鄭　磊，付幫澤，解　華，常　宏，郭淑貞，王　偉

甘草酸和甘草次酸對H9c2鼠心肌細胞活性氧水平的影響

鄭磊，付幫澤，解華，常宏，郭淑貞，王偉

北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(北京 100029)，E-mail：rami2011@163．com

摘要：目的探索甘草酸和甘草次酸對H9c2鼠心肌細胞的活性氧(ROS)水平的影響。方法實驗對象是H9c2鼠心肌細胞。第一步通過3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)方法探索甘草酸和甘草次酸的毒性。第二步是用乙酰乙酸雙氯熒光素(DCFH-DA)法，在激光共聚焦顯微鏡下檢測活性氧水平。結(jié)果最大濃度10-1μg/μL甘草次酸具有顯著的毒性(P<0．01)，各濃度甘草酸均無顯著毒性。10-6～10-1μg/μL甘草酸、10-6～10-2μg/μL甘草次酸均具有顯著的促增殖作用(P<0．01)。10-5mol/L血管緊張素Ⅱ可以顯著升高細胞內(nèi)活性氧水平(P<0．01)。10-6μg/μL甘草酸和甘草次酸均可以顯著降低血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的活性氧水平(P<0．01)，其作用強度與陽性對照夾竹桃素相近(P>0．05)。結(jié)論降低細胞內(nèi)活性氧水平可能是甘草酸和甘草次酸緩解心衰的效應(yīng)機制之一，而甘草酸和甘草次酸可能是甘草干預(yù)心衰的重要效應(yīng)成分。

關(guān)鍵詞：心衰；甘草酸；甘草次酸；活性氧；血管緊張素Ⅱ；心肌細胞

心力衰竭是冠心病、高血壓、瓣膜病、心肌炎等多種心血管疾病的終末階段，是世界性的醫(yī)療衛(wèi)生難題。中國心血管病報告2014顯示[1]，中國心血管病患病率處于持續(xù)上升階段。目前，全國有心血管病病人約2．9億，其中心力衰竭病人450萬，人群慢性心力衰竭患病率為0．9%。氧化應(yīng)激被認為是心力衰竭的重要發(fā)病機制之一，并可能成為心衰治療的重要干預(yù)環(huán)節(jié)。經(jīng)典的氧化應(yīng)激被定義為活性氧(包括超氧自由基、過氧化氫、羥自由基等)的內(nèi)源性生成和細胞內(nèi)潛在的抗氧化能力(包括過氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和硫氧還原蛋白等)之間的平衡破壞，而ROS參與了包括心肌細胞凋亡、成纖維細胞增生、膠原代謝平衡失調(diào)等多個導(dǎo)致心力衰竭的心室重構(gòu)關(guān)鍵的病理進程[2]。甘草具有補脾益氣、祛痰止咳、緩急止痛、清熱解毒、調(diào)和諸藥等功效，在心力衰竭的中醫(yī)藥治療中應(yīng)用廣泛。其所含主要藥理學(xué)活性物質(zhì)是甘草酸(glycyrrhizic acid，GCA)及其鹽，以及在體內(nèi)主要的水解活性成分甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)和甘草黃酮等成分[3]。現(xiàn)代研究證實，甘草酸和甘草次酸都具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、保護肝細胞等作用[4-5]。課題組前期采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)，甘草酸和甘草次酸可能具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的作用，本研究擬以H9c2大鼠心肌細胞為研究對象，探索甘草酸和甘草次酸對ROS的影響，初步揭示甘草在干預(yù)慢性心力衰竭中的效應(yīng)成分及效應(yīng)機制。

1材料與方法

1．1材料

1．1．1細胞培養(yǎng)及傳代胎牛血清(四季青，優(yōu)級胎牛血清，100 mL，140628)，雙抗生素(青霉素+鏈霉素)，谷氨酰胺，DMEM，胰酶，PBS磷酸鹽緩沖液。96孔板(CosTAR，3599)，25 cm2培養(yǎng)瓶，激光共聚焦小皿。

1．1．2藥品甘草酸(普菲德，批號：131201，HPLC≥98%)，甘草次酸(普菲德，批號：130611，HPLC≥98%)。DMSO(SIGMA，D2650，100 mL)，MTT(Sigma，Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide，M5655-500MG)。乙酰乙酸雙氯熒光素(Invitrogen molecular probes，D99，1072945，DCFH-DA)，夾竹桃素(Santa cruz，sc-203321，APO)，血管緊張素Ⅱ(Sigma，A9525-10mg，SLBJ0358V，AngⅡ)。

1．1．3儀器培養(yǎng)箱(Thermo，3111，F(xiàn)orma Series Water Jacket) 37℃ 5% CO2。震蕩器(Qilinbeier，TS-100)。酶標(biāo)儀(KHB，ST-360)。激光共聚焦顯微鏡(OLYMPUS，F(xiàn)V1000)。倒置顯微鏡(OLYMPUS，CKX41SF)。

1．2H9c2鼠心肌細胞培養(yǎng)本研究所用H9c2鼠心肌細胞從北京協(xié)和醫(yī)院購買，采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。

1．33-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法采用此方法探索甘草酸和甘草次酸的毒性與其對細胞生長的影響，用以協(xié)助確定甘草酸、甘草次酸干預(yù)ROS的最佳藥物濃度。甘草酸和甘草次酸用DMSO溶解，制成0．1 mg/μL的儲液。實驗分組：空白組，DMSO溶劑對照組(DMSO終濃度為0．1%，等同于本實驗所設(shè)計的最高藥物濃度組的DMSO終濃度)以及不同濃度梯度的藥物組。H9c2鼠心肌細胞培養(yǎng)至80%融合，以0．05%胰酶消化，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，以5 000個細胞/孔的密度種于96孔板上，細胞貼壁24 h之后更換為無血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后吸出培養(yǎng)液，加入含有不同濃度梯度的甘草酸和甘草次酸的無血清DMEM(儲液倍比稀釋所得)，使得DMEM內(nèi)藥物終濃度為10-6μg/μL～10-1μg/μL。48 h之后，吸出液體，加入100 μL含有MTT的無血清DMEM。在37℃下孵育4 h。小心的吸出液體，加入150 μL DMSO。振蕩器上震蕩15 min之后，在酶標(biāo)儀上檢測OD值。

1．4乙酰乙酸雙氯熒光素(DCFH-DA)法

1．4．1血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)ROS升高模型用本方法探索不同濃度的Ang Ⅱ?qū)毎麅?nèi)ROS水平的影響，用于篩選和建立Ang Ⅱ誘導(dǎo)ROS升高的細胞模型。實驗分組為：空白組、10-7～10-5mol/L Ang Ⅱ模型組。選取對數(shù)生長期的H9c2心肌細胞，用含10%胎牛血清的DMEM懸浮，密度為50 000個/mL。接種1 mL于直徑20 mm的激光共聚焦小皿中。培養(yǎng)24 h之后，更換為無血清DMEM。再培養(yǎng)24 h之后，于模型組內(nèi)加入(10-7～10-5)mol/L Ang Ⅱ。培養(yǎng)24 h之后，用乙酰乙酸雙氯熒光素(DCFH-DA)法測定H9c2心肌細胞內(nèi)活性氧水平：1 mL PBS沖洗2遍H9c2心肌細胞，加入DCFH-DA 10 μmol/L，每皿加100 μL，37 ℃孵育30 min，再用PBS沖洗2遍。在激光共聚焦顯微鏡下隨機選取5個不重復(fù)區(qū)域進行攝片，用ImageJ1．48軟件分析5個視野綠色熒光強度的平均值，再對每組的樣本進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1．4．2藥物對血管緊張素Ⅱ模型的影響用本方法探索甘草酸和甘草次酸對Ang Ⅱ建立的ROS模型的影響。實驗分組：空白組、Ang Ⅱ模型組、甘草酸組(血管緊張素Ⅱ+甘草酸)、甘草次酸組(血管緊張素Ⅱ+甘草次酸)、陽性對照組(血管緊張素Ⅱ+夾竹桃素)。培養(yǎng)24 h之后，更換為無血清DMEM。再培養(yǎng)24 h之后，陽性對照組加入夾竹桃素100 μmol/L，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。之后，所有樣品用PBS沖洗2遍。模型組加入含Ang Ⅱ的無血清DMEM，藥物組加入含Ang Ⅱ和甘草酸或甘草次酸的無血清DMEM(藥物濃度參考MTT法的結(jié)果確定)，空白組加入無血清DMEM。培養(yǎng)24 h之后，用乙酰乙酸雙氯熒光素(DCFH-DA)法測定H9c2心肌細胞內(nèi)活性氧水平。

2結(jié)果

2．1甘草酸、甘草次酸的細胞毒性和促增殖作用

2．1．1甘草酸的細胞毒性對比空白對照組和溶劑對照組的數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)0．1%濃度的DMSO，無明顯的細胞毒性(P>0．05)；甘草酸在本實驗的最高濃度(0．1 μg/μL)及其他稀釋濃度，均未發(fā)現(xiàn)有明顯的毒性。

2．1．2甘草酸對細胞的促增殖作用甘草酸在10-6～10-1μg/μL的濃度，有明顯促增殖作用(P<0．01)，不同濃度間無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0．05)。10-9～10-7μg/μL甘草酸組OD值與對照組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0．05)。詳見圖1。

與空白對照組比較，1)P<0．01。

2．1．3甘草次酸的細胞毒性對比空白對照組和溶劑對照組數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)1‰濃度DMSO，無明顯細胞毒性(P>0．05)。0．1 μg/μL甘草次酸組OD值顯著低于空白及溶劑對照組(P<0．01)，表明該濃度具細胞毒性，其余稀釋濃度未見到有明顯的毒性。

2．1．4甘草次酸的促增殖作用在10-5μg/μL～10-2

μg/μL的濃度區(qū)間，OD值均顯著高于空白對照組(P<0．01)，10-6μg/μL甘草次酸OD值顯著高于空白對照組(P<0．05)，提示甘草次酸在10-6～10-2μg/μL的濃度范圍內(nèi)具有一定的促增殖作用，而且各濃度組間無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0．05)。10-9～10-7μg/μL甘草次酸組OD值與空白對照組比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0．05)。詳見圖2。

與空白對照組比較，1)P<0．05，2)P<0．01。

圖2MTT法檢測甘草次酸的細胞毒性及促增殖作用

2．2甘草酸、甘草次酸對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的H9c2鼠心肌細胞活性氧的影響

2．2．1不同濃度的血管緊張素Ⅱ?qū)9c2鼠心肌細胞活性氧的影響與空白對照組相比，10-5mol/L Ang Ⅱ組可以顯著的升高細胞內(nèi)ROS水平(P<0．01)，而10-6mol/L、10-7mol/L Ang Ⅱ組對ROS無顯著影響(P>0．05)。詳見圖3、圖4。

圖3　不同濃度的Ang Ⅱ?qū)9c2鼠心肌細胞活性氧的影響(共聚焦圖片)

與空白對照組比較，1)P<0．05。

圖4 Ang Ⅱ誘導(dǎo)ROS升高的模型探索

2．2．2甘草酸、甘草次酸對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的H9c2鼠心肌細胞活性氧的影響與空白對照組相比，Ang Ⅱ可以顯著升高細胞內(nèi)ROS水平(P<0．01)；與AngⅡ造模組相比，甘草酸、甘草次酸可以顯著降低

細胞內(nèi)ROS水平(P<0．01)，作用與陽性對照夾竹桃素組相近(P>0．05)。表明甘草酸和甘草次酸均可以顯著的降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細胞內(nèi)ROS水平。詳見圖5、圖6。

圖5　甘草酸、甘草次酸對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9c2鼠心肌細胞活性氧的影響(共聚焦圖片)

與空白對照組比較，1)P<0．01；與模型組比較，2)P<0．01。

3討論

本研究以H9c2細胞為研究載體，未發(fā)現(xiàn)甘草酸具有明顯的毒性，同劑量的甘草次酸毒性卻很明顯。這與李錦[6]、曹珊[7]分別在基因毒性和小鼠口服所得的結(jié)論基本一致。甘草次酸為甘草酸類藥物經(jīng)過體內(nèi)代謝的產(chǎn)物，是甘草酸類藥物的真正藥用成分。健康人長期大量服用甘草次酸能引起血壓增高、水鈉潴留和鉀離子的排出，尿內(nèi)鈉/鉀的比例稍有降低，這種作用與醛固酮相似[5]。正是由于甘草次酸在臨床上的毒副反應(yīng)限制了其在市場和臨床上的廣泛應(yīng)用，在使用的過程中必須同時充分考慮其安全范圍。

根據(jù)毒性試驗的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)甘草酸和甘草次酸在10-6μg/μL時具有促增殖作用的最低濃度，且與其他較高劑量組無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是甘草酸、甘草次酸發(fā)揮心肌細胞保護作用的最低劑量，因此選擇10-6μg/μL作為活性氧檢測的給藥濃度。

心臟是機體攝氧率最高的器官，抗氧化能力差，自由基容易損害心肌細胞。研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭病人血漿和心包液中氧自由基增多，且氧自由基與心力衰竭的嚴重程度成正比[8]。ROS的功能可作為第二信使參與多種氧化還原信號通路的調(diào)節(jié)，在細胞生長分化、血管形成和血管緊張度的調(diào)控等方面起著重要作用，但是ROS的大量堆積可促發(fā)細胞氧化應(yīng)激、鈣超載、能量耗竭，并啟動細胞凋亡和壞死[9]，降低ROS水平被認為是干預(yù)心力衰竭的新策略，但以ROS清除為手段的抗氧化治療方案，因在大規(guī)模臨床試驗中不能降低，甚或增加了損害而遭到嚴重質(zhì)疑[10]。因此，特異性抑制ROS相關(guān)的氧化酶及其通路是目前的研究熱點。

NADPH氧化酶活性增加是終末期心衰病人心臟氧化應(yīng)激最重要的來源之一。Ang Ⅱ是一類強效的NADPH氧化酶激活劑，通過刺激AT1R作用于NADPH氧化酶使體內(nèi)血管ROS升高。Ang Ⅱ可通過ROS誘導(dǎo)由CaMKⅡ通路介導(dǎo)的心臟衰竭[11]。本實驗表明，10-5mol/L的AngⅡ可以顯著升高H9c2心肌細胞ROS水平。同時，發(fā)現(xiàn)10-6μg/μL甘草酸和甘草次酸均可顯著的降低，由Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細胞內(nèi)ROS水平的升高。抑制心肌細胞內(nèi)過度的氧化應(yīng)激可能是甘草干預(yù)心衰的主要效應(yīng)環(huán)節(jié)之一，而甘草酸和甘草次酸均可能是甘草調(diào)控氧化應(yīng)激的重要效應(yīng)成分。

借鑒網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法初步發(fā)現(xiàn)，甘草酸、甘草次酸的抗氧化作用可能與特異性抑制NADPH氧化酶的活性有關(guān)。為了進一步闡明甘草酸和甘草次酸作用的關(guān)鍵氧化酶或通路，需要進一步的細胞實驗分析及動物實驗佐證，進而為開發(fā)特異性的抗氧化藥物用于心衰的治療提供實驗依據(jù)。

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(本文編輯王雅潔)

Effects of Glycyrrhizic Acid and Glycyrrhetinic Acid on the Levels of Reactive Oxygen Species in H9c2 Cell Line

Zheng Lei，F(xiàn)u Bangze，Xie Hua，Chang Hong，Guo Shuzhen，Wang Wei

School of Preclinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China

Abstract：ObjectiveThis research was to find the effect of glycyrrhizic acid(GCA) and glycyrrhetinic acid(GA) on reactive oxygen species(ROS) in H9c2 cell line． MethodsThe experimental subject was H9c2 cell line． First，the toxicity of GCA and GA were explored by MTT． Second，the ROS level under laser scanning confocal microscope was tested by DCFH-DA． ResultsThe toxicity of GA was found in the maximum concentration (10-1μg/μL)． The toxicity of GCA was not found in all the concentration ranges． Both of the drugs were able to improve the growth of the cell line in certain concentration ranges (GCA：10-6μg/μL to 10-1μg/μL，GA：10-6μg/μL to 10-2μg/μL) (P<0．01)． We can find that the ROS level was increased by 10-5mol/L angiotensin Ⅱ(P<0．01)． In the concentration of 10-6μg/μL，GCA and GA were able to decrease the ROS，rising by angiotensin Ⅱ to control group level(P>0．05)． The effect of GCA and GA were similar with the Apocynin(P>0．05)． ConclusionGCA and GA relieve the heart failure，which may depend on the decreasing of ROS level． GCA and GA may be the essential ingredients of glycyrrhiza in the intervention for heart failure．

Key words：heart failure；glycyrrhizic acid；glycyrrhetinic acid；reactive oxygen species；angiotensin Ⅱ；cardiom yocytes

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年項目(No.81403319)；重大新藥創(chuàng)制專項(No.2012ZX09103201-011)；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃(No.NCEF-13-0692)；北京中醫(yī)藥大學(xué)杰出青年人才項目(No.2015-JYB-XYQ002)

通訊作者：郭淑貞，E-mail：guoshz@bucm．edu.cn

中圖分類號：R541R285

文獻標(biāo)識碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．01．005

文章編號：1672-1349(2016)01-0021-05

Corresponding Author：Guo Shuzhen

(收稿日期：2015-09-28)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著·