顏堅(jiān)姜文浩彭細(xì)峰黎穎莉

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sEphB4抑制視網(wǎng)膜新生血管和玻璃體增殖的研究*

顏堅(jiān)①姜文浩①彭細(xì)峰①黎穎莉①

【摘要】目的：探討sEphB4抑制視網(wǎng)膜新生血管和玻璃體增殖的作用。方法：建立長期DR兔眼模型，將所有DR兔的右眼作為藥物干預(yù)眼，給予sEphB4 50 μL玻璃體腔內(nèi)注入，sEphB4的劑量依次為1000、465、160、80 μg。左眼作為對(duì)照眼，給予生理鹽水50 μL玻璃體腔注入。此干預(yù)治療持續(xù)6個(gè)月，注射1次/月。比較兩組OCT及明暗ERG干預(yù)前后的變化。結(jié)果：糖尿病兔模型FFA的滲漏減輕，糖尿病模型的OCT變厚，干預(yù)后逐漸變薄并與劑量的增加呈負(fù)相關(guān)，劑量越大OCT測(cè)量的視網(wǎng)膜厚度越薄越接近正常厚度。糖尿病兔模型ERG的aA值隨著劑量的增加逐漸降低，干預(yù)后逐漸接近正常值，并與劑量成正相關(guān)。結(jié)論：sEphB4可以抑制糖尿病視網(wǎng)膜病變兔模型的視網(wǎng)膜水腫，以及改善視網(wǎng)膜功能。

【關(guān)鍵詞】sEphB4抑制； 視網(wǎng)膜； 新生血管； 玻璃體增殖

①廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院 廣東 深圳 518116

Medical Innovation of China，2016，13（16）：139-141

First-author's address：Shenzhen City Longgang Central Hospital，Shenzhen 518116，China

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是最主要的致盲眼病之一，其有效治療是眼科基礎(chǔ)研究和臨床亟待解決的課題。因此，開展對(duì)DR發(fā)病機(jī)制方面的實(shí)驗(yàn)研究具有重要意義。內(nèi)皮細(xì)胞受體酪氨酸激酶（Endothelial cell receptor tyrosine kinases，PTKs）是血管生成的最重要的介質(zhì)之一，目前已有許多研究證實(shí)，Eph/Ephrin作為RTKs亞族中最大的一支，其家族中的EphB4/EphrinB2信號(hào)通道對(duì)于細(xì)胞的遷移、粘附和增生起著定位作用。在早產(chǎn)兒增殖性視網(wǎng)膜病變和激光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜新生血管等類似于PDR病理改變的動(dòng)物模型中，均檢測(cè)到EphB4/EphrinB2信號(hào)通道的激活及sEphB4在體外和活體中抑制脈絡(luò)膜新生血管作用明顯，且其可在體外通過抑制PDGF介導(dǎo)RPE細(xì)胞的黏附、增殖和遷移［1-2］。

同時(shí)，最新研究也表明sEphB4在高濃度狀態(tài)下對(duì)活體組織無毒性損害且其玻璃體、視網(wǎng)膜穿透能力強(qiáng)，為sEphB4可能會(huì)成為新一類的治療DR等一系列增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變提供了有利的理論支持。本文旨在通過長期DR兔眼模型，研究sEphB4對(duì)PDR中視網(wǎng)膜新生血管和玻璃體增殖的抑制的作用機(jī)理，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1主要儀器 FFA、OCT、明暗電生眼儀、全血分析、系統(tǒng)顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)（Zeiss LSM510 META Imager 21；Zeiss Laser Module Zeiss公司）、全自動(dòng)PCR 擴(kuò)增儀（Icycler BIO-RAD公司）、高速臺(tái)式離心機(jī)（5417C型，Eppendorf 公司）、真空離心系統(tǒng)（Speed Vac plus SC110A和Universal Vacuum system UVS400 SAVANT公司）、無菌超凈工作臺(tái)（Class Ⅱ B2型，NUAIRE公司）、凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)（Universal Hood Ⅱ型，BIO-RAD公司）、凝膠電泳系統(tǒng)（PowerPac 200型，BIO-RAD公司）等。

1.2方法 （1）糖尿病兔模型建立：選用8～10周的雄性兔4只，麻醉后予5%四氧嘧啶150 mg/kg耳緣靜脈注射，注射前不需禁食。麻醉恢復(fù)后予高糖高脂飲食，并在4、8和12 h皮下注射5% GS 10 mL，注射四氧嘧啶后每12小時(shí)測(cè)一次血糖直至1周得到每只兔的血糖變化曲線。對(duì)于血糖持續(xù)低于300 mg/dL的實(shí)驗(yàn)對(duì)象于1周時(shí)予第2次5%四氧嘧啶100 mg/kg靜脈注射，注射后只需持續(xù)監(jiān)測(cè)血糖，不需做特殊處理。對(duì)于連續(xù)3次晨間血糖高于350 mg/dL的實(shí)驗(yàn)對(duì)象根據(jù)血糖升高程度予胰島素皮下注射，采耳中央動(dòng)脈血1次/周及尿液24 h/次。距試驗(yàn)開始1個(gè)月時(shí)，若試驗(yàn)對(duì)象持續(xù)血糖＞300 mg/dL且血液及尿液中出現(xiàn)糖基蛋白、尿素氮、尿糖、尿蛋白升高及電解質(zhì)紊亂，則表明糖尿病兔模型建立。之后改為檢測(cè)血糖1次/周和耳中央動(dòng)脈1次/月，采血及尿液。（2）兔眼DR模型：糖尿病兔模型發(fā)展到7～8個(gè)月時(shí)，兔視網(wǎng)膜血管出現(xiàn)扭曲和擴(kuò)張，10個(gè)月左右出現(xiàn)熒光滲漏。糖尿病兔模型發(fā)展到6個(gè)月后進(jìn)行1次/月FFA、OCT、眼壓及明暗電生理檢查。12個(gè)月時(shí)將所有雙眼FFA出現(xiàn)熒光滲漏的兔選為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，至此，兔眼DR模型成功建立。（3）分組進(jìn)行玻璃體腔內(nèi)sEphB4不同劑量多次注射，將所有DR兔的右眼作為藥物干預(yù)眼給予sEphB4 50 μL玻璃體腔內(nèi)注入，sEphB4的劑量依次為1000、465、160、80 μg。左眼作為對(duì)照眼，予生理鹽水50 μL玻璃體腔注入。此干預(yù)治療持續(xù)6個(gè)月，注射1次/月。（4）視網(wǎng)膜、玻璃體增殖膜及眼球各部位樣本收集，在干預(yù)對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)將兔麻醉下予巴比妥酸鹽100 mg/kg靜脈內(nèi)注射致死后，進(jìn)行眼球摘除并實(shí)行：①全視網(wǎng)膜完整取樣：沿角鞏緣360°去除角膜，小心去除晶體，將眼球從4個(gè)象限蝴蝶狀剪開，并用4%多聚甲醛（PFA）固定45 min后，清除玻璃體，PBS清洗3次，10 min/次，顯微鏡下完整取出視網(wǎng)膜平鋪放置于OCT包埋劑中包埋，干冰凝固后保存于-80 ℃，實(shí)驗(yàn)時(shí)取出，用冰凍切片機(jī)以5 μm厚度切片。②玻璃體增殖膜，視網(wǎng)膜取樣：用上述方法固定組織后，顯微鏡下取出帶有玻璃體增殖膜的視網(wǎng)膜脫水后，放置于OCT中包埋，凝固，-80 ℃儲(chǔ)存，切片。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用PEMS 3.1統(tǒng)計(jì)軟件及Microsoft excel 2007軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

糖尿病兔模型FFA的滲漏減輕，正常組兔的OCT（122.15±7.24）μm，而糖尿病模型的OCT變厚，干預(yù)后逐漸變薄并與劑量的增加呈負(fù)相關(guān)，劑量越大，OCT測(cè)量的視網(wǎng)膜厚度越薄越接近正常厚度。ERG是客觀有效放映視網(wǎng)膜功能變化的一個(gè)敏感指標(biāo)，正常兔眼的ERG的aA值為（79.39±11.23），糖尿病兔模型ERG的aA值隨著劑量的增加逐漸降低，干預(yù)后逐漸接近正常值，并與劑量成正相關(guān)，見表1。

表1　兩組各項(xiàng)檢查指標(biāo)干預(yù)前后的變化情況（±s）

表1　兩組各項(xiàng)檢查指標(biāo)干預(yù)前后的變化情況（±s）

組別OCT μm 明暗ERG的aA值干預(yù)前　　干預(yù)6個(gè)月后　　干預(yù)前　　干預(yù)6個(gè)月后干預(yù)組（n=4）1000 μg　 177.80±15.50　122.88±15.41　60.45±13.22　79.13±10.52 465 μg　163.31±21.52　128.27±11.72　64.12±12.48　76.35±11.34 160 μg　152.20±19.57　132.27±13.38　70.34±11.32　74.24±12.03 80 μg　134.16±25.03　136.43±11.32　75.25±13.56　71.82±11.75對(duì)照組（n=4）　122.15±7.24　120.8±17.86　79.39±11.23　80.43±12.82

3　討論

長期的高血糖、多元醇、肌醇代謝異常會(huì)導(dǎo)致血液流變學(xué)改變，氧化應(yīng)激、炎癥/免疫系統(tǒng)活化，細(xì)胞因子/生長因子表達(dá)或活性改變，以致視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮損傷，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞開始增殖，血管滲漏、閉塞，缺氧的網(wǎng)膜組織釋放出血管增殖物質(zhì)，促使新生血管形成，進(jìn)而導(dǎo)致出血、機(jī)化，而發(fā)生增殖性病變，并造成極其嚴(yán)重的不良后果［3］。一系列研究證實(shí)，PTKs是血管生成的最重要的介質(zhì)之一，包括血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）受體、血管生成素（angiopoietin，Tie）受體和紅細(xì)胞生成素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞（erythropoietin-producing hepatocellular，Eph）受體。Eph受體與它的Ephrin配體一起組成了PTKs亞族中最大的一支，有14個(gè)受體和8個(gè)配體。這個(gè)家族基于序列同源性粘附于Ephrin配體，再細(xì)分為EphA和EphB兩組［2］。Eph/Ephrin調(diào)控著不同系列的細(xì)胞功能，如細(xì)胞遷移、增殖和黏附，他們對(duì)于脈管系統(tǒng)的發(fā)展也有著重要的影響［4］。已有實(shí)驗(yàn)表明，視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)EphrinB2，一個(gè)細(xì)胞外域的EphB4受體的可溶性單體形式（sEphB4），可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制受體激活，從而在總體上阻斷內(nèi)皮細(xì)胞功能和視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜的新生血管［5］。同時(shí)，基于EphB4/EphrinB2在調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、生長和遷移中起著重要作用，目前也有體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，EphrinB2 和Ephb4表達(dá)在人類視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變膜內(nèi)的細(xì)胞上。sEphB4可抑制血小板衍生生長因子介導(dǎo)RPE細(xì)胞內(nèi)的EphB4和EphrinB2磷酸化，從而抑制RPE細(xì)胞的遷移、黏附和增殖［6］。本項(xiàng)目擬采用經(jīng)典的類似于DR晚期PVR的兔眼模型，首次針對(duì)sEphB4在DR活體中抑制玻璃體增殖進(jìn)行系統(tǒng)研究。結(jié)果顯示，糖尿病兔模型OCT是變厚的，干預(yù)后逐漸變薄并與劑量的增加呈負(fù)相關(guān)，劑量越大，OCT測(cè)量的視網(wǎng)膜厚度越薄越接近正常厚度。ERG是客觀有效放映視網(wǎng)膜功能變化的一個(gè)敏感指標(biāo)，正常兔眼的ERG的aA值為（79.39±11.23），糖尿病兔模型ERG的aA值隨著劑量的增加逐漸降低，干預(yù)后逐漸接近正常值，并與劑量成正相關(guān)。最新動(dòng)物研究顯示，濃縮狀態(tài)下的sEphB4對(duì)于兔眼無毒性作用，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的兔眼眼內(nèi)壓，明暗電生理和組織病理學(xué)等方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且藥物動(dòng)力學(xué)研究展示sEphB4在視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜中的平均存留時(shí)間明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的抗VEGF藥［7-10］。但由于DR患眼中的微環(huán)境及各類因子已較正常眼發(fā)生了巨大的變化，所以對(duì)于sEphB4在DR眼中的安全性及藥物動(dòng)力學(xué)方面有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，通過對(duì)sEphB4抑制DR視網(wǎng)膜新生血管的研究，證實(shí)sEphB4在活體中具有抑制RPE細(xì)胞黏附、增殖、遷移的作用，對(duì)一系列增殖性視網(wǎng)膜病變的臨床藥物研究具有指導(dǎo)性意義［11-15］。

參考文獻(xiàn)

［1］ He S，Ding Y，Zhou J，et al.Soluble EphB4 regulates choroidal endothelial cell function and inhibits laser-induced choroidal neovascularization［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2005，46（12）：4772-4779.

［2］ He S，Kumar S R，Zhou P，et al.Soluble EphB4 inhibition of PDGF-induced RPE migration in vitro［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51（1）：543-552.

［3］ Kertesz N，Krasnoperov V，Reddy R，et al.The soluble extracellular domain of EphB4 （sEphB4） antagonizes EphB4-EphrinB2 interaction，modulates angiogenesis，and inhibits tumor growth［J］.Blood，2006，107（6）：2330-2338.

［4］ Brar M，Cheng L，Yuson R，et al.Ocular safety profile and intraocular pharmacokinetics of an antagonist of EphB4/EphrinB2 signalling［J］.Br J Ophthalmol，2010，94（12）：1668-1673.

［5］ Sonoda S，Spee C，Barron E，et al.A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells［J］.Nat Protoc，2009，4（5）：662-673.

［6］ Hinton D R，He S，Graf K，et al.Mitogen-activated protein kinase activation mediates PDGF-directed migration of RPE cells［J］.Exp Cell Res，1998，239（1）：11-15.

［7］ Agrawal R N，He S，Spee C，et al.In vivo models of proliferative vitreoretinopathy［J］.Nat Protoc，2007，2（1）：67-77.

［8］ Ehlken C，Martin G，Lange C，et al.Therapeutic interference with EphrinB2 signalling inhibits oxygen-induced angioproliferative retinopathy［J］.Acta Ophthalmol，2011，89（1）：82-90.

［9］李達(dá)，王麗麗.糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管程度與眼軸長度的關(guān)系［J］.國際眼科雜志，2016，16（2）：307-308.

［10］楊露，劉若屏，王杰，等.戴奕娟玻璃體腔內(nèi)注射Lucentis并植入Ex-press引流器及視網(wǎng)膜光凝治療新生血管性青光眼觀察［J］.中國實(shí)用眼科雜志，2016，34（2）：147-149.

［11］劉愛華，孫靖，張紅.改良的氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜病變模型及其評(píng)價(jià)［J］.中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志，2015，33（12）：1108-1112.

［12］孟麗珠，陳松，陳蕾，等.糖尿病大鼠玻璃體腔注射缺氧誘導(dǎo)因子-1α siRNA對(duì)血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達(dá)的影響［J］.國際眼科雜志，2015，15（10）：1700-1704.

［13］艾詩蓓，陳忠平.糖尿病視網(wǎng)膜病變抗新生血管藥物治療的研究進(jìn)展［J］.國際眼科縱覽，2015，52（4）：274-277.

［14］黃文志，李倩慶，高宗銀.小鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管形成中EphA2與VEGF的表達(dá)及相關(guān)性研究［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，14（10）：785-788.

［15］李曉琴，張自峰，王雨生，等.脂多糖誘導(dǎo)炎癥對(duì)大鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變的影響［J］.眼科新進(jìn)展，2015，35（4）：301-304.

The Study of sEphB4 Inhibition on Retinal Neovascularization and Vitreous Proliferation

YAN Jian，JIANG Wen-hao，PENG Xi-feng，et al

【Key words】sEphB4 inhibition； Retina； Neovascularization； Vitreous proliferation

【Abstract】Objective：To investigate the effect of sEphB4 on inhibiting the proliferation of retinal neovascularization and vitreous proliferation.Method：The long term DR rabbit eye model was established，the right eyes of all DR rabbits were treated as drug intervention which 50 μL sEphB4 was injected into the vitreous cavity，the dose of sEphB4 was respectively 1000，465，160 and 80 μg.Left eyes as the control eyes，they were given the physiological saline 50μL vitreous cavity injection. This intervention treatment lasted 6 months，1 time a month injection.The changes of OCT and ERG before and after the intervention of two groups were compared. Result：The FFA leakage of the diabetic rabbit model reduced，diabetic model of OCT thickened，after the intervention becomes thin and with dose increasing negative correlation，with the increase of concentration，measured by OCT retinal thickness of the thinner closer to normal thickness.Diabetic rabbit model of ERG aA values gradually decreased with the increase of the dose，after the intervention of gradually close to normal value， and is positively correlated with the dose.Conclusion：sEphB4 can inhibit the retinal edema in rabbit model of diabetic retinopathy，and improve the function of the retina.

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.16.039

*基金項(xiàng)目：深圳市科技研發(fā)資金資助項(xiàng)目（JCYJ20150403091931178）

通信作者：顏堅(jiān)

收稿日期：（2016-02-01） （本文編輯：周亞杰）