⅡ) exposed to hyperoxia. METHODS: Bone marrow-derived mononuclear cells were isolated and cultured in EGM-2MV medium for 7～10 d to obtain and identify EPCs. EPCs were cultured in room air (RA) or 60% O2. The normoxia EPC-conditioned medium (E-CM-RA) and hyperoxia EPC-conditioned medium (E-CM-O2) were collected. The levels of VEGF, FGF10, PDGF-BB and EGF in E-CM-RA and E-CM-O2 were detected by ELISA. AECⅡ from adult rats were isolated, purified and cultured for 2 d, then divided into RA group, O2 group, O2+E-CM-RA group and O2+E-CM-O2 group. The proliferation of AECⅡ was detected by MTT assay and cell counting. The mRNA expression of SP-C and AQP5 was quantified by real-time PCR. RESULTS: The expression of VEGF and FGF10 in E-CM-O2 group decreased significantly compared with E-CM-RA group (P<0.01). There were significant differences in AECⅡ viability and number among the 4 groups at 12 h, 24 h, 2 d and 3 d (P<0.01). Compared with RA group, AECⅡ viability and number in O2 group decreased significantly at 12 h, 24 h, 2 d and 3 d (P<0.05). The AECⅡ viability and number in O2+E-CM-RA group were significantly higher than those in O2 group at 12 h, 24 h, 2 d and 3 d (P<0.05). However, no significant difference in AECⅡ viability and number between O2+E-CM-O2 group and O2 group at 12 h, 2 d and 3 d was observed. There were significant differences in the mRNA expression of SP-C and AQP5 in the 4 groups at 24 h, 2 d and 3 d (P<0.01). Compared with RA group, the mRNA expression of SP-C in O2 group was significantly inhibited (P<0.01), but the mRNA expression of AQP5 was promoted (P<0.01) at 24 h, 2 d and 3 d. Compared with O2 group, the mRNA level of SP-C in O2+E-CM-RA group and O2+E-CM-O2 group (P<0.05) at 24 h, 2 d and 3 d was increased, and the mRNA expression of AQP5 (P<0.01) at 2 d and 3 d was inhibited.CONCLUSION: EPCs secrete VEGF and FGF10, and hyperoxia impairs this paracrine function. Hyperoxia exposure inhibits AECⅡ proliferation and the mRNA expression of SP-C, but promotes the mRNA expression of AQP5. EPC-conditioned medium improves the proliferation of hyperoxia-exposed AECⅡ, and inhibits the transformation of AECⅡ. Hyperoxia exposure impairs the paracrine function of EPCs, and weakened the effects of E-CM-O2 on AECⅡ.

[KEY WORDS]Endothelial progenitor cells; Paracrine; Type Ⅱ alveolar epithelial cells; Hyperoxia injury

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)01- 0008- 07

[收稿日期]2015- 08- 18[修回日期] 2015- 12- 04

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81270727)

通訊作者△Tel: 021-64931916； E-mail： llqian@126.com

[中圖分類號(hào)]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.002