李軍輝， 于　碩， 曹　罡， 張　焱， 楊文彬

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普通外科，西安　710004；*通訊作者，E-mail:wenbinsurgery@126.com)

Rac1基因在胰腺癌組織中表達(dá)及其臨床意義

李軍輝， 于碩， 曹罡， 張焱， 楊文彬*

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普通外科，西安710004；*通訊作者，E-mail:wenbinsurgery@126.com)

摘要：目的觀察Rac1在胰腺癌組織及不同來(lái)源胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，并檢測(cè)其對(duì)癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。 方法應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)Rac1在胰腺癌組織中表達(dá)，并將癌組織按T分期進(jìn)行分組，觀察Rac1表達(dá)與病理分期之間的關(guān)系。通過RT-PCR、Western blot檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞株Rac1表達(dá)情況。用Rac1中和抗體對(duì)培養(yǎng)癌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，未干預(yù)組作為對(duì)照，通過MTT、Transwell方法檢測(cè)Rac1對(duì)細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響。 結(jié)果與正常胰腺組織(0.07±0.17)相比，隨著腫瘤分期的增加，Rac1在T1(0.37±0.08)，T2(0.47±0.07)，T3期(0.53±0.09)胰腺癌組織標(biāo)本中表達(dá)呈上升趨勢(shì)(P<0.01)。Rac1在5株細(xì)胞中均呈陽(yáng)性表達(dá)，應(yīng)用Rac1中和抗體對(duì)培養(yǎng)癌細(xì)胞干預(yù)24 h,48 h及72 h，癌細(xì)胞的增殖能力均出現(xiàn)明顯下降，其累計(jì)光密度值分別為1.49±0.07，1.53±0.03，1.55±0.04，與未加抗體組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而培養(yǎng)20 h細(xì)胞的侵襲能力也明顯降低，穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，與未加抗體組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論Rac1在胰腺癌組織中高表達(dá)，并與腫瘤的分期明顯相關(guān)。Rac1在胰腺癌細(xì)胞株中呈現(xiàn)普遍表達(dá)，可增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力。

關(guān)鍵詞：胰腺癌；Rac1；細(xì)胞增殖；細(xì)胞侵襲

胰腺癌惡性程度高，被稱為“癌中之王”，是一種嚴(yán)重影響健康和生活質(zhì)量的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。在過去20余年中，胰腺癌發(fā)病率并沒有減少趨勢(shì)，在美國(guó)，2015年新發(fā)病例為48 960例，預(yù)期死亡人數(shù)為40 560例，死亡率居全部腫瘤死亡率的第4位，其中只有約8%的患者有切除的可能性，5年生存率<6%[1,2]。目前對(duì)于胰腺癌轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制研究很多，但仍不明了。Rac1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1)，中文名也叫Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1。當(dāng)Rac1激活后，可參與肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維和黏附斑形成，促進(jìn)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重組，調(diào)節(jié)片狀偽足與絲狀偽足延伸，影響細(xì)胞的形體極化，增加細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷徙。Rac1在胃癌組織標(biāo)本中高表達(dá)，與胃癌的分化程度、預(yù)后明顯相關(guān)，可增加癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力，在頭頸部腫瘤、卵巢腫瘤中亦出現(xiàn)高表達(dá)[3]。本研究擬檢測(cè)Rac1在胰腺癌中的表達(dá)情況并觀察其與胰腺癌轉(zhuǎn)移的臨床相關(guān)性。

1材料與方法

1.1臨床資料

收集西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院2001-01～2014-12的602例胰腺癌患者病例資料，其中男性377例，女性225例，年齡(61±12)歲。選擇根治性手術(shù)并能找到病理標(biāo)本的患者72例進(jìn)行研究，正常胰腺組織標(biāo)本6例作為對(duì)照組。

1.2主要試劑

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；Rac1抗體購(gòu)自Sigma Chemical公司；MTT試劑購(gòu)自Sigma Chemical公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas Life Science公司；Transwell小室購(gòu)自Millipore公司。

1.3免疫組化檢測(cè)Rac1蛋白表達(dá)情況

標(biāo)本經(jīng)二甲苯脫蠟10 min，2次；0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；加入30 ml/L H2O2甲醇，作用10 min，以去除內(nèi)源性過氧化氫酶；0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min后，移到濕盒；將綿羊血清滴加在蓋玻片上，每孔3-4滴，放入37 ℃烤箱孵育30 min；吸去封閉液，勿洗，分別加入1∶300兔抗鼠Rac1抗體，每片加60 μl，于4 ℃過夜；0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；將1∶200生物素化的山羊抗兔IgG滴加在蓋玻片上，每片60 μl，37 ℃孵育30-40 min；0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；將即用型ABC液滴加在蓋玻片上，37 ℃孵育30 min；0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；加入DAB顯色液作用3-10 min，0.01 mol/L PBS 清洗3次，每次5 min；梯度酒精中脫水、二甲苯透明、樹膠封片。應(yīng)用Pro-Plus software(IPP)6.0圖片分析軟件，對(duì)每一個(gè)樣本切片進(jìn)行測(cè)量分析。Rac1免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)為細(xì)胞漿、細(xì)胞膜或細(xì)胞核中有黃色顆粒。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)Rac表達(dá)情況及其對(duì)癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響

選擇不同來(lái)源的胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3(人胰腺癌上皮細(xì)胞)、Panc-1(人胰腺癌上皮細(xì)胞)、AsPc-1(胰腺癌腹水轉(zhuǎn)移)、CFPAC-1(人胰腺癌肝轉(zhuǎn)移)、SW1990(人胰腺癌脾臟轉(zhuǎn)移)，使用DMEM高糖培養(yǎng)基和10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，用于檢測(cè)Rac1表達(dá)情況及下一步細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.5實(shí)時(shí)定量PCR鑒定Rac1 mRNA的表達(dá)

用Trizol法提取5株細(xì)胞的總RNA。Rac1引物設(shè)計(jì) 5′-CCC AAG CTT ATG CAG GCC ATC AAG TGT GTG-3′(forward)，5′-CGC GGA TCC CAA CAG CAG GCA TTT TCT CTT CC-3′(reverse)，逆轉(zhuǎn)錄后。PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性2 min，64 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次，最后72 ℃ 7 min延伸，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對(duì)模板進(jìn)行定量分析。

1.6Western blot檢測(cè)Rac1蛋白的表達(dá)

RIPA法裂解并提取蛋白，并用BCA分析法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳約2 h，半干轉(zhuǎn)1.5 h，然后使用含一抗的封閉液4 ℃孵育過夜。次日二抗封閉液室溫孵育2 h，洗膜，DAB顯色，照相并分析結(jié)果。

1.7MTT法檢測(cè)Rac1對(duì)癌細(xì)胞增殖能力影響

利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。于96孔培養(yǎng)板內(nèi)接種1×104個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)于全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后加入Rac1中和抗體，培養(yǎng)24，48，72 h，每孔加入MTT試劑20 μl，4 h棄去上清液，每孔加入150 μl DMSO，10 min利用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.8Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Rac1對(duì)癌細(xì)胞侵襲能力影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Panc-1細(xì)胞，以105個(gè)/ml的密度接種于24孔板中，次日給予含100 nmol/L胰蛋白酶培養(yǎng)液，48 h制備細(xì)胞懸液。將含50 μl Matrigel膠包被Transwell小室置于24孔板中，在小室膜上加入Panc-1細(xì)胞懸液100 μl，細(xì)胞數(shù)約為1×105個(gè)，小室膜下加入600 μl完全培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組加入Rac1中和抗體，37 ℃、5%CO2條件下孵育20 h，用棉簽輕輕擦去膜上細(xì)胞，膜下細(xì)胞用結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下分別計(jì)數(shù)每孔5個(gè)視野(×200)中的細(xì)胞，取其均值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1Rac1在胰腺組織標(biāo)本中的表達(dá)情況

通過免疫組化發(fā)現(xiàn)，68例患者出現(xiàn)Rac1陽(yáng)性染色，Rac1主要表達(dá)于細(xì)胞漿中，而正常胰腺組染色陰性。隨著腫瘤分期的增加，細(xì)胞胞質(zhì)中Rac1染色逐漸加深，在T3期中為片狀深染區(qū)(見圖1)。經(jīng)累計(jì)光密度分析(IOD)，正常組(0.07±0.17)，T1(0.37±0.08)，T2(0.47±0.07)，T3(0.53±0.09)，隨著腫瘤分期的增加，Rac1表達(dá)呈上升趨勢(shì)，各癌組織Rac1表達(dá)與正常胰腺組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

A.正常胰腺組織；B.T1期癌組織；C.T2期癌組織；D.T3期癌組織　　　　　與正常組相比,*P<0.05圖1　不同分期及正常胰腺組織中Rac1表達(dá)情況 (×200)Figure 1　The expression of Rac1 in different stages of pancreatic cancer and normal pancreas tissues (×200)

2.2Rac1在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞株中Rac1在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況。培養(yǎng)48 h時(shí)，可見5株癌細(xì)胞中均有Rac1表達(dá)(見圖2)。為了進(jìn)一步分析表達(dá)量的具體變化，對(duì)5株細(xì)胞的累計(jì)光密度(IOD)值與β-actin的IOD相比，得出每株癌細(xì)胞Rac1的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，Panc-1細(xì)胞中Rac1表達(dá)量最高。

圖2　不同分化程度胰腺癌細(xì)胞中Rac1 mRNA表達(dá)情況Figure 2　The expression of Rac1mRNA in different pancreatic cancer cell

為了進(jìn)一步分析5株癌細(xì)胞Rac1蛋白表達(dá)量的變化，應(yīng)用Western blot進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)5株癌細(xì)胞中均有Rac1蛋白表達(dá)，提示Rac1在癌細(xì)胞中普遍表達(dá)，對(duì)5株細(xì)胞的累計(jì)光密度(IOD)值與β-actin的IOD相比，Panc-1細(xì)胞中Rac1表達(dá)量最高(見圖3)。

圖3　不同分化程度胰腺癌細(xì)胞中Rac1蛋白表達(dá)情況Figure 3　The expression of Rac1 protein in pancreatic cancer cell lines

2.3Rac1對(duì)癌細(xì)胞增殖能力影響

應(yīng)用MTT法對(duì)Rac1中和抗體的作用濃度進(jìn)行篩選，其最佳作用濃度為1.0 μg/ml，應(yīng)用于以下實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用Rac1表達(dá)最強(qiáng)的Panc-1細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，MTT結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的增殖能力也逐漸增加，在培養(yǎng)24,48,72 h其累計(jì)光密度值分別為1.63±0.03,1.77±0.14和1.87±0.12，呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴性，而加入Rac1中和抗體后，24,48,72 h其累計(jì)光密度值分別為1.49±0.07,1.53±0.03和1.55±0.04，細(xì)胞的增值能力無(wú)明顯增加，與未加Rac1抗體組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，圖4)，提示Rac1參與了胰腺癌細(xì)胞的增殖。

與Rac1組相比，*P<0.01 圖4　Rac1對(duì)癌細(xì)胞增殖能力影響Figure 4　The effect of Rac1 on proliferation of pancreatic cancer cells

2.4Rac1對(duì)癌細(xì)胞侵襲能力影響

Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)不同濃度葡萄糖對(duì)胰腺癌細(xì)胞株侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，在上室中加入Rac1中和抗體并培養(yǎng)20 h后，細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱(見圖5)。對(duì)穿膜細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)未加抗體組穿膜細(xì)胞數(shù)為32.33±1.53，加入Rac1中和抗體的后，穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，平均為21.67±2.52，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。提示Rac1可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力的變化。

A. Rac1組　　　　　　B.Rac1+中和抗體圖5　Rac1對(duì)癌細(xì)胞侵襲能力影響Figure 5　The effect of Rac1 on invasion of pancreatic cancer cells

3討論

Rac1可通過多種方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，Rac1活化后可促進(jìn)整合素(integrin)類蛋白在細(xì)胞表面募集，并傳遞調(diào)節(jié)信號(hào)至肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，進(jìn)而誘導(dǎo)激動(dòng)蛋白微絲聚集于細(xì)胞膜，影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；可通過激活Ⅳ型膠原酶MMP4、MMP2，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲穿透能力[3]。Rac1也參與了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展，在胰腺癌中，活化的和總Rac1水平明顯升高，而p110alpha(p110α)的缺失可降低Rac1的活性和表達(dá)水平。與正常胰腺組織相比，胰腺上皮內(nèi)瘤樣變組織內(nèi)Rac1的表達(dá)亦明顯升高[4]，提示Rac1參與了胰腺癌的早期發(fā)展，但是否與胰腺癌的分期相關(guān)，目前尚不清楚。miR-124是一種腫瘤抑制基因，Rac1則是癌基因，miR-124可直接滅活Rac1，導(dǎo)致MKK4-JNK-c-Jun信號(hào)通路的失活。在胰腺癌組織中，miR-124已被沉默掉[5]。在Kras突變小鼠中，特異性敲除Pik3ca和Rac1，可預(yù)防胰腺腫瘤的形成。與正常胰腺組織相比，胰腺上皮內(nèi)瘤樣變組織中Rac1表達(dá)明顯升高[4]。本研究通過免疫組化檢測(cè)，大多數(shù)胰腺癌患者出現(xiàn)Rac1陽(yáng)性染色，隨著腫瘤分期的增加，隨著腫瘤分期的增加，Rac1表達(dá)呈上升趨勢(shì)，提示Rac1表達(dá)與腫瘤分期明顯相關(guān)。不同分化程度的胰腺癌細(xì)胞中均有Rac1蛋白及mRNA表達(dá)，提示mRac1在癌細(xì)胞中普遍表達(dá)。

在胰腺癌小鼠模型中，K-Ras基因活化導(dǎo)致腺泡-導(dǎo)管化生，并形成胰腺上皮內(nèi)瘤樣變前提損傷，而特異性敲除Rac1基因，可逆轉(zhuǎn)這一過程。抑制Rac1可阻斷G2/M細(xì)胞周期的活化[4]。在胃癌組織中Rac1表達(dá)明顯升高，并且與腫瘤分化、局部浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期以及惡性預(yù)后明顯相關(guān)[6]。胃癌細(xì)胞株中Rac1表達(dá)亦明顯升高，增加了腫瘤的生長(zhǎng)以及侵襲轉(zhuǎn)移[6]。Rac1在卵巢癌組織中高表達(dá)，并且與腫瘤的分期、復(fù)發(fā)和預(yù)后相關(guān)，下調(diào)Rac1可通過p38MAPK信號(hào)通路減少細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化及增殖能力[7]。

通過Rac1中和抗體拮抗Rac1作用后，本研究通過MTT及Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)觀察Rac1對(duì)癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，發(fā)現(xiàn)拮抗Rac1作用后，癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力均明顯下降，提示Rac1可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，但其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。綜上所述，Rac1在胰腺癌組織及細(xì)胞株中均高表達(dá)，與腫瘤分期明顯相關(guān)，并增強(qiáng)了癌細(xì)胞增殖和侵襲能力。

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The expression of Rac1 in pancreatic cancer and its clinical significance

LI Junhui, YU Shuo, CAO Gang, ZHANG Yan, YANG Wenbin*

(DepartmentofGeneralSurgery,SecondAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;*Correspondingauthor,E-mail:wenbinsurgery@126.com)

Abstract：ObjectiveTo explore the expression of Rac1 in pancreatic tissue and cancer cell line, and its effects on the biological behavior of cancer cells. MethodsThe clinical and pathological features of formalin-ixed pancreatic cancer specimens and normal pancreases were analyzed. The expression of Rac1 was examined by immunohistochemistry. The relationship between the expression of Rac1 and tumor stage was analyzed. The expression of Rac1 in pancreatic cancer cells was examined by RT-PCR and Western blot. MTT and Transwell assays were used to observe the effect of high Rac1 expression on cell proliferation and invasion ability of pancreatic cancer cells.ResultsRac1 was expressed in pancreatic cancer tissues，and the integral optical density(IOD) was 0.07±0.17，0.37±0.08，0.47±0.07，0.53±0.09 in normal tissues，tissues at stages T1，T2，T3,respectively. Rac1 expression was positively correlated with tumor stage(P<0.01).Rac1 was also expressed in pancreatic cancer cell lines and overexpressed in Panc1. When the effect of Rac1 was neutralized by neutralizing antibody of Rac1 for 24, 48, 72 h, the proliferation was gradually inhibited with IOD of 1.49±0.07，1.53±0.03，1.55±0.04, respectively(P<0.01). The migration/invasion ability was also inhibited by neutralizing antibody(P<0.05).ConclusionRac1 is highly expressed in pancreatic cancer tissues and correlated with tumor stage. The Rac1 is expressed in cancer cell lines, and may increase the proliferation and migration/invasion of cancer cells.

Key words:pancreatic cancer;Rac1;proliferation;invasion

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81472246)；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目(2013JQ4011)

作者簡(jiǎn)介：李軍輝，男，1980-02生，博士，副研究員，E-mail:ljh991049@126.com

收稿日期：2016-03-22

中圖分類號(hào)：R735.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-6611(2016)06-0522-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.06.008