蔣朝暉， 馬千里， 陳　俊， 張　潔， 余紅嵐

(貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 貴州 貴陽(yáng)　550002)

中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽(yáng)性對(duì)照品設(shè)計(jì)*

蔣朝暉， 馬千里， 陳俊， 張潔， 余紅嵐*

(貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 貴州 貴陽(yáng)550002)

[摘要]目的： 探討EDTA-K2抗凝外周血作為中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶(NAP)染色陽(yáng)性對(duì)照的可能性。方法： 選取EDTA抗凝的NAP積分正常外周靜脈血及NAP積分明顯升高外周血，各制成200張血片，分為積分正常組和積分升高組，這兩組又再分為不固定組和固定組(用10%甲醛—甲醇固定)；每隔5 d每組取10張血片進(jìn)行NAP染色，共計(jì)50 d染色10次，比較各組NAP陽(yáng)性率及積分。結(jié)果： 每組血片中NAP活性隨著時(shí)間推移而減弱，積分明顯升高的外周血NAP活性能維持到40 d，10%甲醛-甲醇固定的血片酶活性下降相對(duì)緩慢。結(jié)論： 選用NAP積分明顯升高的外周血，經(jīng)10%甲醛-甲醇固定后可作為NAP染色的陽(yáng)性對(duì)照，其有效期約為40 d。

[關(guān)鍵詞]堿性磷酸酶； 粒細(xì)胞； 染色與標(biāo)記； 細(xì)菌感染； 血細(xì)胞； 質(zhì)量控制

中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶(neutrophil alkaline phosphatase staining， NAP)染色積分及陽(yáng)性率的變化,對(duì)慢粒與類(lèi)白、再障與陣發(fā)性血紅蛋白尿、細(xì)菌與病毒感染的鑒別診斷、淋巴瘤病理分型及預(yù)后具有重要的意義[1-2]。由于NAP染色實(shí)驗(yàn)過(guò)程受到試劑有效期、環(huán)境溫度、細(xì)胞數(shù)量及孵育時(shí)間等各種因素的影響，染色質(zhì)量控制尤為重要。有學(xué)者提出NAP染色時(shí)可以選擇前1～2 d骨髓檢查無(wú)明顯改變和無(wú)臨床可疑血液病的標(biāo)本作為質(zhì)控對(duì)照，或選擇骨髓網(wǎng)狀細(xì)胞、網(wǎng)狀纖維及骨髓小粒內(nèi)支架成分作為監(jiān)控對(duì)象[3]。但這些質(zhì)控對(duì)照標(biāo)本一般難以獲得，且隨機(jī)性較大，不利于實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)化操作。本研究利用自制的兩種抗凝外周血片作為NAP染色的陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)不同方式處理,摸索該陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本的保存時(shí)間及保存條件，探討其作為NAP染色陽(yáng)性對(duì)照的可行性。

1材料與方法

1.1材料

所有標(biāo)本均來(lái)源于門(mén)診病例中NAP積分正常及細(xì)菌感染導(dǎo)致NAP積分明顯升高的EDTA-K2抗凝外周血，采用中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色液(NAP)套組(試劑Kaplow偶氮偶聯(lián)法，珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1血片制備選取NAP積分正常及細(xì)菌感染導(dǎo)致NAP積分明顯升高的EDTA-K2抗凝血各3 mL。NAP積分正常組白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)為(9.2±0.3)×109/L，中性桿狀粒細(xì)胞+中性分葉粒細(xì)胞占70%，NAP陽(yáng)性率42%，積分58分；NAP積分明顯升高組WBC 為(25.3±1.2)×109/L，中性桿狀粒細(xì)胞+中性分葉粒細(xì)胞占86%，NAP陽(yáng)性率80%，積分120分。所有血液標(biāo)本分別制成200張血片，分為NAP積分正常組和NAP積分升高組，NAP積分正常組和NAP積分升高組又再分為不固定組和固定組(用10%甲醛—甲醇固定)，每隔5 d每組取10張血涂片進(jìn)行NAP染色，共計(jì)50 d染色10次。比較4組涂片的NAP陽(yáng)性率和積分的變化。

1.2.2NAP染色染色步驟嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明，血片干燥后，滴加固定液0.5 min，蒸餾水沖洗，甩干；滴加(偶氮、亞硝酸鈉、磷酸萘酚AS-BI)工作液處理15 min，蒸餾水沖洗，甩干，核固紅復(fù)染1～2 min，干燥后鏡檢。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：(-)為0分，細(xì)胞漿中無(wú)陽(yáng)性染色顆粒；(+)為1分，細(xì)胞漿中含少量顆粒或呈彌漫淺藍(lán)色；(++)為2分，細(xì)胞漿中含中等量顆?；驈浡{(lán)色；(+++)為3分，細(xì)胞漿中含較多顆?；虺蕪浡^深藍(lán)色；(++++)為4分，細(xì)胞漿中充滿(mǎn)粗大顆?；虺蕪浡钏{(lán)色。每張血片計(jì)數(shù)100個(gè)中性桿狀及分葉粒細(xì)胞，記錄其陽(yáng)性率及積分。

1.2.3驗(yàn)證EDTA-K2抗凝劑對(duì)NAP活性的影響選取血常規(guī)檢測(cè)正常的血標(biāo)本10例，利用穿刺針軟管內(nèi)殘留的血液制作EDTA抗凝血片和不抗凝血片，干燥后立即NAP染色，觀察并比較EDTA-K2抗凝劑對(duì)血片NAP陽(yáng)性率及積分的影響。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

NAP陽(yáng)性率及積分采用例數(shù)或百分比(%)表示，組間比較采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)，多組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)及圖表制作使用Excel 2007軟件完成。

2結(jié)果

2.1EDTA-K2抗凝劑對(duì)NAP活性的影響

通過(guò)比較10例抗凝及不抗凝靜脈血NAP染色發(fā)現(xiàn)，不抗凝血片的積分明顯高于抗凝血片差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但NAP陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示抗凝劑EDTA-K2影響NAP積分，但不影響陽(yáng)性率，見(jiàn)表1。

表1　EDTA-K2抗凝劑對(duì)NAP染色陽(yáng)性率及積分的影響

2.2NAP酶活性與染色時(shí)間的關(guān)系

NAP染色結(jié)果顯示，NAP積分正常組NAP酶的活性快速喪失，第20天時(shí)固定組無(wú)強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞、未固定組偶見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞； NAP積分升高組中，NAP酶活性下降相對(duì)較慢，在40 d內(nèi)其陽(yáng)性率無(wú)明顯變化，積分略有下降，固定組明顯優(yōu)于未固定組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：A、B分別為積分正常組陽(yáng)性率和積分；C、D分別為積分升高組陽(yáng)性率和積分圖1　不同處理方式的外周血片NAP染色陽(yáng)性率和積分Fig.1　Positive rate and scores of peripheral blood pieces with different treatment

3討論

NAP作為一種重要的細(xì)胞化學(xué)染色，染色積分及陽(yáng)性率的變化對(duì)慢粒與類(lèi)白、再障與陣發(fā)性血紅蛋白尿、細(xì)菌與病毒感染的鑒別診斷的鑒別診斷、淋巴瘤病理分型及預(yù)后具有重要的意義[1-2]。曹宇[4]、周建中[5]探討了NAP染色的實(shí)驗(yàn)條件，但目前對(duì)于該實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制則少有報(bào)道?！杜R床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》第4版與第3版關(guān)于NAP染色的標(biāo)準(zhǔn)操作改動(dòng)較大，第3版及相關(guān)試劑說(shuō)明書(shū)指出，NAP染色只能用不抗凝的靜脈血或皮膚穿刺血測(cè)定，每次染色應(yīng)有陽(yáng)性對(duì)照[6]，而第4版對(duì)于標(biāo)本是否抗凝沒(méi)有明確要求，并且新提出了使用骨髓細(xì)胞作為質(zhì)控對(duì)照。鑒于骨髓細(xì)胞難以獲得，不利于NAP染色操作的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化，本研究采用兩種自制的外周EDTA-K2抗凝外周血制成血片NAP染色作為陽(yáng)性對(duì)照，摸索其保存條件及有效期，初步建立NAP染色的陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)控體系的可能性。由于不抗凝血取材、推片存在諸多不便，部分文獻(xiàn)報(bào)道可以采用抗凝血代替新鮮血進(jìn)行NAP染色[7-8]。由于在是否采用新鮮血問(wèn)題上存在分歧，本研究首先驗(yàn)證EDTA-K2抗凝劑對(duì)于NAP活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EDTA-K2能輕度抑制NAP的活性，但其陽(yáng)性率無(wú)明顯變化。因此，可采用EDTA-K2抗凝外周血大批量制作NAP染色的陽(yáng)性對(duì)照血片。

曾小菁等[9]指出NAP酶的活性會(huì)隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低，如不能及時(shí)染色的標(biāo)本，經(jīng)固定后，一般在1周內(nèi)進(jìn)行染色。但如果NAP染色的陽(yáng)性對(duì)照血片沒(méi)有較長(zhǎng)的有效期，將導(dǎo)致每次都需臨時(shí)制作陽(yáng)性血片，操作繁瑣，不利于在臨床應(yīng)用。因此，摸索陽(yáng)性對(duì)照血片最佳保存條件，盡可能延長(zhǎng)其效期，是建立NAP染色質(zhì)控體系的重要環(huán)節(jié)。本研究結(jié)果表明，因細(xì)菌感染導(dǎo)致NAP積分明顯升高的外周血比較正常NAP積分的外周血，其酶活性衰減時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)，如果用10%甲醛—甲醇固定上述外周血片，其酶活性將持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間達(dá)到40 d左右。40 d的時(shí)間對(duì)于成熟的質(zhì)控品而言，效期不算長(zhǎng)，達(dá)不到商品化及臨床應(yīng)用的要求。但陳敬文等[10]研究發(fā)現(xiàn)采用醇性固定劑可對(duì)NAP的固定效果及顯示有所改善，下一步將會(huì)關(guān)注固定液的選擇。同時(shí)，本研究中陽(yáng)性對(duì)照血片保存條件為20 ℃左右的室內(nèi)環(huán)境，低溫環(huán)境(-20 ℃、-70 ℃)是否能延長(zhǎng)效期有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，選用NAP積分明顯升高的外周血經(jīng)10%甲醛-甲醇固定后作為NAP染色的陽(yáng)性對(duì)照，其有效期約為40 d，如何延長(zhǎng)其效期有待進(jìn)一步研究。

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(2016-03-23收稿，2016-05-28修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉華

A Preliminary Study on the Design of Positive Control of Neutrophils Alkaline Phosphatase Staining

JIANG Zhaohui, MA Qianli, CHEN Jun, ZHANG Jie, YU Honglan

(ClinicalLaboratory,theFirstPeople'sHospitalofGuiyang,Guiyang550002,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore the possibility of EDTA-K2 anticoagulant peripheral blood as staining positive control of neutrophil alkaline phosphatase (NAP). Methods: Peripheral venous blood of EDTA anticoagulation with normal NAP score and peripheral venous blood of EDTA anticoagulation with significantly increased NAP integral were selected to make 200 blood pieces, respectively. They were divided into normal NAP score group and increased NAP integral group, and they were further divided into non fixed group and fixed group (fixed by 10% formaldehyde-methanol). Nap staining was performed every other week at 5 d in each of the 10 groups, with a total of 50 d staining for 10 times. NAP positive rates and score were compared between each group. Results: The activity of NAP decreased with time in blood pieces of each group. Peripheral venous blood with significantly increased NAP integral can be maintained for about 40 days. The activity of enzyme in the blood fixed by 10% formaldehyde-methanol decreased relatively slowly. Conclusion: Peripheral venous blood with significantly increased NAP integral after fixed by 10% formaldehyde-methanol can be selected to be staining positive control of NAP, and the effective period is about 40 days.

[Key words]alkaline phosphatase; neutrophil; staining and marking; bacteria infection; blood cell; quality control

*通信作者E-mail:123900828@qq.com

[中圖分類(lèi)號(hào)]R446.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)06-0718-03

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.022

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-06-16網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1729.054.html